Введение к работе
Актуальность работы. Культура клеток высших растений, являясь источником получения экологически чистых продуктов метаболизма растений, в то же время - удобный объект для изучения фундаментальных вопросов биологии. В искусственно созданных и контролируемых условиях системы In vitro возможно подробное исследование процессов вторичного метаболизма растительных клеток.
В настоящее время изучение этих вопросов не сводится только к установлению закономерностей синтеза и накопления вторичных соединений, продуцируемых клеткой in vitro. Исследователей все более интересуют вопросы внутриклеточной локализации биосинтеза этих соединений, его регуляция. Разработка методов внутриклеточной идентификации вторичных соединений в культивируемых клетках также необходима для скрининга получаемых новых клонов и штаммов по их продуктивности. Это весьма актуально, поскольку поиск новых линий клеток-сверхпродуцентов обычно сложен методически и требует большого количества времени и материала для анализа.
Объектом нашего исследования явились исходно полученный и му-тантные штаммы культуры клеток диоскореи дельтовидной Dloscorea deltoldea Wall. Клетки этого растения при выращивании в системе in vitro накапливают большое количество стероидных гликозидов. Их количество варьирует в зависимости от выбора штамма и фазы его роста от 1 до 12 % на сухую массу. Секреции гликозидов в культуральную среду не происходит.
Таким образом, культура клеток диоскореи является интересной модельной системой для изучения внутриклеточной локализации вторичных метаболитов.
Цель работы. Разработка методов внутриклеточной идентификации стероидных гликозидов и исследование внутриклеточной локализации этих соединений в исходном и трех мутантных штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной.
Задачи исследования
-
Изучение физиологических характеристик роста и особенностей ультраструктурного строения клеток исходного и трех мутантных штаммов суспензионной культуры Dloscorea deltoldea .
-
Разработка методов выявления стероидных гликозидов в на-тивной и фиксированной ткани.
-
Определение внутриклеточной локализации стероидных глико-
- 4 -зидов с применением:
световой, электронной микроскопии и гистохимии.
прямого определения стероидных гликозидов в различны> структурах (клетках, протопластах, вакуолях).
-
Сопоставление результатов по определению внутриклеточно? локализации этих соединений, полученных с применением разных методов.
-
Разработка метода скрининга линий клеток-продуцентов культуры D.deltoidea на основе проведенных исследований.
Научная новизна работы. Разработан комплекс методов определения внутриклеточной локализации стероидных гликозидов в биомассе культивируемых клеток диоскореи дельтовидной штаммов с разнык уровнем продуктивности. Изучены особенности ультрастуктурной организации клеток исследованных штаммов. Установлена корреляция мєжді уровнем продуктивности этих штаммов и особенностями их ультраструктурной организации.
Показана корреляция между отложением электронноплотных соединений в различных клеточных компартментах и накоплением в биомассе стероидных гликозидов. Обнаружена связь активности флуоресценцт клеточных стенок и вакуолей в ультрафиолетовом свете с продуктивностью клеток.
Обнаружена гетерогенность популяции клеток по их продуктивносте в пределах каждого штамма. Выделены и охарактеризованы интактные вакуоли: показана их гетерогенность по величине, плотности и значению рН их содержимого.
Определена локализация стероидных гликозидов как в свободнок пространстве клетки, так и в вакуолях. Обнаружена фракция слабе связанных гликозидов в межклетниках культивируемых клеток.
Практическое значение работы. Разработан метод оценки продуктивности клеточных линий культуры диоскореи дельтовидной in vitrc по активности флуоресценции в проходящем ультрафиолетовом свете. Разработан метод фиксации материала, позволяющий сохранить в фиксированной ткани спирто- и водорастворимые стероидные гликозиды.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены нг XIV конференции по электронной микроскопии (биология и медицина). Черноголовка, 1992 г.. на II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алматы. 199; г. На семинаре Гумбольдт-Университета 1994г.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков и 2 таблицы. Список литературы включает 252 наименования.
