Регуляция Ca2+ токов L-типа L-аргинином через активацию 2-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах Ненов Мирослав Николаевич

Введение к работе

Актуальность проблемы.

L-аргинин - условно незаменимая аминокислота, которой наука и медицина в последние десятилетия уделяет большое внимание. Исследования по действию L-аргинина на сердечнососудистую систему показывают, что данная аминокислота может использоваться в качестве профилактики и при лечении сердечнососудистых заболеваний - стенокардии, гипертензии, коронарной болезни, гипертрофии миокарда, сердечной недостаточности и т.д. (Appleton J., 2002; Gornik H.L. and Creager M.A., 2004). Большинство эффектов L-аргинина связаны с модуляцией активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада. Отклонения от нормы в синтезе N0 и нарушения в запускаемом им NO-cGMP каскаде могут приводить к развитию вышеперечисленных заболеваний. Часто, эти процессы сопровождаются нарушением в работе Са ⁺-транспортирующих систем, регулируемых NO-cGMP сигнальным каскадом. Так известно, что NO-cGMP каскад принимает участие в модуляции активности Са²⁺ каналов L-типа, которые играют важную роль в формировании потенциала действия, электромеханическом сопряжении, регуляции частоты и силы сердечных сокращений. Нарушения в работе NO-cGMP каскада и Са²⁺ каналов L-типа отмечается у спонтанно-гипертензивных крыс (Shorofsky S.R. et. al., 1999). Также значительные нарушения в функционировании Са²⁺ каналов L-типа отмечаются у животных с нокаутами по генам NO-синтаз (Wang Н. et. al., 2008). Поэтому при исследовании функционирования NO-cGMP каскада в сердечнососудистой системе, для целости картины, нужно пытаться учитывать как модуляцию синтеза NO, так и регуляцию им Са²⁺ транспорта.

Однако, исследования о влиянии NO-cGMP каскада на активность Са²⁺ каналов L-типа носят противоречивый характер: доноры оксида азота и активаторы протеинкиназы G либо не оказывают эффект на Са²⁺ токи, либо ингибируют их, либо активируют. Столь противоречивые результаты связывают как с прямым нитрозшшрованием Са²⁺-канала L-типа, так и с регуляцией его фосфорилирования cGMP-зависимыми фосфодиэстеразами II и III типа и протеинкиназой G (Gallo М.Р. et al., 1998; Imai Y. et al., 2001; Mery P.F. et al, 1991; Hartzell H.C. and Fischmeister R., 1986; Fishmeister R. and Hartzell H.C., 1987; Suraii K. and Sperelakis N., 1995; Tohse N. and Sperelakis N., 1991). Противоречивые результаты наблюдались и при исследовании животных с нокаутами по генам NO-синтаз. Расхождения в результатах также объяснялись особенностями регуляции Са²⁺ каналов в синусе, предсердиях, желудочках или в разных видах животных. Одной из причин различных результатов также может быть отсутствие L-аргинина (субстрата NO-синтаз) в экспериментальных средах. Так показано, что добавление этой аминокислоты в экспериментальный раствор улучшает брадикинин-вызванную продукцию NO и подавление изопротеренол-активированных Са²⁺ токов L-типа интерликином-1 (Rozanski G.J. and Witt R.C., 1994; Flam B.R. at. al., 2001).

Следует учесть, что на сегодняшний день также не до конца понятна регуляция активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада экзогенным L-аргинином. Положительные эффекты L-аргинина, оказываемые им при лечении

ряда заболеваний и, связанные с регуляцией активности NO-синтаз, вызывают большой интерес в научном сообществе. В организме уже содержится достаточное количество L-аригинина для поддержания нормальной активности NO-синтаз. Так содержание L-аргинина в плазме крови достигает 400мкМ, а эндотелиальные клетки могут накапливать его до 2 мМ, при этом Km всех форм NO-синтаз для L-аргинина варьирует в пределах 2-Ю мкМ. Тем не менее, экзогенно-добавленный L-аргинин способен модулировать активность N0-синтазы, этот феномен называется «аргининовый парадокс». Ситуация осложняется тем, что на сегодняшний день существует несколько гипотез о природе «аргининового парадокса»: недоступность внутриклеточного пула L-аргинина и близкое расположение NO-синтазы и переносчика L-аргинина (McDonald К.К. et. al. 1997; Li С. et. al., 2005); конкуренция NOS и аргиназы за субстрат (Li Н. et. al., 2001; Zhang С. et. al., 2001; Chicoine L.G. et. al., 2004); повышенное содержание конкурентного ингибитора - ассиметричного диметиларгинина (Boger R.H. 2004); действие L-аргинина через аг-адренорецепторы, модулирующие активность NOS (Joshi M.S. et al., 2007). Последняя гипотеза основана на том, что L-аргинин содержит гуанидиновую группу, поэтому существует вероятность взаимодействия L-аргинина или его декарбоксилированного производного - агматина с рецепторами, имеющими сродство к гуанидинам. Гипотеза рецепторного действия L-аргинина является последней по времени и интересна тем, что, в отличие от предыдущих, не связана с субстратным действием L-аргинина. Настоящая работа является логическим продолжением работ, проводящихся в нашей группе. В данной работе уделяется особое внимание как регуляции Са²⁺ тока L-типа, так и NO-cGMP каскада L-аргинином в контексте «аргининового парадокса».

Цели и задачи исследования.

Основная цель работы - изучение возможности действия L-аргинина через агадренорецепторы на активность NO-cGMP каскада и на амплитуду Са ⁺ токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах в норме и патологии. Задачи:

1. Подобрать условия в которых эффект L-аргинина на амплитуду Са²⁺ тока L-типа будет максимальным. Оценить, связан ли эффект, оказываемый L-аргинином на Са ⁺ ток, с NO-cGMP сигнальным каскадом.

2. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» т.е. влияние L-аргинина на активность NO-cGMP каскада и амплитуду Са²⁺ тока L-типа через его воздействие на а₂-адренорецепторы.

3. Исследовать действие агматина, на амплитуду Са²⁺ тока L-типа.

4. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» и активность NO-cGMP каскада в изолированных кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс.

Научная новизна работы и полученные результаты.

Впервые нами показано, что «аргининовый парадокс» наблюдается в изолированных кардиомиоцитах крыс линии SD (Spraque Dowlay). Добавка 5мМ L-аргинина на фоне постоянно присутствующем в окружающей среде 1мМ L-аргинина, приводит к увеличению скорости синтеза N0 при стимуляции сокращений и подавлению амплитуды Са²⁺ тока L-типа. Действие 5 мМ L-аргинина, связано с а₂-адренорецепторами и РІЗК-Akt каскадом. Так, агонист а₂-адренорецепторов гуанабенц ацетат, также как и L-аргинин, вызывал увеличение продукции N0 и подавлял амплитуду Са²⁺ токов L-типа. Подавление L-аргинином амплитуды Са⁺ токов резко уменьшалось в присутствии антагонистов а₂-адренорецепторов иохимбина и раувольсцина. В присутствии вортманнина - ингибитора фосфоинозитол-3 киназы и гуанабец ацетат и L-аргинин подавляли амплитуду Са²⁺ тока в значительно меньшей степени. Ингибитор Akt 1/2 киназы также снимал эффект L-аргинина в отношении Са ⁺ тока. Действие гуанабенц ацетата и L-аргинина на амплитуду Са ⁺ токов L-типа было значительно ниже в присутствии ингибиторов N0-синтазы - 7NI и ингибитора cGMP-зависимой протеинкиназы — КТ5823.

Агматин, как L-аргинин, подавлял амплитуду Са²⁺ тока. Однако, в отличие от L-аргинина, действие агматина на Са²⁺ ток не изменялось в присутствии иохимбина и 7NI.

В кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс «аргининовый парадокс» отсутствует, реактивность а₂-адренорецепторов снижена, NO-cGMP каскад имеет низкую активность: L-аргинин, 8BrcGMP, SNP оказывают незначительное влияние на амплитуду Са²⁺ тока L-типа. Кривая доза-зависимого действия гуанабенц ацетата на Са²⁺ ток смещена вправо относительно кривой для крыс Spraque Dawlay. Ни L-аргинин, ни гуанабенц ацетат не оказывают влияние на скорость продукции оксида азота. Не исключено, что обнаруженное нами снижение реактивности а^-адренорецепторов и низкая активность NO-cGMP каскада в кардиомиоцитах SHR имеет отношение к развитию гипертрофии миокарда у крыс этой линии.

Научно-практическая ценность.

Полученные результаты вносят вклад в изучение «аргининового парадокса» и расширяют знания о механизмах регуляции активности NO-cGMP каскада и Са ⁺ тока L-типа в кардиомиоцитах нормотензивных и спонтанно-гипертензивных животных. Кроме того, полученные данные позволяют в значительной степени облегчить исследования механизмов регуляции N0-cGMP сигнального каскада и Са²⁺ токов L-типа. Дальнейшие исследования на основе полученных данных могут быть полезны при создании методик и новых препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (г. Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 гг.); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007, 2009);. на международной конференции «BIOLOGICAL MOTILITY: achievements and perspectives» (Пущино, 2008).

Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в /3 печатных работах, в том числе 2_ статьи в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации.

Похожие диссертации на Регуляция Ca2+ токов L-типа L-аргинином через активацию 2-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах

Роль NO в регуляции Ca2+ токов L-типа циклическими нуклеотидами в кардиомиоцитах нормотермных и гибернирующих животныхГрушин Кирилл Сергеевич

Регуляция потенциал-зависимого Ca2+ тока L-типа поддерживаемым потенциалом и модуляторами фосфорилирования по тирозинуПименов Олег Ювенальевич

Основные факторы, управляющие кальциевыми каналами L-типа в кардиоцитах гомойотермных и пойкилотермных животныхГриченко Алексей Станиславович

Ca^2+-связывающие свойства пальмитиновой и стеариновой кислот и роль комплекса этих кислот с Ca^2+ в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны Лимаренко Елена Анатольевна

Роль элементов цитоскелета в регуляции Ca2+-сигналов в перитонеальных макрофагахКурилова Лидия Сергеевна

Ca2+-связывающие свойства пальмитиновой и стеариновой кислот и роль комплекса этих кислот с Ca2+ в регуляции проницаемости митохондриальной мембраныЛимаренко Елена Анатольевна

Роль кальциевых медленных каналов L-типа в регуляции сердечного ритма у крыс в норме и при дезадаптацииКузьмин, Федор Андреевич

Глюкан со смешанным типом связей и глюкуроноарабиноксилан в ходе роста корней и колеоптилей кукурузы (Zea mays L.)Козлова, Людмила Валерьевна

Свойства митохондриальной циклоспорин А-нечувствительной пальмитат/Ca |?2+=|?-активируемой поры и ее возможная роль в активации апоптозаБелослудцев Константин Николаевич

Казеиновая киназа типа 2: регуляция активности в ооцитах, поиск природных субстратовМаликова Марина Александровна