Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Сравнение функций цитоскелета в клетках животных и растений 6
1.2. Клетки растений, используемые для изучения роли цитоскелета в транспорте и упорядоченной локализации органелл 8
1.2.1. Пыльцевые трубки 8
1.2.2. Культивируемые суспензионные клетки 9
1.2.3. Клетки листа 11
1.2.4. Клетки корня 12
1.3. Моторные белки растений 13
1.3.1. Кинезины и динеин 13
1.3.2. Миозины 14
1.4. Роль цитоскелета в упорядоченной локализации внутриклеточных органелл 16
1.5. Особенности организации аппарата Гольджи растений 16
1.6. Особенности организации ЭПР в клетках растений 20
1.7. Постановка цели исследования 21
Глава 2. Материал и методики 23
2.1. Объект исследования 23
2.2. Инкубация с колхицином 23
2.3. Инкубация с латрункулином 23
2.4. Иммуноцитохимическое и цитохимическое выявление элементов цитоскелета и клеточных органелл 23
2.4.1. Двойное окрашивание на микротрубочки и ЭПР 23
2.4.2. Двойное окрашивание на микротрубочки и аппарат Гольджи 24
2.4.3. Двойное окрашивание на актиновые филаменты и аппарат Гольджи 24
2.4.4. Двойное окрашивание на актиновые филаменты и ЭПР 24
2.5. Электронная микроскопия 25
Глава 3. Результаты 26
3.1. Роль микротрубочек в расположении аппарата Гольджи 26
3.1.1. Локализация аппарата Гольджи относительно микротрубочек в контрольных клетках 26
3.1.2. Локализация аппарата Гольджи после разрушения микротрубочек колхицином 27
3.1.3. Локализация аппарата Гольджи при ингибировании сборки микротрубочек 27
3.1.4. Ультраструктура аппарата Гольджи 29
3.2. Роль микротрубочек в расположении ЭПР 31
3.2.1. Локализация ЭПР относительно микротрубочек в контрольных клетках 31
3.2.2. Локализация ЭПР после разрушения микротрубочек 32
3.2.3. Локализация ЭПР при ингибировании сборки микротрубочек 33
3.2.4. Ультраструктура ЭПР 33
3.3. Роль актиновых филаментов в расположении аппарата Гольджи 34
3.3.1. Локализация аппарата Гольджи и актиновых филаментов в контрольных клетках 34
3.3.2. Локализация аппарата Гольджи после разрушения актиновых филаментов 36
3.3.3. Ультраструктура аппарата Гольджи 37
3.4. Роль актиновых филаментов в расположении ЭПР 38
3.4.1. Локализация ЭПР относительно актиновых филаментов в контрольных клетках 38
3.4.2. Локализация ЭПР после разрушения актиновых филаментов 38
3.4.3. Ультраструктура ЭПР 39
Глава 4. Обсуждение результатов 40
4.1. Сравнение объектов исследования и методических подходов 41
4.2. Цитоскелет и внутриклеточная организация 43
4.3. Сравнительный анализ полученных результатов 44
4.3.1. Микротрубочки: аппарат Гольджи и ЭПР 45
4.3.2. Актиновые филаменты: аппарат Гольджи и ЭПР 50
Заключение 54
Выводы 56
Список литературы 57
- Особенности организации аппарата Гольджи растений
- Ультраструктура аппарата Гольджи
- Микротрубочки: аппарат Гольджи и ЭПР
- Актиновые филаменты: аппарат Гольджи и ЭПР
Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитоплазма клеток эукариот представляет собой сложно организованную систему функционирующих комплексов, от взаимного расположения которых зависят многие внутиклеточные процессы, влияющие на рост, морфогенез и дифференцировку тканей многоклеточных организмов. Общеизвестно, что цитоплазма подразделяется на специализированные структурно-функциональные домены или компартменты (Cheung and Wu, 2007; van Zutphen and van der Klei, 2011), и расположение органелл в тех или иных компартментах зависит от функциональной нагрузки, характера роста клеток, стадий их дифференцировки и поступающих в клетку сигналов. Изменение этих параметров вызывает реорганизацию цитоплазмы, которая осуществляется путем перемещения органелл в ходе внутриклеточного транспорта, при участии элементов цитоскелета - микротрубочек и актиновых филаментов, и связанных с ними моторных белков (кинезинов, динеина и миозинов) (Vale, 2003). Транспорт сопровождается изменением расположения и перераспределением органелл, и ведет к перестройке структурно-функциональных компартментов/доменов. Однако, возникает вопрос, какие механизмы обеспечивают удерживание и заякоривание органелл в тех или иных доменах цитоплазмы. Изучение механизмов, которые обеспечивают и поддерживают упорядоченную локализацию органелл в цитоплазме, а также регулируют реорганизацию цитоплазматических компартментов/доменов в ответ на внутренние или внешние сигналы, в ходе роста и дифференцировки клеток является важной научной задачей.
Цитоскелет играет важную роль в процессах роста, развития и дифференцировки клеток, тканей и органов растений, но его структура и организация имеет ряд существенных отличий и особенностей. Так, например, в клетках высших растений отсутствуют промежуточные филаменты, микротрубочки формируют несколько систем, которые последовательно сменяют друг друга в ходе клеточного цикла, причем центросома и иные типы дискретных ЦОМТ отсутствуют (Smirnova and Bajer, 1992; Mineyuki, 2007). Система актиновых филаментов в клетках растений также меняется в ходе клеточного цикла, но, в отличие от микротрубочек, ее организация зависит от типа ткани и стадии дифференцировки клеток в составе ткани/органа (Blancaflor et al., 2006). Также как и в клетках животных, в клетках растений транспорт органелл осуществляется по фибриллам цитоскелета при участии моторных белков. Однако у растений перемещение органелл на длинные расстояния происходит по актиновым филаментам, в то время как роль микротрубочек состоит в обеспечении транспорта на короткие расстояния (Boevinek et al., 1998; VanGestel et al., 2002;
Kim et al., 2005). Еще одной особенностью клеток растений является то, что у них ярко выражена компартментализация цитоплазмы. Характерная локализация клеточных структур и проявление их функциональной активности лежит в основе процессов поляризованного роста клеток растений, одним из ярких примеров которой является растущая пыльцевая трубка представителей покрытосемянных растений. Таким образом, в растительных клетках идет постоянное чередование процессов перемещения, то есть изменения локализации, с необходимостью поддерживания упорядоченной организации цитоплазмы, которая необходима для обеспечения поляризованного роста и дифференцировки. Однако до сих пор нет ясности в вопросе о том, что происходит после доставки органелл «по адресу», каким образом органеллы удерживаются в том месте, где им «предназначено» находиться, участвует ли цитоскелет клеток растений в поддерживании упорядоченной локализации органелл в составе структурно-функциональных доменов. Исходя из этого, были сформулированы и поставлены следующие цели и задачи исследования.
Цель исследования. Изучить роль цитоскелета в упорядоченной локализации и распределении органелл клеток высших растений.
Задачи исследования. Используя в качестве объекта исследования клетки корешков проростков пшеницы Triticum aestivum L. :
Исследовать расположение и распределение аппарата Гольджи и ЭПР относительно системы микротрубочек и актиновых филаментов в клеточном цикле.
Проанализировать локализацию и распределение аппарата Гольджи и ЭПР после разрушения и при подавлении сборки микротрубочек колхицином.
Проанализировать локализацию и распределение аппарата Гольджи и ЭПР после разрушения актиновых филаментов латрункулином В.
Научная новизна. В работе детально проанализировано расположение компонентов синтетической (ЭПР) и секреторной (диктиосомы аппарата Гольджи) системы относительно микротрубочек и актиновых филаментов в находящихся на разных стадиях клеточного цикла клетках корешков проростков пшеницы Т. aestivum L. Были получены новые результаты, которые показывают, что микротрубочки обеспечивают разобщенное расположение диктиосом аппарата Гольджи в цитоплазме интерфазных клеток, и смещение диктиосом от из зоны веретена в митозе, а также поддерживают структурную целостность диктиосом. Кроме этого, микротрубочки влияют на характер распределения цистерн сети ЭПР из околоядерной зоны в периферическую цитоплазму интерфазных клеток, а также обеспечивают смещение ЭПР из зоны веретена во время митоза. Впервые было показано, что актиновые филаменты участвуют в транспорте секреторных везикул от аппарата Гольджи в разные домены цитоплазмы, поддерживают упорядоченную околоядерную локализацию
ЭПР во время интерфазы и доставку элементов ЭПР в область формирования фрагмопласта во время завершающих стадий митоза. В целом, в данной работе впервые было показано, что не только локалазация, но и распределение (диспергированное или компактное) диктиосом и ЭПР в составе цитоплазматических доменов зависит от элементов цитоскелета.
Теоретическая и практическая значимость. Данная работа была направлена на изучение клеточных механизмов, обеспечивающих и поддерживающих упорядоченную организацию цитоплазмы клеток высших растений, поэтому она имеет большое теоретическое значение. Полученные результаты расширяют представления о функциях цитоскелета как о динамичной системе полимеров, которая контролирует рост и морфогенез тканей растений, и быстро реагирует на изменение условий окружающей среды. Результаты работы вносят вклад в понимание процессов, связанных с реорганизацией цитоплазмы клеток в ответ на действие факторов, оказывающих влияние на цитоскелет. Практическая значимость результатов состоит в том, что они могут быть использованы при создании линий растений, устойчивых к дейтствию внешних фаткоров, при скринниге мутантных растений, в биотехнологии, агробиологии и фитопатологии.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009 и Ломоносов-2010, Москва; Asian Congress on Biotechnology, May 11-15, 2011, Shanghai, China; Chinese society for cell biology, July 2011, Beijing, China; BIT's 1st Annual World Congress of Molecular & Cell Biology, August 2011, Beijing, China; Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет», октябрь 2011, Санкт Петербург. Основные результаты работы были представлены на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 1 статья в рецензирумом журнале, рекомендованном ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 65 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Материал диссертации содержит 2 таблицы и 39 рисунков, из которых 35 находятся в приложении. В списке цитируемой литературы приведены 103 зарубежных источника.
Особенности организации аппарата Гольджи растений
В клетках животных аппарат Гольджи является компонентом, организация и локализация которого зависит от цитоскелета. Так, например, в клетках млекопитающих, аппарат Гольджи обычно занимает перинуклеарное положение, а его структурная целостность и расположение зависит от центросомы и микротрубочек (Cole and Lippincott-Schwartz, 1995; Chabin-Brion et al., 2001). В клетках высших растений организация и локализация аппарата Гольджи существенно отличается от клеток животных. Аппарат Гольджи представлен множеством отдельных стопок или диктиосом, каждая из которых функционирует независимо от других (рис. 2).
Аппарат Гольджи растений участвует в синтезе сложных полисахаридов клеточной стенки, гликолипидов плазматической мембраны, добавлении олигосахаридов к белкам, которые будут доставляться к клеточной стенке, плазмалемме или запасающим вакуолям. Число диктиосом в разных клетках варьирует, и отражает состояние и функциональную нагрузку клеток (Robinson, 2003; Neumann et al., 2003; Faso et al., 2009). Расположение аппарата Гольджи в клетках растений также зависит от их функциональной специализации (Matheson et al., 2006; Hawes, 2005; Hwang, 2008), и кроме этого, оно меняется в ходе клеточного цикла (Neberuhr et al., 2000; Segui-Simarro and Staehelin, 2003). Одной из отличительных особенностей аппарата Гольджи растений является то, что в отличие от млекопитающих, он сохраняет структуру и остается функционально активным во время всего клеточного цикла. Так, в конце митоза, везикулы отделяются от аппарата Гольджи. расположенного вокруг фрагмопласта, и направляются в сторону клеточного экватора по микротрубочкам, где сливаются с клеточной пластинкой, растущей в центре фрагмопласта. Поддержание функционатьной активности аппарата Гольджи во время митоза связано с необходимостью обеспечить секрецию полисахаридов, которые в большом количестве необходимы для формирования клеточной стенки во время цитокинеза (Faso et al., 2009).
Другими исключительными особенностями аппарата Гольджи растений являются: 1) Отсутствие у растений ERGIC компартмента (промежуточный отсек между ЭПР и аппаратом Гольджи). 2) Наличие хорошо выраженной системы цистерн и везикул, которые представляют собой особый компартмент - TGN (trans Golgi network). Это мембранный компартмент, который располагается в транс-части диктиосом и сортирует секреторные продукты в соответствии с местами их доставки. Транс-участок диктиосом растений переходит в TGN, который затем отделяется от Гольджи. После этого, движение диктиосом и свободного TGN не зависят друг от друга. В отличие от диктиосом, поведение TGN варьирует в разных типах клеток (Segui-Simarro and Staehelin, 2006; Kang, 2011). 3) Перемещение диктиосом аппарата Гольджи по актиновым филаментам, которые располагаются параллельно цистернам гранулярного ЭПР.
Многие годы наибольший интерес исследователей вызывали вопросы, связанные с тем, как при отсутствии ERGIC осуществляется взаимодействие ЭПР и диктиосом. В настоящее время есть три гипотезы, объясняющие транспорт везикул от ЭПР к аппарату Гольджи (рис. 3): 1) Модель пылесоса (vacuum cleaner model) (Boevink et al., 1998) -предполагается, что диктиосомы постоянно перемещаются вдоль ЭПР, собирая карго (везикулы). Согласно этой модели, вся поверхность ЭПР способна формировать ERES -Endoplasmic Reticulum Exit Sites, которые располагаются на ЭПР случайным образом. 2) Модель «stop and go». Диктиосомы останавливаются на расположенных строго определенным образом участках ЭПР (ERES), собирают везикулы (карго), и затем перемещается к другому такому же сайту (Robinson, 2003). 3) Модель подвижных сайтов экспорта (mobile export sites model). Диктиосомы формируют единую секреторную систему с СОРИ везикулами, отходящими от ERES, и движутся вместе как единая секреторная единица "secretory unit" (Brandizzi et al., 2002), что позволяет карго транспортироваться от ЭПР к аппарату Гольджи в любое время в ходе движения.
Последняя модель (3) в настоящее время поддерживается большинством исследователей. Экспериментальные данные показывают, что единые мобильные структуры, которые аппарат Гольджи образует с ERES, перемещаются по актиновым филаментам при участии миозинов (daSilva et al., 2004; Staehelin and Kang, 2008; Toyooka et al., 2009). Таким образом, каждая диктиосома является мобильной единицей, и движется вдоль ЭПР по актиновым филаментам, располагающимся рядом с цистернами ЭПР. Такие диктиосомы называют "stacks on tracks" или "mobile factories" (Boevink et al., 1998: Nebenfflhr ct al., 1999; Nebenfiihr and Staehelin, 2001; Neumann et al., 2003).
Несмотря на то, что перемещение диктиосом аппарата Гольджи происходит по актиновым филаментам и опосредовано миозином, есть основания полагать, что в транспорте диктиосом могут принимать участие и микротрубочки. Никак иначе нельзя объяснить тот факт, что с диктиосомами ассоциирован кинезин-13А (Lu et al., 2005; Wei et al., 2009). При этом сами диктиосомы также были ассоциированы не только с актиновыми филаментами, но и с микротрубочками, а мутации гена кинезин-13 приводили к агрегации диктиосом и появлению кластеров из диктиосом на микротрубочках (Lu et al., 2005). Эти данные косвенно подтверждаются и другими исследованиями, в которых показано, что есть корреляция между распределением и движением диктиосом и микротрубочками в местах активной секреции полисахаридов (Crowell et al., 2009; Toyooka et al., 2009; Karahaara et al., 2010). Возможно, что транспорт диктиосом по тому или иному цитоскелетному трэку зависит от клеточной или тканевой специализации. Так, например, движение аппарата Гольджи в клетках меристемы корня Arabidopsis thaliana медленнее, чем в клетках из зоны растяжения, и в клетках корня подвижность диктиосом намного медленнее, чем в клетках листа (Faso et al., 2009).
Важным фактором, который влияет на расположение аппарата Гольджи в растениях, является локализация ЭПР, с которым аппарат Гольджи тесно связан как функционально, так и через подлежащие актиновые филаменты.
Ультраструктура аппарата Гольджи
Мы анализировали случайные ультратонкие срезы тех же участков корешков, которые использовались для приготовления препаратов и последующего иммуноцитохимического окрашивания. Поскольку хорошо известно, что у растений на всех стадиях клеточного цикла аппарат Гольджи не отличается ни структурно, ни функционально, мы анализировали, в основном, интерфазные клетки. На случайных срезах клеток корешков контрольных растений, диктиосомы аппарата Гольджи имеют хорошо различимую морфологию (рис. 9 а-д). Они состоят, в среднем, из 6-8 уплощенных цистерн, Каждая диктиосома имеет отчетливую структурную полярность, в транс-части находится разное число везикул, которые являются составной частью TGN (Trans Golgi Network) компартмента диктиосом растений (Staehelin and Kang, 2008). Согласно данным литературы, цис и транс части диктиосом отличаются по толщине цистерн (в транс части цистерны более узкие) и плотности содержимого цистерн (в транс части содержимое люмена более электронно-плотное) (Donohue et al., 2007).
Основываясь на морфологических признаках, мы анализировали и сравнивали с контролем диктиосомы, которые присутствовали в клетках после действия колхицина: 1 час (рис. 9 е-к), 6 часов (рис. 10 а-д), 12 часов (рис. 10 е-к), 24 часа (рис. 11). Было обнаружено несколько типов диктиосом: 1) диктиосомы с такой же морфологией, как и в контрольных клетках (1 тип) (рис. 9 ж; 10 б, ж; 11 б); 2) диктиосомы, которые имеют изогнутые или волнистые цистерны (2 тип) (рис 9 з; 10 в, з; 11 в); 3) диктиосомы состоящие из фрагментированных или везикулярных цистерн, причем общее число цистерн редуцировано до 3-5 (3 тип) (рис. 9 и, к; 10 г, и; 11 д); 4) диктиосомы состоящие всего из 3-4 цистерн (4 тип) (рис. 10 д, к; 11 е). Все типы диктиосом, кроме 4 типа, были выявлены как после кратковременного (1 час) так и продолжительного (6-24 часа) действия колхицина. Причем, число везикул вокруг разных типов диктиосом варьирует, но они есть даже вокруг тех диктиосом, структура которых редуцирована (4 тип).
Как показано в таблице 1, морфология диктиосом прогрессивно изменяется по мере увеличения времени воздействия. Можно предположить, что изменение морфологии цистерн (2 тип) и/или фрагментация цистерн (3 тип) являются начальными стадиями дегенеративных изменений, которые могут приводить к уменьшению числа цистерн в диктиосоме (4 тип). Поэтому, диспергированный характер окрашивания аппапата Гольджи, который мы наблюдали при иммуноцитохимическом исследовании, можно объяснить как постепенным уменьшением размера диктиосом за счет редукции числа цистерн, так и перераспределением диктиосом из околоядерной области в периферическую цитоплазму. В то же время, диктиосомы аппарата Гольджи в кортексе агрегируют формируют разнообразные кластеры, возможно, путем сближения и группировки соседних диктиосом, или их слияния с последующим формированием более крупных диктиосом. Мы обнаружили в кортикальной цитоплазме гигантские диктиосомы, которые по длине в несколько раз превышают размеры диктиосом контрольных образцов (рис. 11 г). Измерение длины отдельных диктиосом на случайных срезах в контрольных клетках и после действия колхицина показало, что значительное увеличение протяженности диктиосом (примерно на 37%) происходит при длительном действии колхицина (таблица 2), когда на светооптическом уровне с помощью антител к белку-маркеру аппарата Гольджи выявляются длинные тубулярные образования в кортикальной цитоплазме.
Возможными механизмами образования этих структур являются нарушение разделения диктиосом в ходе биогенеза, или слияние диктиосом. И в том, и в другом случае, важную роль будут играть белки матрикса аппарата Гольджи, которым приписывается функция обеспечения структурной целостности диктиосом (Latijnhouwers et al., 2005). У растений были обнаружены те же семейства белков гольджинов и других белков матрикса (Latijnhouwers et al., 2005), но, как оказалось, в клетках растений многие из них выполняют функции, отличные от тех, которые они выполняют с клетках животных.
Микротрубочки: аппарат Гольджи и ЭПР
Наши исследования показали, что разрушение микротрубочек не вызывает значительных изменений расположения аппарата Гольджи в интерфазных клетках, но влияет на перераспределение и «удаление» аппарата Гольджи от хромосом в митотических клетках. Следовательно, можно полагать, что обеспечение и поддерживание удаленного от хромосом расположения диктиосом аппарата Гольджи во время митоза зависит от микротрубочек веретена. Ингибирование сборки микротрубочек в интерфазных клетках вызывает перераспределение диктиосом из околоядерной области в периферическую цитоплазму. Кроме этого, наблюдается, с одной стороны, формирование крупных скоплений и кластеров диктиосом в кортексе, и с другой стороны, более дисперсный характер окрашивания диктиосом в центральной цитоплазме. Последнее наблюдение, как указывают данные электронной микроскопии, связано с редукционными изменениями структуры диктиосом (уменьшение числа цистерн). Однако, наряду с этим, диктиосомы увеличивают свою протяженность. В К-метафазных клетках диктиосомы аппарата Гольджи агрегируют вокруг хромосом, что подтверждает роль митотического веретена в «удалении» аппарата Гольджи от хромосом на периферию веретена в ходе нормального митоза.
Наши исследования показали, что на определенных стадиях клеточного цикла распределение аппарата Гольджи в невакуолизированных клетках корешков пшеницы отличается от того, что регистрируется в используемых другими авторами клеточных системах, в частности, от клеток эпидермиса листа и суспензионных культур. Так, диктиосомы в интерфазных клетках корешков распределены по всей цитоплазме, но прослеживается их преимущественная аккумуляция в околоядерной зоне, а в делящихся клетках, обеспечение и поддерживание упорядоченной локализации диктиосом зависит от микротрубочек веретена. Эти данные отличаются от результатов, полученных на клетках суспензионных культур табака, у которых после разрушения митотического веретена, расположение аппарата Гольджи не менялось. Мы также не наблюдали формирование пояска из скопления диктиосом аппарата Гольджи в месте расположения ППК (Nebenftihr et al., 2000).
Однако, наши результаты о расположении аппарата Гольджи в телофазе и во время цитокинеза, совпадают с данными других авторов (Nebenfuhr et al., 2000; Segui-Simarro and Staehelin, 2006). Поэтому, определенные несоответствия между нашими результатами и данными других авторов нельзя объяснить тем, что были использованы разные методические подходы для выявления внутриклеточных структур (GFP-конструкции в работах других авторов, имму но цитохимическое окрашивание в нашей работе). Скорее всего, они связаны с различиями внутриклеточной организации выбранных объектов для исследования.
Одной их отличительных особенностей аппарата Гольджи растений является мобильность диктиосом, связанная с актиновыми филаментами. На основании этого было сделано заключение, что актиновые филаменты вносят вклад не только в перемещение, но и в распределение диктиосом в цитоплазме (Nebenfuhr et al., 1999). В то же время, с диктиосомами аппарата Гольджи связан кинезин 13А, и это косвенно указывает на то, что и микротрубочки могут принимать участие в перемещении и распределении диктиосом в цитоплазме (Ги et al., 2005; Wei et al., 2009). Более того, в растениях мутантных по кинезжу 13а наблюдается агрегация и формирование кластеров из диктиосом (Ги et al., 2005). Сопоставление этих данных с нашими результатами указывает на возможную роль кинезина и микротрубочек в поддерживании упорядоченного распределения и структурной целостности аппарата Гольджи у растений.
Изогнутые и везикулярные цистерны аппарата Гольджи, которые мы выявили при подавлении сборки микротрубочек колхицином, были описаны в растительных клетках, которые подвергались действию брефельдина A (Satiat-Jeunemaitre and Hawes, 1992). Этот агент останавливает секрецию и ведет к резорпции аппарата Гольджи в ЭПР и формированию расширенного гибридного компартмента ЭПР-Гольджи (Ritzenthaler et al, 2002). Аномальная морфология аппарата Гольджи в клетках, у которых отсутствуют микротрубочки, была обнаружена после действия динитроанилинового гербицида оризалина, который селективно разбирает растительные микротрубочки (Langhans et al., 2009). Авторы этого исследования делают предположение, что микротрубочки участвуют в поддержании структурной целостности аппарата Гольджи в клетках растений. Как известно, микротрубочки играют важную роль в организации лентовидной конфигурации аппарата Гольджи (Golgi ribbon) клеток млекопитающих, у которых отдельные диктиосомы связаны друг с другом латерально и формируют непрерывную сеть. Единая сеть «Golgi ribbon» располагается вблизи центросомы, которая выполняет функции ЦОМТ. Деполимеризация микротрубочек вызывает разрушение этой единой сети и диспергирование диктиосом в цитоплазме (Siitterlin and Colanzi, 2010). Аппарат Гольджи растений представлен диктиосомами, уже распределенными в цитоплазме, единой и общей системы не формируется. Однако, разрушение микротрубочек вызывает агрегацию диктиосом в кортексе и формирование расширенной мембранной системы, что в очередной раз подчеркивает отличия между аппаратом Гольджи и его взаимодействием с цитоскелетом между растительными и животными клетками. Однако, если в клетках животных микротрубочки поддерживают агрегированное состояние аппарата Гольджи в виде «Golgi ribbon", то в клетках растений они, судя по всему, обеспечивают диспергированное (разбросанное) расположение диктиосом, и вносят вклад в поддерживание их структурной целостности и функциональной независимости.
Что касается ЭПР, то полученные нами результаты показывают, что разрушение микротрубочек в интерфазных клетках не вызывает значительных изменений в расположении ЭПР. Разрушение митотического веретена ведет к появлению неупорядоченных скоплений ЭПР вокруг хромосом, причем такие скопления могут располагаться как около хромосом, так и на некотором расстоянии от них. Однако, ингибирование сборки микротрубочек в интерфазных клетках вызывает гипертрофические изменения сети ЭПР в околоядерной области, и такая гипертрофированная сеть распространяется в периферическую цитоплазму. Электронно-микроскопические данные указывают на то, что цистерны ЭПР в таких клетках укладываются компактными стопками, что, вероятно, на светооптическом уровне выглядит как увеличенные и раздутые отсеки, выявляемые антителами в ЭПР. В К-митотических клетках скопления ЭПР располагаются в цитоплазме вокруг хромосом, причем во многих клетках скопления ЭПР с хромосомами не контактируют.
Согласно данным литературы, в вакуолизированных клетках растений ЭПР образует три типа структур, которые переходят друг в друга (Griffmg, 2010). Первый тип, это ЭПР, расположенный в кортикальной цитоплазме. Он формирует полигональные структуры сходные с теми, которые есть в клетках животных. Этот тип ЭПР медленно перемещается в цитоплазме, и его движение определяют актиновые филаменты, которые лежат параллельно ЭПР (Ueda et al., 2010). Однако, последние данные говорят о том, что ЭПР не столько перемещается, сколько перемоделируется, и именно процесс перемоделирования контролируется акто-миозиновой системой (Sparkes et al., 2009а). Второй тип организации ЭПР - это трубочки, которые вытягиваются из кортикального ЭПР в цитоплазму и располагаются между вакуолями. Этот ЭПР динамичен, быстро перемещается с током цитоплазмы, и, очевидно, представлен в сильно вакуолизированных клетках. И, наконец, третий тип организации - это ЭПР, окружающий ядерную оболочку и являющийся ее продолжением. В клетках с небольшим число вакуолей, расположение ЭПР в цитоплазме отличается большей однородностью, но последний тип организации -околоядерное скопление ЭПР, встречается повсеместно, но с разной степенью выраженности (Sparkes et al., 2009b; Griffing, 2010).
Как и все клеточные органеллы, система ЭПР подвергается реорганизации и перераспределению в ходе клеточного цикла. Большинство исследователей считают, что в интерфазе локализация ЭПР зависит от актиновых филаментов, а реорганизация и перераспределение ЭПР во время митоза поддерживается микротрубочками. Так, ЭПР аккумулируется внутри митотического веретена и фрагмопласта, а для формирования фрагмопласта требуются ЭПР и везикулы аппарата Гольджи, которые перемещаются по микротрубочкам в зону клеточного экватора. Интересно, что разрушение микротрубочек вызывало коллапс ЭПР к хромосомам и ингибировало скопление ЭПР в зоне фрагмопласта (Gupton et al, 2006). Однако, эта работа была сделана на клетках суспензионной культуры табака, у которых вся цитоплазма представлена тонким слоем кортикальной цитоплазмы, околоядерной цитоплазмы и трансвакуолярными тяжами. Наши результаты, полученные на невакуолизиоованных клетках корешков, показывают, что при разрушении микротрубочек и/или ингибировании их сборки, в очень многих клетках ЭПР не коллапсирует к хромосомам, а располагается на некотором расстоянии от них. Несоответствия между данными, представленными в литературе, и нашими результатами, могут быть связаны с особенностями геометрии и внутриклеточной архитектуры разных типов клеток, в том числе и с пространственными ограничениями внутри вакуолизированных клеток. Однако, возможны и другие объяснения. Так, например, известно, что клетки вступают в митоз и при отсутствии микротрубочек, у них проходит профаза и прометафаза, то есть, наступает момент, когда разрушается ядерная оболочка. Но при отсутствии микротрубочек веретена, хромосомы не перемещаются, то есть, не проходят стадию конгресии, и не выстраиваются в метафазную пластинку. Околоядерный ЭПР является продолжением ядерной оболочки, поэтому при отсутствии микротрубочек, распавшаяся ядерная оболочка и связанный с ней ЭПР окружает хромосомы или, вернее, зону, которую занимало ядро до распада ядерной оболочки. Кроме этого, у растений во время прометафазы происходит дополнительная компактизация хромосом, и тогда отдаление хромосом от остатков ядерной оболочки и ЭПР будет еще более явным. Однако, в этом случае, непонятно, почему аппарат Гольджи коллапсирует к хромосомам, а не располагается дистанционно.
Актиновые филаменты: аппарат Гольджи и ЭПР
Согласно данным литературы, разрушение актиновых филаментов не влияет на прохождение растительных клеток по клеточному циклу, и не меняет структуру и организацию системы микротрубочек (Blancaflor et al., 2006). В наших экспериментах мы использовали микротрубочки как систему, относительно которой можно прослеживать изменения локализации органелл после разрушения актиновых филаментов. Анализ взаимного расположения микротрубочек и актиновых филаментов в клетках растений проводился многими исследователями, в том числе и на клетках корешков пшеницы (McCurdy and Gunning, 1990), поэтому в нашей работе мы ориентировались на данные, полученные этими авторами.
После разрушения актиновых филаментов в интерфазных клетках прослеживается некоторая тенденция к агрегации аппарата Гольджи в кортикальной цитоплазме, но она незначительна по сравнению с тем, что наблюдается при отсутствии микротрубояек. В некоторых клетках мы наблюдали колокализацию диктиосом с кортикальными микротрубочками, что не было замечено в контрольных клетках, однако, это были единичные наблюдения, из которых пока рано делать какие-либо выводы. Вместе с тем, в контрольных клетках на стадии интерфазы, диктиосомы колокализуются с пучками актиновых филаментов. Следовательно, можно предположить, что изменение равномерного распределения диктиосом в кортексе и формирование скоплений диктиосом связано с отсутствием актиновых филаментов. Значительных изменений в локализации аппарата Гольджи митотических клеток не выявлено.
В отличие от аппарата Гольджи, локализация ЭПР после разрушения актиновых филаментов, меняется более значительно. Так, в интерфазных клетках ЭПР равномерно распределяется в цитоплазме и, в отличие от контрольных клеток, не образует более плотную сеть в околоядерной зоне. В G2 фазе ЭПР также не формирует околоядерные скопления, хотя рыхлые агрегаты ЭПР располагаются неупорядоченным образом в околоядерной цитоплазме, и даже в кортексе. В анафазе и телофазе, картина распределения ЭПР также отличается от контроля, а именно - не наблюдается выраженного скопления ЭПР в интерзоне. В контрольных клетках ЭПР дифференцированно колокализуется с фрагмопластом, в состав которого входят как микротрубочки, так и актиновые филаменты. Однако, при разрушении актиновых филаментов, ЭПР в зоне фрагмопласта (от которого остались только микротрубочки) распределен равномерно и диффузно. Еще одним отличием является то, что не наблюдается околоядерной агрегации ЭПР при переходе из телофазы в G1 фазу.
Следовательно, отсутствие актиновых филаментов почти не влияет на расположение аппарата Гольджи относительно интактной системы микротрубочек. Однако, расположение и состояние ЭПР при отсутствии актиновых филаментов меняется, как в интерфазных клетках, так и на определенных стадиях митоза (поздняя анафаза-телофаза-цитокинез), хотя сам митоз протекает нормально. Таким образом, расположение ЭПР в большей степени зависит от актиновых филаментов, чем расположение аппарата Гольджи.
Несмотря на то, что локализация аппарата Гольджи после разрушения актиновых филаментов меняется мало, данные электронной микроскопии говорят о том, что состояние секреторного аппарата клеток подвергается сильным изменениям. Это выражается в увеличении числа и размеров везикул, ассоциированных с TGN компартментом диктиосом. Гипертрофиия TGN компармента и ассоциированных с ним везикул может говорить как о более активном белковом синтезе и секреции, так и о нарушении транспорта везикул, содержащих продукты секреции, от аппарата Гольджи. Второе предположение является более обоснованным, так как актиновые филаменты были разрушены латрунку лином В. Как следует из схемы, представленной в обзоре Matheson et al (2006), секреторные продукты поступают из TGN компартмента в литические вакуоли (LV), белковые запасающие вакуоли (PSV) и хлоропласты (рис. 39). Доставка в митохондрии и пероксисомы также возможна, но пока изучена недостаточно хорошо.
В активно делящихся клетках растений синтез и секреция не прекращается даже во время митоза, и активность ЭПР и аппарата Гольджи необходима для цитокинеза, который у растений рассматривается как специализированный вариант секреции (Hawes, 2005). Для исследований, мы использовали делящиеся клетки из зоны меристемы и клетки из зоны роста/растяжения, у которых происходит активная секреция компонентов клеточной стенки. У делящихся клеток формируется новая клеточная стенка во время цитокинеза, а у клеток из зоны роста, наряду с продолжающимися делениями, идет активный рост клеток в продольном направлении. Следовательно, направление, в котором должны перемещаться везикулы - это плазмалемма, а не литические или запасающие вакуоли. Поэтому можно ожидать, что продолжительное действие латрункулина В будет вызывать нарушение роста и развития тканей корешков, а затем и морфогенетического развития проростков.
Разрушение актиновых филаментов влияет не только на расположение ЭПР, но и на его состояние в клетке, а именно, на характер укладывания цистерн относительно друг друга. С одной стороны, это объясняется тем, что ЭПР располагается вдоль пучков актиновых филаментов. Как показано в ряде работ, актиновые филаменты служат как треки для перемещения мобильных сайтов ЭПР, ассоциированных с диктиосомами (подробнее см. Обзор литературы). Поэтому можно было бы предположить, что диктиосомы в большей степени прореагируют на отсутствие треков. Однако, наши результаты свидетельствуют о том, что разрушение актиновых филаментов почти не меняет расположения диктиосом (хотя и нарушается отхождение секреторных везикул), но меняется расположение и укладка ЭПР. Следовательно, актиновые филаменты служат не только для транспортных целей, но и каким-то образом участвуют или поддерживают упорядоченное расположение (в том или ином домене) и распределение (внутри того или иного домена) ЭПР в цитоплазме. Согласно рисунку из обзора Matheson et al (2006), ЭПР непосредственно связан и является продолжением ядерной оболочки (рис. 39). Наши результаты показывают, что при отсутствии актиновых филаментов ЭПР утрачивает околоядерную локализацию. Почему это происходит? Возможно, это связано с тем, что в клетках корешков пучки актина располагаются в субкортикальной и околоядерной цитоплазме, что и обеспечивает удерживание связанного с ними ЭПР в этом домене цитоплазмы.
Следует отметить, что Gupton et al (2006) не отмечают изменений в организации ЭПР после разрушения актиновых филаментов латрункулином, ни в интерфазных, ни в митотически делящихся клетках, хотя клеточная пластинка, разделяющая дочерние клетки во время цитокинеза, в их экспериментах развивалась неправильно. Однако, как уже не раз упоминалось, в этих исследованиях использовались сильно вакуолизированные клетки, у которых весь клеточный объем занят вакуолями, а цитоплазме ограничена околоядерным и кортикальным листками и трансвакуолярными тяжами. Тем не менее, в связи с этими данными, интересно рассмотреть роль актина в формировании и функционировании фрагмопласта. Согласно данным литературы, для формирования фрагмопласта требуются ЭПР и везикулы аппарата Гольджи, которые перемещаются по микротрубочкам в зону клеточного экватора (Nebenfuhr et al., 1999). Наши результаты показывают, что при разрушении актина не происходит аккумуляции ЭПР в интерзоне, где будет формироваться фрагмопласт, однако, нарушений цитокинеза мы не заметили. Наши данные согласуются в результатами других исследований, где показано, что актиновые филаменты не участвуют в формировании и функционировании фрагмопласта (Mole Bajer et al., 1988; Mole-Bajer and Bajer, 1988). Однако, это не снимает вопроса о том, какую функцию они все-таки выполняют, будучи составной частью цитокинетического аппарата растений.
