Введение к работе
Актуальность темы. Клеточные культуры высших растений in vitro обладают рядом особенностей и спектром уникальных признаков (Бутенко 1986. Tatlcek et all.. 1991. Носов 1994 ). Специфика этих искусственно созданных клеточных популяций заключается в том. что они обладают рядом свойств, характерных и для исходного организма. Таким образом возникает вопрос - в какой мере на популяционные характеристики влияют эти частные свойства, которыми обладают составляющие популяцию клетки, а также степень необходимости в них для всей популяции в целом. Одно из этих свойств - способность к синтезу вторичных соединений, свойственных как растению в целом, так и клеткам растений in vitro. Однако вопрос о роли и степени необходимости вторичного метаболизма для суспензионных клеточных культур до настоящего времени остается открытым (Носов 1994).
Понимание причин активности вторичного метаболизма клеточных популяций in vitro будет способствовать дальнейшему развитию технологий получения различных вторичных соединений на основе биосинтетического потенциала растительных клеток in vitro. Особое внимание в этом случае уделяют стабильности и прогнозируемости процесса вторичного обмена в клеточных культурах растений (Dougall 1985, Shuler and Hallsby 1985. Бутенко 1986).
Наиболее эффективным подходом к решению изложенных проблем является исследование клеточных культур в режиме проточного культивирования. Направленное изменение гетерогенности популяции при проточном культивировании и ее реакции на эти условия можно изучить по совокупности интегральных популяционных характеристик. В качестве одного из популяционных признаков можно использовать содержание вторичных соединений. При этом наиболее целесообразно сопоставить при эквивалентных экспериментальных условиях реакции двух разных штаммов-продуцентов, различающихся по физиологическим признакам, но синтезирующих одни и теже вторичные соединения. Это даст возможность более полного анализа закономерностей, протекающих в растительных клеточных популяциях in vitro.
Цель настоящей работы - исследовать взаимосвязь синтеза вторичных соединений штаммами культуры клеток Dioscorea deltoidea с изменчивостью интегральных популяционных характеристик при чередовании периодического и проточного культивирования.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать систему проточного культивирования растительных клеток с целью изучения закономерностей вторичного метаболизма
- 4 -и изменчивости интегральных характеристик клеточных популяций.
-
Оценить стабильность цитофизиологических характеристик клеточных популяции (рост, синтез фуростаноловых гликозидов. мито-тическая активность, плоидность и жизнеспособность) при проточном культивировании и охарактеризовать возможные связи между ними.
-
Сопоставить выявленные закономерности вторичного метаболизма и диапазон изменчивости интегральных популяционных характеристик двух штаммов Dioscorea deltoidea при культивировании.
-
Проанализировать на основе экспериментальных данных роль вторичного метаболизма' в клеточных популяциях обоих штаммов Dioscorea deltoidea. а также оценить возможность прогноза и управления биосинтетической активностью этих популяций.
-
На основе полученных экспериментальных данных разработать алгоритм оптимального режима культивирования растительных штаммов-продуцентов вторичных соединений.
Научная новизна. Установлены закономерности изменения содержания фуростаноловых гликозидов при комбинации проточного и периодического режимов культивирования. Впервые показана активизация синтеза фуростаноловых гликозидов для изучаемых клеточных популяций при проточном культивировании. Установлены условия, характер и различия этой интенсификации для штаммов ИФР-Д-1 и ИФР-ДИ-0.5. Как существенный и воспроизводимый факт установлено, что при приближении содержания фуростаноловых гликозидов к экстремальному значению (максимуму) при проточном культивировании, наблюдается быстрое снижение жизнеспособности популяций обоих изученных штаммов Dioscorea deltoidea. Активизация вторичного метаболизма сопряжена с подавлением митотической активности обоих штаммов, уровень которой при проточном культивировании достигал максимально возможных значений, детерминированных длительностью митотического цикла каждого штамма. Установлено значительное преобразование уровня плоид-ности штаммов при проточном культивировании.
Практическая ценность. Предложен алгоритм культивирования высокопродуктивного штамма ДМ-0.5. оптимальный для синтеза фуростаноловых гликозидов. Разработана схема культивирования (комбинация периодического и проточного культивирования), которая дает возможность оценить диапазон, продуктивность и стабильность синтеза вторичных соединений штаммов-продуцентов. Получена воспроизводимая Физиологическая реакция клеточных популяций Dioscorea deltoidea, выраженная в закономерных изменениях активности вторичного метабо-
- 5 -лизма при проточном культивировании с высокими скоростями разбавления. Последнее не только значительно расширяет экспериментальные возможности в дальнейших исследованиях (известный ответ популяции), но и дает возможность прогноза и управления биосинтетической активностью клеточных популяций.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на: VII Международной конференции по культуре клеток и биотехнологии. Алма-Ата. (Казахстан), 1993; Института женьшеня и табака. Тайд-жон.(Южная Корея) 1994; расширенном семинаре Естественно-Математического факультета Гумбольд Университета. Берлин (Германия). 1994; ежегодных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР и отчетах кафедры Физиологии растений Биологического факультета МГУ.
Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 2 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на
... страницах машинописного текста, содержит ... рисунков и 2 таб
лицы и состоит из введения, обзора литературы, методической части,
результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой
литературы ( наименований).
