Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 11
2.1. Механизмы Са2+- сигнализации в клетках 11
2.1.1. Механизмы мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо 12
2.1.1.1. Фосфоинозитидный путь передачи сигнала 14
2.1.1.2. Структура 1Р3-рецептора 19
2.1.1.3. Механизмы регуляции 1Р3-рецептора 21
2.1.1.4.Биофизические характеристики 1Р3-чувствительных каналов Са2+-выброса 24
2.1.1.5. ФосфоинозитиДкипа?^.т;л^.;гг.^> 25
2.1.2. Механизмы входа Са2+ в невоЗТтудттш(^ядак* 28
2.1.2.1. Депо-зависимый вход Са2+ в клетки 29
2.1.2.2. Модели депо-зависимого входа Са2+ 31
2.1.2.2.1. Модели с участием водорастворимых вторичных посредников 32
2.1.2.2.2. Модель "конформационного связывания ("conformational coupling" model) 36
2.1.2.2.3. Модели, предполагающие встраивание в плазматическую мембрану мембранных везикул, содержащих депо-зависимые Са -каналы 39
2.1.2.2.4. Модель связывания по типу секреции (secretion-like coupling model) 42
2.1.2.3. Биофизические характеристики депо-зависимых Са2+- каналов 43
2.1.2.4. Молекулярная природа депо-зависимых Са2+-каналов 45
2.1.2.5. Функциональная роль депо-зависимого входа Са2+ 52
2.1.2.6. Возможная роль депо-зависимого входа Са2+ в различных патологических процессах 52
2.2. Элементы цитоскелета 54
2.2.1. Актиновые филаменты 55
2.2.2. Микротрубочки 59
2.2.3. Роль структур цитоскелета в процессах внутриклеточной сигнализации 62
2.2.4. Цитоскелет в макрофагах 64
2.3. Заключение по обзору литературы и постановка задачи исследования. 67
3. Материалы и методы исследования 69
3.1. Объект исследования 69
3.2. Растворы 69
3.3. Установка для измерения внутриклеточной концентрации Са2+ с помощью флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM 70
4.Результаты и обсуждение 73
4.1. Влияние агентов, вызывающих реорганизацию элементов цитоскелета, на Са -сигналы в макрофагах 73
4.1.1. Влияние агентов, модифицирующих струїстуру цитоскелета, на Са -сигналы, вызванные ингибиторами эндоплазматичских Са2+-АТФаз 76
4.1.2. Влияние агентов, вызывающих модификацию элементов цитоскелета, на Са2+ сигналы, индуцированные пуринергическими агонистами 81
4.1.3. Влияние латрункулина В на Са -сигналы в макрофагах 86
4.1.4. Влияние стабилизатора актиновых филамептоп джасплакинолида на Са -сигналы в макрофагах 90
4.1.5. Влияние стабилизатора микротрубочек таксола на Са2+-сигналы, вызванные пуринергическими агонистами или ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз 94
4.2. Влияние ингибиторов фосфоинозитидкиназ на Са2+ -сигналы в макрофагах 107
4.3. Влияние ингибитора везикулярного транспорта брефельдина А на Са2+-
сигналы в макрофагах 112
5. Общее заключение 119
6. Выводы 124
7. Список литературы 126
- Фосфоинозитидный путь передачи сигнала
- Модель "конформационного связывания ("conformational coupling" model)
- Установка для измерения внутриклеточной концентрации Са2+ с помощью флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM
- Влияние агентов, вызывающих модификацию элементов цитоскелета, на Са2+ сигналы, индуцированные пуринергическими агонистами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших и актуальных проблем современной биофизики и биологии клетки является выяснение механизмов внутриклеточной сигнализации. Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и большую практическую значимость, так как действие многих токсинов и фармакологических агентов направлено именно на компоненты систем внутриклеточной передачи сигналов.
В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного посредника вьшолпяют ионы Са2+ (Berridge, Irvine, 1989; Berridge, 1990; Крутецкая, Лебедев, 1992 а; Крутецкая, Лебедев, 2001; Berridge, 1993; Clapham, 1995 а, 1995 Ъ; Bootman et al., 1997). Са2+ является универсальным вторичным мессенджером, участвующим практически во всех процессах, протекающих в живой клетке. В отличие от многих других мессенджеров, Са2+ необходим для жизнедеятельности клеток, и в то же время чрезмерное повышение внутриклеточной концентрации Са2+ приводит к гибели клеток. Образно говоря, ионы Са2+" являются сигналом для жизни и смерти клетки (life and death signal) (Berridge et al., 1998). Эта противоречивая роль Ca2+ в клетке, как мессенджера или токсина, на протяжении многих лет интересует исследователей.
Качественный скачок в изучении механизмов Са2+-сигнализации в клетках произошел после разработки и внедрения в широкую практику высокочувствительных флуоресцентных зондов, позволяющих измерять внутриклеточную концентрацию Са * (Tsien et al., 1984; Grynkiewicz et al., 1985). Практически все агонисты, связываясь с мембранными рецепторами, вызывают двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации Са + [Са2+]|, в клетках. В качестве первой фазы выступает кратковременная мобилизация Са2+ из внутриклеточных депо. Вторая фаза, более длительная, связана с входом Са2+ из наружной среды. В возбудимых клетках вход Са2+ осуществляется по потенциалзависимым Са2+ -каналам. В то же время, пути входа Са + в невозбудимые клетки изучены значительно меньше. В настоящее время предполагают, что одним из основных механизмов входа Са * в электрически невозбудимые клетки является так называемый депо-зависимый или "емкостной" вход Са +. В соответствии с моделью "емкостного" входа Са2+ (Putney, 1990; Berridge, 1995 а), вход Са2+ регулируется степе- пью заполнения Са +-депо таким образом, что опустошение депо активирует вход Са . В то же время, механизм, посредством которого мобилизация Са + из депо регулирует вход Са +, а также молекулярная природа депо-зависимых Са + каналов остаются неясными.
Выделяют несколько групп моделей депо-зависимого входа Са2+: модели с участием водорастворимых вторичных посредников, модель «конформациошюго связывания» ("conformational coupling" model), модели, предполагающие встраивание в плазматическую мембрану мембранных везикул, содержащих депо-зависимые Са2+-каналы. Тем не менее, истинный механизм депо-зависимого входа Са * может, по-видимому, включать элементы всех разновидностей моделей, как это предполагается в недавно предложенной модели связывания по типу секреции (secretion-like coupling model) (Patterson et al., 1999). Все группы моделей, кроме модели с участием водорастворимого вторичного мессендже-ра, предполагают участие элементов цитоскелета.
Цель и задачи исследовании. Целью настоящей работы являлось изучение роли структур цитоскелета в регуляции Са2+-сигналов и, в первую очередь, депо-зависимого входа Са + в перитонеальных макрофагах крысы и выяснение действующей модели емкостного входа в данном типе клеток. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Исследовать влияние агентов, вызывающих реорганизацию микротрубочек и микрофиламентов, на Са2+-сигналы, индуцированные пуринергическими агони-стами (АТФ, УТФ) и ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз (тапсигаргин, циклопьязопиковая кислота).
Исследовать участие фосфоинозитидкиназ, играющих важную роль в реорганизации актиновых филаментов, в регуляции депо-зависимого входа Са + в пери-тонеальные макрофаги.
Изучить участие везикулярного транспорта в регуляции емкостного входа Са2+ в перитонеальные макрофаги крысы.
Научная новизна работы. Впервые исследована роль элементов цитоскелета в регуляции депо-зависимого входа Са2+ в перитонеальные макрофаги крысы. Проведен максимально широкий фармакологический анализ роли микротрубочек и актиновых филаментов в формировании Са +-сигналов в макрофагах.
Впервые во всех сериях экспериментов по изучению модуляции Са -сигналов и, прежде всего депо-зависимого входа Са2+ использованы два методических подхода -исследование клеток в нормальной физиологической и бескальциевой среде инкубации.
В мировой литературе существует мало работ, посвященных исследованию роли микротрубочек в регуляции процессов Са2+-сигнализации, и, в частности влиянию стабилизатора микротрубочек таксола на -сигналы в клетках. В данной работе, впервые было исследовано действие таксола на формирование Са2+-ответов в макрофагах.
Впервые на данном типе клеток, показано участие фосфоинозитидкиназ в регуляции Са "^-сигналов.
Впервые на макрофагах исследовано влияние ингибитора везикулярного транспорта брефельдина А на параметры Са +-сигналов в различных экспериментальных условиях.
Анализ всех полученных данных позволяет впервые сделать предположение о действующей модели депо-зависимого входа Са2+ в перитонеальные макрофаги.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования роли структур цитоскелета и других элементов сигнальных систем в регуляции депо-зависимого входа Са2+ в макрофагах, вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы биофизики и биологии клетки — проблемы внутриклеточной передачи сигналов. Выяснение биофизических, биохимических и физиологических механизмов внутриклеточной сигнализации имеет фундаментальное значение для понимания процессов, осуществляющих важнейшие общие и специализированные функции клеток: пролиферацию, секрецию, фагоцитоз, иммунный ответ и т.д. Обобщение результатов расширяет представления о механизмах Са24"-сигнализации в клетках при их рецептор-зависимой активации, о роли элементов цитоскелета - многофункциональной внутриклеточной системы - в передаче информации внутри клеток при их активации.
Полученные в работе новые данные о механизме действия фармакологических агентов, влияющих на системы внутриклеточной сигнализации и структуры цитоскелета в макрофагах, имеют не только теоретическое, но и большое практическое значение для медицины и фармакологии. Данные фармакологического анализа могут быть использованы для скрининга новых эффективных лекарственных средств. Полученные результаты используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре биофизики Санкт-Петербургского государственного университета.
Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на: Четвертой, пятой, шестой и седьмой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2001, 2002, 2003, 2004), Шестой Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2001), IV международной конференции по функциональной нейроморфологии "Колосовские чтения - 2002" (Санкт-Петербург, 2002), Междисциплинарной конференции с международным участием «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человекам («НБИТТ-21») (Петрозаводск, 2002), Седьмой Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2002), Восьмой Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2003), Итоговом семинаре по физике и астрономии по результатам конкурса грантов 2003 года для молодых ученых Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2004), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международном симпозиуме «Са2+ в норме и при патологии» (International Symposium on Calcium in Health and Disease, Rovaniemi, Finnish Lapland. 2004), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (International symposium "Biological Motility", Pushchino, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005), Пятом Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); I съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Сочи, 2005; а также на заседаниях кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного университета и научных семинарах лаборатории биофизики клетки ФНИИ им А.А.Ухтомского.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 366 наименований, работа иллюстрирована 35 рисунками.
Фосфоинозитидный путь передачи сигнала
Роль мембранных фосфоинозитидов в передаче сигнала изложена в многочисленных обзорах (Berridge, 1984, 1987, 1993; Berridge, Irvine, 1984, 1989; Крутецкая, Лебедев, 1992 а; Лебедев, Крутецкая, 1994; Крутецкая, Лебедев, 2000 а, Крутецкая и др., 2003).
Внешний сигнал после взаимодействия с рецептором через G-белок активирует усилительный фермент фосфолипазу С (ФЛС) (рис. 1). ФЛС расщепляет мембранный фосфолипид фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (РІРг) на два соединения, служащие внутриклеточными мессенджерами: водорастворимый инозитол-1,4,5-трисфосфат (1Рз) и липидорастворимый диацилглицерин (DAG) (Berridge, 1993) (рис. 2).
Клеточные рецепторы, ответственные за мобилизацию Са2+, взаимодействуют с особым G-белком (Gq), активирующим ФЛС и, следовательно, образование IPj и DAG. Gq действует по тому же принципу, что и G-белки, регулирующие активность АЦ (Neer, 1995). Гидрофильный 1Рз диффундирует в цитоплазму и вызывает освобождение кальция из внутриклеточных депо (эндоплазматический рстикулум, митохондрии). Ионы Са + образуют комплекс с Са -связывающим белком кальмодулином. Этот комплекс активирует протеинкиназу, катализирующую фосфорилирование неактивного белка, что приводит к активации последнего и возникновению клеточного ответа (Berridge, 1984, 1987,1993; Berridge, Irvine, 1984,1989; Крутецкая, Лебедев, 1992 а).
Оставшийся в мембране DAG активирует протеинкиназу С. Для этого необходимы кислый фосфолипид фосфатидилсерин (ФС) и Са +. Протеинкиназа С катализирует присоединение фосфата к остаткам серина или треонина неактивного белка, белок активируется, запускается цепь внутриклеточных реакций, и в конечном итоге возникает ответная реакция клетки (Nishizuka, 1984, 1988, 1995). DAG фосфорилируется диацилглицеринкипазой с образованием фосфатиджж кислоты (для осуществления этой реакции необходим АТФ) (Berridge, Irvine, 1984).
Возможно, фосфатидная кислота выполняет функцию кальциевого ионофора и транспортирует Са + через плазматическую мембрану, модифицируя структуру липид-ііого бислоя таким образом, что образуются участки с небислойной упаковкой молекул. При этом на границе бислоя и монослоя образуются дефекты, «каналы» для ионов Са2+ (Eible, Blume, 1979). DAG содержит, как правило, во втором положении остаток арахи-доновой кислоты. Образующаяся под действием диацилглицсринлипазы, свободная арахидоновая кислота представляет собой исходный материал для синтеза физиологически активных соединений - простагландинов, леикотриенов, тромбоксанов. Они, в свою очередь, способны эффективно модулировать разнообразные реакции в клетке. (1,4,5)1Рз дефосфорилируется под действием 5-фосфатазы до инозитол-1,4-дифосфата, (1,4) IP2, или наоборот, может фосфорилироваться до ипозитол-1,3,4,5-тетракифосфата, ІРд, при действии 3-киназы (Berridge, Irvine, 1984, 1989) (рис. 3).
Конечная стадия в цикле инозитолфосфатов - превращение ипозитолмонофос фата (ГР) в свободный ипозитол, которое катализируется ферментом инозитол-1 монофосфатазой. Активность этого фермента блокируется ионами Li+. Именно этим объясняется эффективное лечение ионами Ц+ маниакально-депрессивных психозов и некоторых других заболеваний нервной системы. Блокада литием инозитол-1 моиофосфатазы замедляет синтез инозитола в организме и ослабляет протекающие в нейронах процессы, зависящие от метаболизма фосфоинозитидов. Эффект Li+ специ фичен; Li+ не действует на нормально функционирующие рецепторы, а "находит" и тормозит гиперактивные рецепторы (Berridge, 1984, 1987, 1993; Berridge, Irvine, 1984, 1989). По-видимому, при передаче сигнала с помощью гидролиза фосфоинозитидов пути внутриклеточной сигнализации могут раздваиваться. Это связано с тем, что гидролиз PIP2 приводит к образованию двух вторичных посредников: 1Р3 и DAG. Роли разных ветвей фосфоинозитидного пути передачи сигнала могут быть исс ледованы с помощью химических соединений, имитирующих действие lPj или DAG.
Так, эффект DAG сходен с действием форболовых эфиров, активирующих протеиики назу С. Форболовые эфиры выделены из масла семян восточноазиатского древесного растения Crotoh tiglium и обладают мощным промоторным действием - резко ускоряют инициацию опухолей канцерогенами. Сродство наиболее активного форболового эфира ф -ТРА (12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата) к протсинкиназе С чрезвычайно высоко: значения соответствующих констант диссоциации комплекса достигают 60 пМ (Nishi zuka, 1984, 1988). Действие ІРз имитируется кальциевыми ионофорами - А23І87, ио-номицином.
Между ветвями фосфоинозитидного пути существует синергизм: форболовый эфир и Са2+-ионофор инициируют деление ряда клеток, Фосфоинозитиды контролируют такие процессы, как секреция гормонов, транспорт ионов, размножение клеток (Вег-ridge, Irvine, 1989; Berridge, 1993).
Предполагают, что высвобождение Са2+ из 1Р3-чувствительных депо происходит после связывания 1Р3 с белком, одновременно являющимся рецептором для 1Р3 и кана-лом, обеспечивающим выход Са из полости депо в цитоплазму (Berridge, 1993; Marshall, Taylor, 1993; Bezprozvanny, Ehrlich, 1995; Marks, 1997).
От момента обнаружения того факта, что 1Р3 индуцирует освобождение Са + из немитохондриального депо (Streb et al., 1983), до выделения 1Р3-рецептора (Supattapone et al., 1988 b) прошло 5 лет. Это связано с тем, что 1Р3-рецепторы в большинстве клеток имеют низкую плотность. Удачной находкой оказались клетки Пуркинье мозжечка, которые имеют необычайно высокую плотность 1Р3-рецепторов. 1Р3-рецептор был выделен из мозжечка быка, крысы и мыши и реконструирован в липосомы (Supattapone et al., 1988 b; Marshall, Taylor, 1993; Bezprozvanny, Ehrlich, 1995). Методами молекулярного клонирования установлено, что 1Р3-рецептор гомологичен рианодиновому рецептору, каналу выброса Са2+ из СР скелетных мышц. 1Р3-рецептор представляет собой белок с мол. массой 313 кДа, имеющий 6 трансмембранных участков в области С-конца (Furuichi et al., 1989; Mignery et al., 1990; Galvan et al., 1999). Первые два трансмембранных сегмента необходимы для встраивания рецептора в мембрану (Galvan et al., 1999). Аминокислотная последовательность 1Р3-рецептора высоко консервативна, из 2749 аминокислотных остатков выявлено различие между белками мыши и крысы только в 21 аминокислоте (Mignery et al,, 1990). Использование различных монокло-нальных антител показало, что N-конец белка 1Р3-рецептора обращен в цитоплазму, а С-конец расположен в полости депо (Furuichi et al., 1989). Белок имеет многочисленные потенциальные участки гликозилирования и, по крайней мере, два потенциальных участка фосфорилирования цАМФ-зависимой киназой (Furuichi et al,, 1989). Показано, что связывание 1Р3 с очищенным ПУрецептором ингибируется гепарином (Supattapone et al., 1988 b) и высокочувствительно к рН и концентрации цитоплазматического Са24" (Pietrobon et al., 1990). Установлено, что 1Р3-рецептор не только гомологичен рианоди-новому рецептору в области трансмембранных сегментов, но, так же как и рианодино-вый рецептор, образует гомотетрамеры из четырех нековалснтно связанных высококонсервативных субъединиц (мол. масса 313 кДа) (Mignery et al., 1990; Marshall, Taylor, 1993;Galvanetal., 1999).
Модель "конформационного связывания ("conformational coupling" model)
Идея о возможности прямого взаимодействия между ЭР и плазматической мембраной была впервые высказана Робином Ирвином (Irvine, 1990) на основании обнаруженной гомологии между 1Р3-рецептором и рианодиновым рецептором в скелетных мышцах. По модели Ирвина, концентрация Са + в полости депо играет ведущую роль в регуляции высвобождения Са из депо. Считается, что 1Р3-рецептор, трансмембранный белок мембраны ЭР, имеет два аллостерических участка связывания: один участок, обращенный к цитоплазме, связывает 1Р3, другой участок, обращенный в полость депо, связывает Са2+. Предполагается также, что связывание Са2+ со своим участком увеличивает сродство рецептора к 1Р3, а связывание 1Р3 с рецептором увеличивает сродство кальциевого локуса к Са +. При связывании Са2+ со своим локусом происходит открывание канала Са2+ -выброса и выход Са2+ в цитоплазму. По аналогии с рианодиновым рецептором, который связывает мембрану СР с мембраной Т-трубочек в скелетных мышцах, Ирвин предположил, что 1Р3-рецептор может образовывать "мостик" между внутриклеточным кальциевым депо и плазматической мембраной. 1Р3-рецептор взаимодействует с белком в плазматической мембране (возможно с IP4-рецептором). Считается, что сродство 1Рз-рецептора к участку связывания его с плазматической мембраной модулируется кальцием внутри полости депо и 1Р3 в цитозоле. Низкая концентрация Са2+ в депо и высокая концентрация 1РЭ способствуют диссоциации 1Р3-рецептора и белка в плазматической мембране (1Рд-рецептора). Диссоциация этих двух белков приводит к освобождению Са2+ из депо через канал 1Р3-рецептора, а также входу Са2+ из наружной среды. Связывание 1Р4 со своим рецептором в плазматической мембране также, по-видимому, способствует отщеплению 1Рз-рецептора от мембраны. Таким об 37 разом, совместное действие 1Р3 и IP4 и истощение кальциевого депо вызывают изменение конформации ПУрецептора, диссоциацию его от плазматической мембраны и вход Са2+ в клетку (Irvine, 1990).
М. Берридж развил модель Ирвина и предположил, что связь между опустошением внутриклеточных Са +-депо и активацией Са2+-каналов в плазматической мембране осуществляется путем прямого взаимодействия между ГРз-рецептором в мембране ЭР и Са2+-капалом в плазматической мембране (Berridge, 1995 а) (рис. 6). Для описания этого типа взаимодействий Берридж ввел понятие "конформациоппое связывание" (conformational coupling). В соответствии с моделью Берриджа, большая цитоплазма-тическая "головка" 1Р3-рецептора, локализованная в непосредственной близости к плазматической мембране, интегрирует сигналы, регулирующие емкостной вход Са2+ и передает информацию непосредственно на депо-зависимый Са +-канал. 1Р3-рецепторы могут иметь две различные функции:, освобождать Са + вцитозоль или передавать информацию Са """-каналам в плазматической мембране. Учитывая, что существуют различные изоформы 1Р3-рецептора, вполне возможно, что эти две сигнальные функции могут осуществляться различными рецепторами, Берридж предположил, что 1Р3-рецептор типа 1 опосредует мобилизацию Са2+ из депо, в то время как 1Р3-рецептор типа 3 специфически связывается с депо-зависимым Са2+-каналом (Berridge, 1995 а).
В пользу модели конформационного связывания свидетельствуют данные о пространственной локализации входа Са2+ в непосредственной близости к участкам мобилизации Са2+ из депо. Так, в работе Петерсена и Берриджа (Petersen, Berridge, 1996) показало, что в ооцитах Xenopus емкостной вход Са2+ колокализован с опустошенными Са +-депо, что исключает участие растворимого посредника в активации депо-зависимого входа Са2+. Джакони и др. (Jaconi et al., 1997) также обнаружили, что емко-стной вход Са происходит только в участках мембраны ооцитов, к которым близко подходит ЭР. Колокализадия депо-зависимого входа Са и участков IP3-индуцированного выброса Са + показана с помощью конфокальной микроскопии и для эндотелиальных клеток (Huser et al., 1999).
Представляет интерес новый вариант модели сопряжения, в соответствии с которой 1Р3-рецептор, расположенный в мембране ЭР, прямо связан с фосфатидилинози-тол-4,5-дифосфатом (РІРг), локализованным в плазматической мембране (Lupu et al., 1998). В нестимулированных клетках часть 1Р3-рецепторов ингибировапа вследствие к
Связь между опустошением Са2+-депо и активацией Са2+-каналов в плазматической мембране осуществляется путем физического взаимодействия между 1Рз-рецептором (IR) и Са -каналом. Это может быть прямое белок-белковое взаимодействие или может включать взаимодействия с цитоскелетом. R - рецептор; Gp - G-белок; PLC -фосфолипаза С ( по Berridge, 1995 а). взаимодействия с РІРг. Стимуляция клеток агонистами вызывает активацию фосфоли-пазы С, расщепляющей эту связь, что приводит к одновременному удалению ингибитора (РІРг) и продукции активатора (1Р3) 1Р3-рецептора, Образовавшийся ІРз активирует 1Р3-рецептор и индуцирует мобилизацию Са2+ из депо (Lupu et aL, 1998).
Основоположник емкостной модели Джеймс Патни (Putney, 1999 а) предположил, что в состав сигнального комплекса 1Рз-рецептор-депо-зависимый Са2+-канал входит также фосфолипаза С и, возможно, какой-то вспомогательный белок, подобный белку InaD, функционирующему в фоторецепторах Drosophila (Рис.7).
Чтобы конформационная модель работала, а 1Р3-рецептор и Са +-канал непосредственно взаимодействовали друг с другом, необходимо, чтобы ЭР достаточно близко подходил к плазматической мембране. Это подтверждается результатами многочисленных морфологических и иммуно-гистохнмических исследований, выполненных на различных типах клеток. Так, на клетках печени крысы показано, что 1Рз-рецепторы часто присутствуют во фракциях плазматических мембран (Rossier et al., 1991; Lievremont et al., 1994). При дальнейшем фракционировании было установлено, что эти 1Р3-рецепторы локализованы в специализированных субкомпартментах ЭР, которые тесно прилегают к плазматической мембране. Использование цитохалазииа В позволило предположить, что актиновые филаменты могут связывать 1Р3-рецепторы в ЭР с плазматической мембраной (Rossier et al., 1991; Lievremont et al., 1994).
С использованием мембраносвязанного Са+-индикатора FFP-18 показано, что депо-зависимый вход Са в астроцитах мыши происходит в микродоменах плазматической мембраны, взаимодействующих с ЭР (Golovina, 2005). Таким образом, депо-зависимый вход Са2+ структурно и функционально связан с Са2+ -депо.
Установка для измерения внутриклеточной концентрации Са2+ с помощью флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM
Для измерения внутриклеточной концентрации кальция ([Са2+]0 использовали флуоресцентный зонд Fura-2AM. Макрофаги инкубировали в течение 45 мин в физиологическом растворе, содержащем 2 мкМ Fura-2AM при комнатной температуре (для предотвращения образования мицелл с Fura-2AM, который происходит при 37С) (Malgaroli et al., 1987; Randriamampita et al,, 1991; Alonsoorre, Trautmarm, 1993). Стекла с окрашенными клетками отмывали физиологическим раствором и переносили в экспериментальную камеру, расположенную на столике люминесцентного микроскопа "Люмам-КФ". Флуоресценцию Fura-2 возбуждали при 337 нм с помощью азотного лазера ЛГИ-503. Лазер располагали сбоку от микроскопа под углом 30 к экпериментальной камере, что позволяло направить луч лазера непосредственно на обьект. Интенсивность флуоресценции регистрировали с помощью спектрофотонасадки СФН-10 при длине волны 510 нм. Сигнал с ФЭУ-79 усиливали специально сконструированным усилителем и регистрировали на компьютере IBM PC с использованием оригинального программного обеспечения. Схема автоматизированной установки для измерения [Са2+]і в макрофагах представлена на рис. 15. В экспериментах использовали обьектив 10 X 0,40. При данном увеличении в площадь фотометрируемо го участка попадало 40-50 клеток. Для избежания фотовыгорания измерения проводили через каждые 20 с с облучением обьекта в течение 2,5 с. При добавлении АТФ и УТФ клетки облучали непрерывно до достижения максимума флуоресценции. Значения [Са ]І рассчитывали по уравнению Гринкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]s =IQ (F - Fmin) / (Fmax - F), где F - наблюдаемая интенсивность флуоресценции; Fmax - флуоресценция красите-ля, насыщенного Са ; Fmin — флуоресценция красителя, свободного от Са (в бескальциевой среде). При 20 С и рН 7,1-7,2, константа диссоциации, Kj, для комплекса Fura-2АМ:Са2+ составляет 135 нМ (Grynkiewicz et al., 1985). Fmax измеряли после добавления 10 мкМ иономицина или 25 мкМ дигитонина к клеткам, находящимся в среде, содержащей Са2+. Обработка клеток дигитонином позволяет ионам Са21" свободно проникать через плазматическую мембрану, не влияя на проницаемость мембран митохондрий и эндоплазматического ретикулума. После стабилизации сигнала добавляли 5 мМ ЭГТА и определяли флуоресценцию красителя в номинально бескальциевой среде (Fm;n). Уровень собственной флуоресценции вычитали после добавления к макрофагам раст Блок питания лазера
Схема автоматизированной установки для регистрацин внутриклеточной концентрации ионов Са2+, [Ca2+]j. 1 - стекло с клетками 2 - флуоресцентный микроскоп Люмам КФ 3 - спектрофотонасадкаСФН-10 4 - блок питания ФЭУ 5 - шторка 6 - азотный лазер ЛГИ-503 7- блок питания лазера 8 - усилитель тока ФЭУ 9 - аналого-цифровой преобразователь (АЦП, 10 разрядов) 10 - блок управления шторкой 11 - управляющая ЭВМ 12 - принтер вора MnCh (100 мкМ). Мп2+ вытесняет Са2+ из комплекса с Fura-2, а флуоресценция комплекса красителя с МпІТ в 100 раз ниже флуоресценции комплекса Fura-2 с Са . Для Fura-2, Fmin = Fmax / 3 (Grynkiewicz et al., 1985).
В исследованиях использовали два экспериментальных подхода. В первом ис-следовали действие фармакологических агентов на Са -ответ, вызываемый АТФ, УТФ, тапсигаргином или циклопьязониковой кислотой (ЦПК) в макрофагах, находящихся в нормальном физиологическом растворе. Агенты вводили либо до действия агонистов, либо после, во время фазы плато Са -сигнала, отражающей вход Са из наружной среды. Во втором варианте опытов для выявления и усиления входа Са в клетки использовали следующую схему эксперимента (Са +-free/Ca +-reintroduction protocol). Макрофаги инкубировали в номинально бескальциевой среде, затем на них действова-ли одним из агонистов, вызывая мобилизацию Са из внутриклеточных депо. После добавления в наружную среду 2 мМ Са + и восстановления физиологического градиента концентрации Са +, наблюдается быстрое повышение [Са +]„ отражающее вход Са + в клетку. Далее исследовали влияние фармакологических агентов, добавленных до введения агонистов, до введения Са + или во время развивающегося входа Са + из наружной среды. 4.Рсзультаты и обсуждение
Для микротрубочек и для микрофиламентов известны препараты, связывающиеся с отдельными субъединицами белка и подавляющие сборку полимера. Так, антими-тотические агенты колхицин, колцемид и винбластин, связываясь с димером тубулина, подавляют сборку микротрубочек (Wilson, 1970; Borgers, De Brabander, 1975; Фултон, 1987). Цитохалазины (цитохалазин В, цитохалазин D, дигидроцитохалазин В), обратимо связываясь с актиновым мономером, препятствуют добавлению молекул актина к актиновым филаментам, что приводит к деполимеризации микрофиламентов (Та-nenbaum, 1978; Goddette, Frieden, 1986; Cooper, 1987; Фултон, 1987). Напротив, фал-лоидин связывается с полимеризованным актином и стабилизирует актиновые фила-менты (Cooper, 1987; Фултон,1987). Структура агентов, вызывающих реорганизацию микротрубочек и микрофиламентов, представлена на рис. 16.
В исследованиях мы использовали два варианта экспериментов. В первом варианте экспериментов макрофаги предварительно инкубировали с агентами, нарушающими структуру цитоскелета, в течение 10-60 мин до воздействия агонистов. Во втором варианте опытов исследуемые соединения добавляли на фоне развивающегося входа Са2+ в клетки.
Добавление к перитонеальным макрофагам 200 мкМ АТФ или УТФ вызывает двухфазный Са +-сигнал: кратковременный пик, связанный с мобилизацией Са2+ из депо, и выраженное длительное «плато» (рис. 17, а, в). В случае добавления АТФ она отражает, по-видимому, одновременную активацию пуринорецепторов Р2и- и Р2г-типов. Другой пуринергический агонист - УТФ связывается только с рецепторами Р2ц-типа и стимулирует вход Са +, обусловленный, вероятно, опустошением депо (Alonsoorre, Trautmann, 1993). Фаза плато обусловлена входом Са2+ из наружной среды (Крутсцкая и др., 2001).
Влияние агентов, вызывающих модификацию элементов цитоскелета, на Са2+ сигналы, индуцированные пуринергическими агонистами
В последнее время обнаружено, что фосфоипозитиды мембран играют ключевую роль в реорганизации актиновых филаментов в различных типах клеток (Janmey, 1994; Ma, Abrams, 1999). Так, действие фосфоинозитид-специфических киназ, таких как фосфатидилшюзитол 3- и 4-киназа, регулирующих D3- и 04-содержащие фосфоипозитиды, приводит к динамической реорганизации актиновых филаментов.
В связи с этим, представлялось целесообразным изучить возможную роль фос-фоинозитидов в регуляции депо-зависимого входа Са . Для этого мы исследовали влияние двух структурно различных ингибиторов фосфатидилинозитол 3- и 4-киназ вертманнина и соединения LY 294002 (2-(4-морфолинил)-8-фенил-4Н-1-берзопиран-4-он; 2-(4-морфолинил)-8-фенилхромои) па Са -сигналы, индуцированные пуринергиче-скими агонистами (АТФ, УТФ) и ингибиторами эидоплазматических Са2+-АТФаз тап-сигаргином и циклопьязониковой кислотой в перитонеальных макрофагах крысы.
Исследовано влияние эффективного ингибитора фосфатидилинозитол 3- и фосфатидилинозитол 4-киназы вертманнина (100 нМ, 0,5 мкМ), выделяемого из Penicillium wortmanni (Walker et al., 2000), на Са2+-сигналы, индуцированные ингибиторами эндо-плазматических Са -АТФаз и пуринергическими агонистами в перитонеальных макрофагах крысы. Установлено, что в концентрации 100 нМ вертманнин не влияет на фазу мобилизации Са2+ из депо и незначительно (20-30%) подавляет вход Са"+ в макрофаги, индуцированные пуринергическими агонистами и ингибиторами эидоплазматических Са2+-АТФаз (не показано). На рис. 31 показано влияние 0,5 мкМ вертманнина на Са2+-сигналы, индуцированные АТФ или тапсигаргином в макрофагах. Приложение 0,5 мкМ вертманнина на фоне развившегося входа Са + (рис. 31, а), индуцированного АТФ в нормальном физиологическом растворе, приводило к подавлению фазы входа Са и уменьшению [Са2+]і до базального уровня. Предварительная инкубация клеток с 0,5 мкМ вертманнина в течение 5 мин до стимуляции клеток 0,5 мкМ тапсигаргина в нор 1000
По вертикали и горизонтали - то же, что и на рис. 17. а, б - клетки стимулировали 200 мкМ АТФ (а) или 0,5 мкМ тапсигаргина (б) в нормальном физиологического растворе, в, г - клетки стимулировали 200 мкМ АТФ (в) или тапсигаргина (г) в номинально бескальциевой среде, вход Са инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+. а, г — 0,5 мкМ вертманнина добавляли на фоне развившегося входа Са2+. б, в — клетки инкубировали с 0,5 мкМ вертманнина в течении 5 мин до введения агони-стов. мальном физиологическом растворе не оказывала влияния на фазу мобилизации Са2+ депо, по вызывала практически полное подавление депо-зависимого входа Са (рис. 31, б). Сходные результаты получены с использованием бескальциевой среды. В опытах, показанных на рис. 30, виг, макрофаги стимулировали 200 мкМ ЛТФ (рис. 31, в) или 0,5 мкМ тапсигаргина (рис. 31, г) в номинально бескальциевой среде, после окон-чания фазы мобилизации, вход Са индуцировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+. Видно, что предварительная инкубация клеток с 0,5 мкМ вертманнина в течение 15 мин до введения АТФ приводит к практически полному подавлению фазы входа Са2+ в макрофаги. Добавление 0,5 мкМ вертманнина на фоне развившегося входа Са +, индуцированного тапсигаргином, вызывало быстрое снижение внутриклеточной кон-центрации Са до базального уровня (Лебедев и др., 2003; Курилова и др., 2003).
Во всех вариантах экспериментов показано, что соединение LY294002 вызывает дозо-зависимое подавление входа Са , индуцированного тапсигаргином (1 мкМ) или АТФ (200 мкМ) (рис. 32). Предварительная инкубация макрофагов в течение 15-30 мин с низкими концентрациями LY294002 (10 мкМ), при которых происходит специфическое ингибирование фосфатидилинозитол 3-киназы (Vlahos et al., 1994), приводит к незначительному (на 30 %) ингибированию депо-зависимого входа Са2+ в макрофаги (не показано). В то же время, при воздействии более высоких концентраций соединения LY294002 (50, 100 мкМ), при которых происходит ингибирование и фосфатидилинози-тол 4-киназы, наблюдается подавление входа Са (70- 100 %) , индуцированного пу-ринергическими агонистами или ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз (рис. 32).
При всех исследованных концентрациях соединение LY294002 не влияло на фазу мобилизации Са2+-сигналов, вызванных тапсигаргином (рис. 32, б, г), В концентрации при добавлении к макрофагам соединения LY294002 в концентрации 50 или 100 мкМ наблюдалось значительное (на 40-60 %) уменьшение фазы мобилизации Са -сигналов, индуцируемых АТФ (рис. 32, а, в). Это связано, по-видимому, с тем, что в концентрации 50 - 100 мкМ соединение LY294002 влияет на активность фосфатидилинозитол 4-киназы, регулирующей синтез агонист-чувствительного пула фосфоинозити-дов, лимитируя тем самым количество фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата, доступного для фосфолипазы С и образования Са2+-мобшшзующего мессенджсра инозитол-1,4,5-трисфосфата.
Полученные данные согласуются с результатами, полученными на тромбоцитах человека (Rosado, Sage, 2000 a, b, d) и ацинарпых клетках поджелудочной железы (Fisher et al., 2004). Так, в работах Сейджа и соавторов (Rosado, Sage, 2000 a, b) показано, что ингибиторы фосфоинозитид 3- и 4-киназы вертманнин и соединение LY294002 не влияют на мобилизацию Са2+ из дено, но значительно подавляют депо-зависимый вход Са+, индуцированный тапсигаргином. Обработка тромбоцитов соединением LY294002 в концентрации 10 мкМ, в которой оно влияет на активность фосфатидилинозитол 3-юшазы, не влияет на мобилизацию Са2+ из депо, вызываемую физиологическим агонистом тромбином. В то же время, при воздействии LY294002 в концентрации 100 мкМ наблюдается заметное (на 26 %) подавление фазы мобилизации Са2+ из депо, индуцируемой тромбином (Rosado, Sage, 2000 a, b). На ацинарных клетках поджелудочной железы обнаружено, что вертманнин и соединение LY294002 подавляют обе фазы Са """-сигнала, индуцированного холецистокинином или карбахолом, но не влияют на мобилизацию, вызванную тапсигаргином (Fisher et al., 2004).
Результаты наших экспериментов с использованием вертманнина и соединения LY294002 свидетельствуют о том, что фосфатидилинозитол 3-киназа и фосфатидилинозитол 4-киназа играют важную роль в активации депо-зависимого входа Са2+ в макрофаги. Однако то, что оба блокатора действуют менее эффективно в малых концентрациях, которые специфически иигибируют фосфатидилинозитол 3-киназы, позволяет предположить, что фосфатидилинозитол 4-киназа в большей степени, чем фосфатидилинозитол 3-киназа, влияет на активацию депо-зависимого входа Са + в этом типе клеток. Возможно также, что фосфатидилинозитол 4-киназа может ослаблять ингибирова-ние фосфатидилинозитол 3-киназы, фосфорилируя фосфатидилинозитол 3 -фосфат, остающийся в клетке (Rosado, Sage, 2000 а).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что синтез фосфоинозитидов необходим для активации депо-зависимого входа Са + в макрофаги. Активность фосфатидилинозитол 3-киназы и фосфатидилинозитол 4-киназы может являться одним из факторов, участвующих в регуляции пула фосфоинозитидов, необхо-димого для активации депо-зависимого входа Са , причем действие киназ может быть опосредовано влиянием на элементы актинового цитоскелета (Rosado, Sage, 2000 a, b).
Полученные результаты могут свидетельствовать в пользу модели емкостного входа Са2+ "связывание по типу секреции" (secretion-like coupling model), предполагающей обратимую транслокацию эндоплазматического ретикулума к плазматической мембране, происходящую с участием актиновых филаментов.
