Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1. Эндосимбионты - прокариоты, адаптированные к жизни внутри клеток хозяина 10
1.1. Особенности морфологии бактериальной клетки 11
1.2. Рост и способы размножения бактерий 15
1.3. Покоящиеся формы бактерий 17
2. Wolbachia - внутриклеточные симбионты Arthropods и Nemathods 22
2.1. Филогения Wolbachia и структурно-функциональные особенности их генома 23
2.2. Структурная организация Wolbachia 28
2.3. Репродуктивные модификации, вызываемые Wolbachia в организме хозяина 29
Цитоплазматическая несоаместшюстъ 29
Партеногенез 32
Феминизация и «гибель самцов» , 32
3. Дрозофила- удобный объект для изучения распределения структуры и функции симбиотических бактерий Wolbachia в клетках хозяина 33
3.1. Ранний эмбриогенез и этапы синцитиальиого развития эмбрионов дрозофилы 34
3.2. Оогенез у дрозофилы 34
3.3. Особенности поведения Wolbachia в раннем эмбриогенезе у дрозофилы. Распределение Wolbachia на разных стадиях клеточного цикла 35
3.4. Влияние Wolbachia на развитие дрозофилы 35
4. Возможная функциональная роль эндосимбионтов 36
4.1. Внутриклеточный симбиоз про- и эукариот, как модель для изучения возможного происхождения эукариотических органелл 38
Глава II. Материалы и методы 41
2.1. Характеристика использованных в работе лабораторных линий дрозофилы.. 41
2.2. Получение ранних эмбрионов дрозофилы 41
2.3. Фиксация эмбрионов для флуоресцентно-микроскопических исследований 41
2.4. Фиксация и заливка эмбрионов дрозофилы для ультраструктурного анализа 42
2.5. Фиксация и заливка яичников для электронной микроскопии 43
2.6. Получение, окрашивание и исследование полутонких и ультратонких срезов 44
2.7. Выделение геномной ДНК 44
2.8. Условия полимеразной цепной реакции 45
2.9. Электрофорез ДНК в агарозных гелях 45
2.10. Выделение ДНК из агарозных гелей 46
2.1 К Клонирование фрагментов ДНК в плазмиду pBluescript, определение последовательности фрагментов ДНК ..46
2.12. Определение выживаемости линий дрозофилы 46
2.12.1. Тест на выявление уровня цитоплазматической несовместимости (ЦН), 47
2.13. Морфометрический анализ относительного количества бактериальных форм в цитоплазме ранних эмбрионов дрозофилы 47
Глава III. Результаты 49
3.1. Динамика Wolbachia в ранних эмбрионах дрозофилы 49
3.1.1. Распределение эндосимбионтов на разных стадиях раннего эмбриогенеза и в процессе клеточного цикла в эмбрионах видов D. simutans (U)
и D. melanogaster (Canton SI и Curly) по данным световой микроскопии 49
3.2. Электронно-микроскопический анализ структурной организации
и распределения симбиотических бактерий в ранних эмбрионах дрозофилы 51
3.3. Необычная форма бактериоподобных организмов (второй тип симбионтов), выявленных в эмбрионах и ооцитах дрозофилы 52
3.4. Сравнительный морфометрический анализ количества бактерий в ранних эмбрионах различных линий дрозофилы 54
3.4.1. Анализ численности бактерий на разных стадиях раннего развития эмбрионов разных линий дрозофилы 55
3.5. Ультраструктурная организация и распределение Wolbachia в оогенезе дрозофилы 56
3.6. Определение видовой принадлежности симбиотических бактерий, выявленных в ооцитах и ранних эмбрионах дрозофилы 57
3.7. Степень устойчивости симбиотических бактерий, присутствующих в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофилы, к антибиотикам 58
3.8. Жизнеспособность инфицированных бактериями эмбрионов. Уровень цитоплазматической несовместимости при скрещивании линий дрозофилы, зараженных разными типами эндосимбиотических бактерий 59
3.9. Новые свойства симбиотических бактерий и их взаимодействие с внутриклеточными компартментами клеток яичника и эмбрионов дрозофилы 61
Глава IV. Обсуждение 64
4.1. Возможные причины специфического распределения симбиотических бактерий в цитоплазме эмбрионов дрозофилы 64
4.2. Функциональная роль наружной мембраны симбиотических бактерий и сходство структурной организации симбиотических бактерий в различных линиях дрозофилы 66
4.2.1. Нетипичная бактериальная форма эндосимбионтов и возможные пути ее появления в клетках дрозофилы 67
4.3. Взаимодействие бактериальных форм и цитоплазматических компартментов хозяина, как основа функциональных взаимодействий симбионт/хозяин 69
4.4. Адаптационные изменения симбиотических бактерий в процессе их жизнедеятельности внутри клеток хозяина 72
Заключение 75
Список литературы 77
Приложение 90
- Филогения Wolbachia и структурно-функциональные особенности их генома
- Морфометрический анализ относительного количества бактериальных форм в цитоплазме ранних эмбрионов дрозофилы
- Степень устойчивости симбиотических бактерий, присутствующих в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофилы, к антибиотикам
- Взаимодействие бактериальных форм и цитоплазматических компартментов хозяина, как основа функциональных взаимодействий симбионт/хозяин
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние десятилетия существенное внимание уделяется анализу функциональной роли симбиотических бактерий эукариотических клеток. Благодаря исследованию механизмов симбиоза были открыты возможности переноса генетического материала в клетки высших растений, что позволило получить модифицированные сорта с новыми свойствами. На основе знаний об особенностях взаимодействия симбионта и хозяина становится возможным построение биоинженерных моделей для изучения внутриклеточных процессов. Среди симбиотических бактерий особое место занимает внутриклеточный симбионт насекомых и нематод бактерии рода WolbacMa {кл. Риккетсия), который был открыт в 1936 году. Исследования последних лет показали, что эти бактерии широко распространены среди насекомых (до 20% видов) (Werren, 1997; McGraw, O'Neill, 1999). На сегодняшний день уже полностью расшифрованы и частично описаны геномы некоторых штаммов Wolbachia (Riegler et aL, 2005). Генетические исследования показали, что данные бактерии способны изменять репродуктивные функции хозяина, вызывая такие патологии, как цитоплаз мати чес кая несовместимость, партеногенез и феминизация (O'Neill, Кагг, 1990; Stouthamer et at., 1993; Stouthamer, et aL, 1999; Hurst, Jiggins, 2000; ZchorbFein, et aL, 2001). Исследования особенностей поведения и функций Wolbachia являются, в настоящее время очень актуальными, поскольку изучение механизмов симбиоза позволит исследователям в будущем посредством бактерий влиять на популяции хозяина, среди которых встречаются как вредители сельского хозяйства, так и патогенные для животных и человека организмы (Hoffmann et al„ 1986). Так, например, было показано, что элиминация Wolbachia из организма нематод приводит к потере этими организмами патогенных свойств (Hoerauf et aL, 1999; Dedeine et aL, 2001). Таким образом, влияя на симбиотические бактерии Wolbachia, можно найти способы защиты людей и животных от болезней, вызываемых организмами хозяев (Bordenstein, Werren, 2000; Dedeine et aL, 2001; Kennedy, 2002).
Одним из наиболее удобных объектов для изучения взаимодействия Wolbachia — хозяин являются дрозофилы, поскольку благодаря генетическим и цитологическим
6
исследованиям о биологии этих насекомых накоплено огромное количество данных.
Поэтому изучение разнообразия симбиотических бактерий в клетках и эмбрионах
дрозофилы может обеспечить получение новых данных (Литвинова, І977; Foe,
Alberts, 19S3). Цитологические исследования взаимодействия бактерий и
эукариотических клеток позволят также дополнить исследования о механизмах
симбиоза. Багодаря использованию такой высокоразрешающей техники, как
просвечивающий электронный микроскоп, в сочетании с молекулярно-
биологическими методами открывается возможность определить особенности
распределения симбиотических бактерий в клетках хозяина и оценить структурные
изменения в клетках симбионта и хозяина. Ультраструктурньге исследования
<0 взаимодействий симбионт-хозяин, позволят также получить сведения, которые,
возможно, прольют свет на симбиотическую теорию происхождения эукариотических органелл (Dyall etal., 2004).
В связи с выше изложенным, целью данной работы являлось исследование локализации и структурной организации симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофилы.
В работе были поставлены следующие задачи:
f. 1. Изучить распределение бактерий на разных стадиях раннего
эмбриогенезаугрех видов (шести линий) дрозофил.
Выявить особенности структурной организации симбионтов в цитоплазме эмбрионов и клеток яичникаутрех видов (шести линий) дрозофил.
Изучить влияние антибиотиков на выживаемость симбионтов в клетках разных линий дрозофил.
Определить влияние бактерий на выживаемость эмбрионов шести линий дрозофил. Оценить уровень цитоплазматической несовместимости при скрещиваниях разных линий дрозофил, зараженных симбионтами.
Исследовать возможные структурно-функциональные взаимодействия между симбионтами и внутриклеточными компартментами ранних
(л эмбрионов и клеток яичника дрозофилы.
Научная новизна и практическая ценность работы
В работе проведен сравнительных анализ структурной организации бактерий
Wolbachia штаммов wMel, wRi, которые были идентифицированы в лабораторных
линиях Drosophila simulans (U), D. melanogaster (Canton SI и Curly). С помощью
флуоресцентной и электронной микроскопии исследованы особенности
распределения симбиотических бактерий в эмбрионах и клетках яичника дрозофил.
При изучении шести лабораторных линий дрозофил впервые выявлена и
морфологически описана форма симбиотических бактерий, имеющая структуру не
свойственную какому-либо типу бактерий, присутствующих в клетках дрозофилы.
Установлено, что необычная бактериальная форма устойчива к действию
UK антибиотика тетрациклина и не оказывает влияние на репродуктивные функции
хозяина. На ультраструктурном уровне продемонстрировали структурно-функциональные взаимодействия симбионта с внутриклеточными компартментами дрозофилы, что создает основу для будущих детальных исследований механизмов взаимного влияния симбионта и хозяина в подобных системах симбиоза.
Апробация работы
'!
Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Съезд ВОГИС, Москва, Россия, 2004; Третья международная конференция, посвященная биологии Wolbachia (the Third Wolbachia Conference) Бризбан, Австралия, 2004; Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Беларусь, Минск, 2004.
Результаты работы были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в феврале 2002г. и феврале 2005г.
Список публикаций но теме диссертации
Дудкина Н.В., Воронин Д.А., Киселева Е.В. Структурная организация и распределение симбиотических бактерий Wolbachia в ранних эмбрионах и яичников Drosophila melanogaster и D, simulans. Цитология (2004), Т. 46, JVb 3, С. 208-220.
Воронин Д.А., Дудкина Н.В., Киселева Е.В. Новая форма симбиотических бактерий Wolbachia, обнаруженная внутри эндоплазматического ретикулума
ранних эмбрионов Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук (2004), Т. 396, №4, С. 564-567.
Воронин Д.А., Шарипов Р.Н., Захаров И.К., Киселёва Е.В. Исследование ультраструктуры и распределения симбиотических бактерий в эмбрионах Drosophila. Съезд ВОГИС, Россия, Москва, 5-12 июня 2004. Т. 1 С. 422.
Denis A. Voronin, Ruslan Sharipov, Elena Kiseleva, A new form of Wolbachia obtained in early Drosophila embryo. The 3rd International Wolbachia Conference, Australia, Heron Isl., 21-26 august 2004.
Воронин Д.А., Киселева Е.В. Молекулярно-генетический и электронномикроскопический анализ локализации эндосимбиотических бактерий в эмбрионах дрозофилы. Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Беларусь, Минск, 24-26 ноября 2004. С. 325.
Список используемых сокращений
АТФ - аденозин трифосфорная кислота
ЖГ - желточная гранула
мтДНК - митохондриальная ДНК
п.н. — пар нуклеотидов
ПМ — плазматическая мембрана
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ЦН - цитоплазматическая несовместимость
ЭМ — электронная микроскопия
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
Филогения Wolbachia и структурно-функциональные особенности их генома
Данные о различии в строении клеток микроорганизмов, входящих в группу Protista, начали накапливаться с конца XIX в. Это повлекло за собой деление группы на высшие и низшие протесты. Деление на высшие и низшие протисты происходило в соответствии с двумя выявленными типами клеточной организации — эукариотной и прокариотной. Высшие протисты имеют эукариотическое строение клеток, т. е. являются эукариотами, низшие — прокариотами. Обоснование того, что прокариотический и эукариотический типы клеточной организации являются наиболее существенной границей, разделяющей все клеточные формы жизни, связано с работами Стейнера (R. Stanier, 1916—1982) и Ван Ниля, относящимися к 1960-м годам. Изучение тонкой структуры клеток выявило существенные различия в строении клеток прокариот (бактерий и цианобактерий) и эукариот (макро- и микроорганизмы). Тем не менее, классификация прокариотических микроорганизмов только по морфологическим признакам является не достаточно информативной. В связи с этим, для определения видовой принадлежности того или иного класса прокариот проводят сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК (Emelyanov, 2001). Помимо этого, для установления степени родства между прокариотическими организмами используют методические подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке сходные функции, например, белки домашнего хозяйства (ферредоксины, цитохромы, поверхностные пептиды и др,) или рРНК (Emelyanov, 2001; Martinez et al., 2004; Gil et al., 2004; Ochman et al., 2005).
Известно, что в рибосомах прокариот и эукариот присутствуют 3 типа рРНК, различающихся по молекулярной массе и коэффициенту седиментации. Поскольку информационная емкость крупных молекул большая и их трудно анализировать, чаще всего для анализа выбирают молекулы рРНК средней величины: 16S (у прокариот) и 18S (у эукариот), состоящих из 1600 и 2500 нуклеотидов, соответственно. К настоящему времени последовательности генов 16S и 18S рРНК изучены более чем у 400 организмов, принадлежащих к разным царствам живой природы (Martinez et al., 2004; Bonicontro, Risuleo, 2005). Первые исследования, посвященные анализу последовательностей гена 16S рРНК Wolbachia pipientis из тканей комара Culex pipiens, показали, что W. pipientis принадлежит к группе а-протобактерий (O Neill et al., 1992). Эта группа бактерий содержит большинство пурпурных несерных фотосинтетических бактерий и многих нефотосинтетических эндосимбионтов эукариотических клеток, а также сюда включены митохондрии. Ближайшими родственникомн W. pipientis являются Anaplasma marginale, Ehrlichia risticii и Rickettsia spp. - все эти бактерии являются патогенными для млекопитающих и симбионтами насекомых (Emelyanov, 2001). Первые филогенетические исследования Wolbachia pipientis показали, что данные симбионты входят в состав подкласса Rickettsiales. Субкласс Rickettsials объединяет бактерии, характеризующиеся в большинстве случаев совокупностью следующих признаков: плеоморфные, неподвижные, грамотрицательные, с типичными для эубактерий клеточными стенками, размножающиеся делением внутри клеток-хозяев. Эти бактерии можно культивировать на специальных средах, содержащих живые или переживающие ткани, такие как куриные эмбрионы или культуры клеток позвоночных или беспозвоночных. Однако, перечисленные выше признаки свойственны не всем представителям этого субкласса (Andersson et al., 1996). Среди риккетсий имеются подвижные виды, красящиеся положительно по Граму, а также виды, которые можно выращивать на относительно простых искусственных питательных средах. Различны и взаимоотношения между риккетсиями и организмом хозяина. Помимо паразитизма, эти отношения в некоторых случаях можно определить даже как мутуалистические. Среди риккетсий-паразитов большая часть относится к непатогенньгм бактериям и только меньшая их часть вызывает заболевания человека, позвоночных и беспозвоночных животных (так называемые риккетсиозы). Все исследованные риккетсии обладают высокой активностью энергетических и биосинтетических процессов. У них выявлена система цитохромов и показано, что бактерии способны запасать энергию, освобождающуюся в процессе дыхания, в виде ЛТФ. Риккетсии могут также осуществлять некоторые биосинтетические процессы, например, биосинтез белка и липидов (Haferkamp et aL, 2004).
В отличие от Риккетсии, Woibachia не являются патогенными микроорганизмами для млекопитающих, а функционируют только в организме членистоногих. Геном Woibachia сильно редуцирован и имеет размер от 0,9 до 1,3 миллионов пар оснований (у штамма wMel - 1 267 782 пар оснований), что характерно для эндосимбиотических облигатных паразитов (Riegler et aL, 2005). Изучение структуры генома у Woibachia показало, что у бактерий наблюдается упрощение генома - уменьшение количества генов, а также присутсвие большого количества не кодирующих последовательностей, что очень специфично для симбиотических бактерий. Установлено, что некодирующих последовательности ДНК, выявленные в геноме Woibachia, представлены мобильными элементами (профаги) и повторами (Masui et aL, 2000; Riegler et aL, 2005). Интересно отметить, что наличие тех или иных позторов в геноме Woibachia может служить их систематическим признаком (Riegler et aL, 2005). Более детальный анализ генома показал, что эти бактерии утратили большое количество генов, участвующих в синтезе клеточной стенки, а также в энергетической и секреторной системах. По этим признакам считается, что Woibachia дивергировала от основного древа риккетсии достаточно давно (около 100 млн. лет назад) (Bordenstein, Werren, 1998&&&&).
Как упоминалось выше, для определения филогенетических отношений между видами риккетсии широко используются методы сравнительного анализа последовательностей гена 16S рРНК, благодаря которым удалось определить видовую принадлежность бактерий (рис. 1.4) (Werren, 1997; Popov et aL, 1998). Однако для выявления различий между типами бактерий внутри вида Woibachia сравнительные исследования последовательностей данного гена не являются достаточно информативными, поскольку различия, выявленные между всеми известными штамами Wolbachia, составляют всего 2-3% (Werren, 1997).
Морфометрический анализ относительного количества бактериальных форм в цитоплазме ранних эмбрионов дрозофилы
В настоящее время теория симбиотического происхождения эукариотической клетки нашла широкое распространение, хотя часть ученых выступают против нее (см., обзор Cavalier-Smith, 2002). Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что митохондрии, вероятно, произошли от симбиотических аэробных эубактерий (альфа-протеобактерий), а пластиды - от симбиотических фотосинтезируюших эубактерий (цианобактерий) (Dyall et al., 2000). Разногласия остаются в вопросах происхождения цитоплазмы и ядра эукариотической клетки. Большинство специалистов склоняется к тому, что клетка-хозяин развилась от археобактерий (Margulis, Berraudes, 1985; Cavalier-Smith, 2002). В пользу этого свидетельствует большое сходство в структуре генома (в частности, его экзон-интронная организация) у археобактерий и эукариот, идентичность механизмов репликации и репарации ДНК, а также транскрипции и трансляции и другие молекулярные данные (Slesarev et ah, 1998; Cavalier-Smith, 2002). Предполагается, что при образовании симбиотического организма сформировался химерный (археобактериальный - эубактериальный) геном, в котором многие метаболитические системы оказались продублированными (Cavalier-Smith, 2002). Избыточные элементы впоследствии редуцировались или поменяли свои функции (Martin, Schnarrenberger, 1997). В частности, из двух механизмов формирования мембран (у археобактерий основу мембран составляют эфиры изопреноидов, у эубактерий - эфиры жирных кислот) был "выбран" и сохранился только один механизм - эубактериальный. Согласно другой гипотезе, образование ядерной мембраны могло стать побочным результатом экспрессии эубактериальных генов, ответственных за синтез мембран, в археобактериальном генетическом окружении (Cavalier-Smith, 2002). Существует также много других гипотез, вплоть до весьма экстравагантных, как, например, предположение о формировании клеточного ядра у археобактерий в результате вирусной инфекции (Takemura, 2001).
Согласно симбиотической теории, выдвигаемой Маргелисом (Маргелис, 1983), пластиды произошли от самостоятельно существовавших много лет назад фотосинтезируюших бактерий, а митохондрии приобрели способность к эффективному кислородному дыханию ещё тогда, когда они были свободноживущими бактериями. Митохондрии давно известны как органеллы, содержащие собственную ДНК и систему белкового синтеза про кар иотичес кого типа (Карпов, 2001). В то же время показано, что некоторые пурпурные бактерии из семейства а-протобактерий имеют складчатую поверхностную мембрану, которая напоминает кристы митохондрий. Поскольку бактериальные симбионты широко распространены в разных группах современных протистов и обнаруживаются во многих компартментах клетки: в цитоплазме, ядре (Vyshnyakov et ai, 2001), - то предполагаемая картина протобактерии, располагающейся в симбнонтофорной вакуоле клетки-хозяина, очень напоминает митохондрию. Эти факты в совокупности с филогенетическими данными, полученными в результате анализа последовательностей генов 16S рРНК, позволили многим исследователям с большой долей вероятности считать, что свободноживущие фотосинтезирующие бактерии, став симбионтами эукариотической клетки, утратили способность к фотосинтезу и стали выполнять функцию аэробного дыхания в клетке, превратившись, таким образом, в митохондрии. Недавно было показано, что в клетках микроспоридия Trachipleistophora hominis, являющегося внутриклеточным паразитом многих эукариот, встречаются структуры, напоминающие остатки митохондрий (Williams et ai, 2002). Кроме того, в ядре этого простейшего были найдены гены, кодирующие белок теплового шока Hsp70, которые типичны для митохондрий, что позволяет предположить, что митохондрии или симбионты были вторично утеряны. Этот факт может служить доказательством того, что эукариоты могут сохранять митохондриальные органеллы и их гены, даже когда функции аэробного дыхания у них уже утеряны.
Предполагается, что пластиды тоже могли произойти от симбиотических бактерий (Карпов, 2001), например от цианобактерии, которые довольно часто заселяют цитоплазму эукариотических клеток. Эти бактерии обеспечивают фиксацию углерода и азота, а также участвуют в метаболизме клетки-хозяина. В пользу этой гипотезы свидетельствуют морфологическое сходство пластид с бактериями, типично эубактериальное расположение генов в геноме хлоропластов и сходство молекулярной филогении пластид и сине-зелёных водорослей. Предполагается, что, как и в случае с митохондриями, в клетках хозяина могла происходить дальнейшая утрата пластид. Так, например, полный цикл приобретения и дальнейшей утраты пластид, по-видимому, имел место у криптофитовых. Среди них существуют первично бесцветные формы (Goniomonas), фототрофные организмы с хлоропластами [Cryptomonas) и вторично бесцветные формы (Chilomoiias), которые содержат в перинуклеарном пространстве лейкопласт, не способный к фотосинтезу.
Следует, однако, отметить, что геномы современных митохондрий и пластид очень сильно различаются и обладают рядом необычных особенностей, не позволяющих проследить пути эволюции этих органелл (Карпов, 2001). Вследствие этого симбиотическая теория происхождения митохондрий и хлоропластов ставится под сомнение некоторыми исследователями, которые не исключают аутогенного происхождения органелл эукаритической клетки. Одним из подходов к решению этой проблемы может являться изучение особенностей развития и путей проникновения эндос им биотических бактерий в клетку хозяина, а также механизмов адаптации к изменённым условиям их существования.
Степень устойчивости симбиотических бактерий, присутствующих в цитоплазме эмбрионов и ооцитов дрозофилы, к антибиотикам
Флуоресцентная окраска эмбрионов дрозофилы с использованием красителя Hoechst показала, что в линиях D. simulans (TJ) и D. melanogaster (Canton S1 и Curly) расположение флуоресцентной метки в местах локализации бактерий совпадает с распределением делящихся ядер по эмбриону (рис. 3.1). Характерной особенностью раннего эмбриогенеза дрозофилы (стадия пребластодермы) является то, что деление ядер синхронно и не сопровождается формированием клеточных стенок, в результате чего образуется многоядерный синцитий. Весь процесс до клеточного развития занимает около 3,5 часов с момента оплодотворения. Ранний эмбриогенез условно разделяют на 14 стадий (рис. 1.6): 1-9 стадии (около 80 минут): ядра располагаются в центре эмбриона их количество экспоненциально растет от I до 256, 10-13 стадии (около 2 часов): делящиеся ядра (около 85%) мигрируют на переферию и образуют на переферии монослои. В центре остаются полиплоидные желточные ядра. Количество ядер на 13 стадии достигает 6000. На 9-10 стадиях синцитиального развития на одном из полюсов эмбриона происходит обособление группы ядер, которые в дальнейшем образуют полярные клетки, дифференцирующиеся впоследствии в половые органы взрослой особи. 14 стадия: ядра локализованы на периферии эмбриона. Вокруг ядер формируются клеточные стенки. Сформировавшийся клеточный монослой сразу же вовлекается в процессы гаструляції и (Foe, Alberts, 1983).
В наших экспериментах мы использовали ранние эмбрионы трех линий дрозофилы. В линиях D. simulans (U) и D. melanogaster (Canton SI и Curly) была зарегистрирована существенная окраска ДНК в цитоплазме, в то время как в остальных исследованных линиях не удалось четко выявить окраску на ДНК в цитоплазме за исключением ядер. Мы предположили, что причинами невозможности выявления ДНК бактерий и трудности с определением их локализации могут быть либо малая плотность бактерий, либо их полное отсутствие в линиях . simulans (R), D. melanogaster (Canton S2). D. virilis (Rus). Ответ на этот вопрос был получен при электронно-микроскопических исследованиях (см. следующий раздел).
На световом уровне было установлено, что локализация и распределение флуоресцентной метки в цитоплазме эмбрионов идентичны в линиях D. melanogaster (Canton S1 и Curly) и D. simulans (U) (рис. 3.1, 3.2).
Изучение распределения бактерий па разных стадиях раннего эмбриогенеза мух линий D, melanogaster (Canton SI и Curly), D. simulans (U) показало, что до 9-й стадии развития симбионты и ядра располагаются преимущественно в центре эмбриона (рис. 3.1а). В то же время до 9 стадии эмбриогенеза дрозофилы, бактерии дополнительно присутствовали и на периферии эмбриона, вблизи поверхности пито плазматической мембраны (рис. 3.16, в). Далее делящиеся ядра мигрировали на периферию эмбриона вместе с бактериями, локализованными вблизи ядер (рис. 3.1 г). На поздней стадии эмбриогенеза (14 стадия) было сложно определить локализацию бактерий из-за большого количества ядер, которые давали интенсивную окраску по Hoechst. По этой причине для изучения распределения бактерий на данной стадии (формирования клеточных перегородок) раннего эмбриогенеза, был использован сравнительный электронно-микроскопический анализ распределения бактерий (см. следующую главу).
Исследование распределения бактерий на разных стадиях митоза в эмбрионах как D. melanogaster (Canton SI и Curly), так и D. simulans (U) показало, что в интерфазе бактерии локализуются диффузно вблизи ядер, образуя небольшие скопления (рис. 3.2а-в). В профазе митоза в ядрах эмбрионов начинается компактизация хроматина, что позволяет идентифицировать данную стадию, используя флуоресцентную микроскопию. Бактерии на этой стадии образуют крупные кластеры, располагающиеся диаметрально противоположно вокруг ядер и лишь отдельные бактерии наблюдаются в других участках вблизи ядер (рис. 3.2г, д). На стадии метафазы, хромосомы выстраиваются в метафазную пластинку, что четко выявляется на светом уровне при окрашивании красителем Hoechst. На данной стадии кластеры бактерии локализуются преимущественно вблизи полюсов деления, образуя «шапочки» вблизи центриолей (рис. 3.2е, ж). На стадиях анафазы и ранней телофазы происходит расхождение хромосом к полюсам деления ядер, при этом бактерии сохраняют локализацию у полюсов веретена деления вблизи центриолей (рис. 3.2з, и). На стадии ранней и поздней интерфазы бактерии вновь локализуются диффузно вокруг ядер. Полученные результаты совпадают с ранее опубликованными данными о распределении Wolbachia (wMel) вокруг делящихся ядер у D. melanogaster (Oregon R) (Callaini et al, 1992). Следует отметить, что количество ДНК-лозитивных кластеров было выше в цитоплазме ранних эмбрионов линии D. si ти Urns (U) по сравнению с эмбрионами других линий (Рис. 3.2).
Поскольку не удалось выявить ДНК-позитивный материал, помимо ядер хозяина, в цитоплазме эмбрионов D. simulans (R), D, melanogaster (Canton S2) и D. virilis (Rus), то для более точного исследования присутствия бактерий, а также для детального изучения морфологии симбиотических бактерий, выявленных на световом уровне был проведен электронно-микроскопический анализ эмбрионов всех изученных линий.
aПри электронно-микроскопическом исследовании эмбрионов линий D. simulans (U) и D. melanogaster (Canton SI, Curly) было установлено, что на стадии синцитиальной бластодермы в цитоплазме эмбрионов содержаться бактерии морфологически идентичные описанным ранее бактериям p. Wolbachia, которые имеют сферическую (коккондтльную) (диаметр 1 цм) или палочковидную (размером -0,25 х 1,5рм) форму (рис. З.За-г).
Бактерии окружены, как правило, тремя мембранами, в состав которых входят две собственных мембранных оболочки, а также дополнительная наружная мембрана. В бактериальном матриксе выявляют большое количество рибосом, а также расправленные нити ДНК и компактный хроматин (рис. З.За-г). Следует отметить, что на всех стадиях раннего развития (2-14 стадии) эмбрионов в исследованных линиях присутствовали делящиеся формы бактерий Wolbachia (рис. 3.4а-в). Деление бактерий, выявленных в цитоплазме эмбрионов линий D. simulans (U) и D. melanogaster (Canton SI, Curly), было определено как равновеликое бинарное деление, то есть путем формирования центрально расположенной перетяжки (рис. 3.46). Установлено, что бактерии часто встречаются группами и могут формировать кластеры по 3-8 бактерий в цитоплазме эмбрионов D. simulans (U) и D. mekmogaster (Canton SI, Curly) (рис. 3,5а-в).
Взаимодействие бактериальных форм и цитоплазматических компартментов хозяина, как основа функциональных взаимодействий симбионт/хозяин
О функциональной активности симбиотических бактерий и их успешной адаптации к существованию внутри организма хозяина свидетельствуют обычно следующие морфологические данные: деление, секреция и активное взаимодействие бактерий с различными компартментами клеток хозяина. Результаты наших исследований показали, что типичные Wolbachia проявляют все перечисленные признаки, поскольку они активно делятся и выделяют секреторные пузырьки в цитоплазму дрозофилы. Электронно-микроскопические исследования бактериальной формы второго типа свидетельствует об их сниженной активности по сравнению с активностью бактерий первого типа.
Одним из наиболее актуальных является вопрос о том, каким образом секретируют симбионты в клетку хозяина и какова природа этого секрета. Согласно генетическим, цитологическим и биохимическим данным многие симбионты эукариотических клеток способны к четырем типам секреции (Lory, 1998). Гомологичные гены, ответственные за формирование системы секреции четвертого типа, были обнаружены недавно у симбиотических бактерий Wolbachia. Показано, что при этом симбионты формируют на поверхности своей мембраны специфические белковые комплексы, обеспечивающие вывод секрета в пространство между бактериальной оболочкой и наружной мембраной, окружающую бактерию (Masui et al., 2000). [V тип секреции, который определяет вирулентность патогенных бактерий, был выявлен также для Agrobacteriwn tutnefaciensf Bonlctella pertussis, Helicobacter pylori. Brucella suis, Legionella pneumophila и Rickettsia prowazekii (Kondo et al., 1994; Kim et al., 1994; Masui et al., 2000). Для некоторых бактерий это путь переноса не только вирулентных факторов в цитоплазму эукарнотической клетки, но и генетического материала, который может затем интегрироваться как в геном организмов того же рода, так и в геном хозяина (Ptlli). Можно предположить, что зарегистрированное нами формирование бактериями первого типа вакуолео-подобных структур связано с подобным типом секреции, однако вопрос о составе секрета и его возможном влиянии на функции клеток хозяина требует дополнительных исследований.
Полученные нами данные о том, что Wolbachia тесно контактируют с мембранами шероховатого ЭПР в эмбрионах и, особенно, в клетках яичника дрозофилы в период вителлогене?а. согласуются с наблюдениями других авторов (Popov et aL, 1998) и могут служить дополнительным свидетельством активных взаимодействий симбионта и хозяина. Не исключено, что симбионты могут влиять на данный процесс. В литературе высказывалось предположение о том, что митохондрии эукариотических клеток произошли от бактерий представителей класса Риккетсии. к которым относится род Wolbachia. Известно, что митохондрии могут образовывать с ЭПР комплексы в клетках печени крыс и мышей, клетках мозга у крыс {rat liver (17), mouse liver (18), rat brain}, а также в клетках низших эукариот -дрожжей. Подобные комплексы поззоляют митохондриям получать липиды, которые они не способны синтезировать, и ферменты, синтезирующие фосфолипиды, такие как семейство фосфотилнлеермнеинтетаз. При этом катионы кальция, способные инициировать синтез энергетических молекул АТФ, могут поступать в митохондрию из цистерн ЭПР. Перенос катионов кальции требует очень близкого расположения структур, поскольку СаЬЬ является вторичным посредником передачи сигнала в цитоплазме клетки и в свободной форме может запускать ряд клеточных процессов (ССС), Поскольку з данной работе выявлен плотный контакт Wolhachia с ЭПР, то можно предположить, что эти симбионты либо оказывают влияние на синтез, имеющий место в этом клеточном компартменте, либо использовать продукты этого синтеза для своей жизнедеятельности.
Согласно электронно-микроскопическим исследованиям, наружная мембрана как 1-го (аналогичная плазматической мембране), так и 2-го типа (аналогичная шероховатому ЭПР) бактериальных форм, обнаруженных в цитоплазме эмбрионов дрозофилы может тесно контактировать с наружной мембраной митохондрий, что дает основание предполагать существование возможной функциональной связи между ними. В пользу этого свидетельствуют недавно опубликованные данные о том, что Wolbachia может оказывать влияние на мтДНК, вызывая повышенную частоту вариаций в некоторых зараженных видах огненных муравьев (Shoemaker et al., 2003). Согласно недавно полученным данным было выдвинуто предположение о том, что бактерии участвуют в формировании гаплотипов митохондрий у D. simulans (James, Ballard, 2003). В то же время, несмотря на различие мнтохондриальной ДНК, которые выявлены между инфицированными и не инфицированными субпопуляциямн одной линии дрозофилы, механизм влплнгя Wolbachia на этот процесс пока до конца не ясен (Shoemaker etui., 2003).
Влияние Wolbachia на репродуктивные функции хозяина широко представлено в ряде публикаций (O Neill, Karr, 1990; Stouthamer et al., 1993; Stouthamer, et at. 1999; Hurst, Jiggins, 2000). На сегодняшний день показано, что цитоплазматическая несовместимость, регистрируемая при скрещивании самцов, зараженных Wolhachia. с незаряженными самками, сопровождается гибелью потомства на ранних стадиях эмбриогенеза. Нами показано, что штамм wMel, который был найден в линиях D. melanogaster вызывает высокую несовместимость при подобных скрещиваниях (Табл. 3.1). Существует ряд гипотез, объясняющих питоплазматическую несовместимость тем, что бактерии влиягот на процессы компактизации-декомпактизации хроматина отцовских и материнских хромосом. Это сопровождается с асинхронностью поведения генетического материала в течение первых делений зиготы, что, вероятно, приводит к потере хромосом одного из родителей и, как следствие, к гибели потомства у дрозофил. При скрещивании самцов с самками, зараженными тем же штаммом бактерий, ЦН не наблюдается, Вероятно, при этом бактерии способны нивилировать воздействие симбионтов на ядро спермин (O Neill et «/., 1992; McGraw et at, 2001; Crespigny, Wedell, 2005). В наших экспериментах не бьшо возможным определить, вызывает ли бактериальная форма второго типа цитоплазматическую несовместимость, поскольку мы не обнаружили такую линию дрозофил, которая не содержала симбиотических брктерігй. Тем не менее наши исследования показали, что бактерии второго типа не влияют на уровень ЦН. которая была вызвана типичными Wolbachla (штамм wMel). Известно. что изменение нуклеотидной последовательности п гене поверхностного белка бактерий (wsp) может влиять на уровень проявления цитоплазмати чес кой несовместимости при скрещивании мух (Braig ct al., 1998). Можно пред пол ожить, что существенные изменения морфологии клеточной оболочки н, вероятно, ее состава у бактерий второго типа не вызывают проявление ЦН.
