Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 Общие представления о липопротеинах 12
12 Метаболизм липопротеинов в макрофагах 19
1.2.1 Общие сведения о макрофагах 19
1.2.2 Участие макрофагов в противоопухолевой защите 22
1.2.3 Механизм поглощения липопротеинов макрофагами 25
1.2.4 В,Е-рецеиторы 26
1.2.5 Скевенджер-рецепторы 31
13 Участие макрофагов в реакциях воспаления 37
1.3.1 Липополисахарид (эндотоксин) - основной компонент бактериальной стенки грамотрицательных бактерий 37
1.3.2 Липополисахарид-связывающий белок 44
1.3.3 Рецепторы для липополисахаридов. 46
1.3.4 Рецептор CD14 48
1.3.5 Толл-подобные рецепторы (TLR) 49
1.3.6 Ядерные рецепторы 51
III. Результаты собственных исследований 59
3.1 Анализ поглощения и метаболической деградации белкового и липидного компонента липопротеинов различных классов плотности резидентными печеночными и перитонеальными макрофагами мышей в норме и при опухолевом росте 59
3.2 Изучение образования комплексов липопротеинов с полисахаридами бактериального и дрожжевого происхождения 77
3.3 Влияние полисахаридов на функциональную активность макрофагов и содержание в них регуляторних белков (аполипопротеиыа Е и цистатина С) в норме и в условиях опухолевого роста 83
IV. Обсуждение .94
Выводы 113
Список литературы 114
- Общие представления о липопротеинах
- Скевенджер-рецепторы
- Толл-подобные рецепторы (TLR)
- Изучение образования комплексов липопротеинов с полисахаридами бактериального и дрожжевого происхождения
Введение к работе
Внимание многих исследователей в настоящее время направлено на изучение роли макрофагов в молекулярном ответе на инфекционные агенты. В ответ на введение экспериментальным животным бактериальных липополисахаридов (ЛПС) макрофаги секретируют серию воспалительных медиаторов, таких как ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6, эйкозаноиды, оксид азота, реактивный кислород (Silverstein, e.a., 2000). Имеются факты, свидетельствующие о том, что изменение функциональной активности макрофагов под влиянием полисахаридов сопровождается изменением белкового и липидного обмена (Маянский Д.Н. и др., 1992; Панин Л.Е., 1998). Инъекция ЛПС приводит к повышению в гепатоцитах синтеза триглицеридов, и у животных развивается выраженная гиперлипопротеинемия за счет ЛПОНП (Scholl e.a., 1984). Введение животным антител к ФНО-альфа или антагонистов рецептора к ИЛ-1 предотвращало развитие гипертриглицеридемии, что указывает на важную роль макрофагов в регуляции липидного обмена в ответ на ЛПС-стимуляцию (Femgold, e.a., 1992).
Однако, многие метаболические функции макрофагов нельзя объяснить перечисленными выше факторами. Важную роль макрофаги играют в механизме межклеточных взаимодействий. Например, макрофаги печени (клетки Купфера) вместе с гепатоцитами участвуют в обмене гемоглобина, стероидных гормонов и др. соединений (Sawyer N.J., e.a., 1964; Schepper-S chafer J., Spring G.F., 1989). Клетки Купфера повышают синтез и секрецию гепатоцитами белков острой фазы, один из них - С-реактивный белок, связываясь с хроматином, способствует удалению продуктов ядерного распада из зон некроза (Robey F., e.a., 1984).
Обмен липопротеинов в печени также связан с макрофагами. Механизм рецепторного поглощения макрофагами липопротеинов
определяют входящие в состав ЛИ белки - аполипопротеины. Один из этих белков - аполипопротеин Е также синтезируется и секретируется макрофагами (Friedman, е.а., 1991; Brand, е.а., 1992). Аполипопротеин Е - основной элемент нескольких подклассов липопротеинов плазмы крови и выполняет важную функцию в липидном обмене как белок наведения в рецептор-обусловленном поглощении липопротеинов (Mahley R.W., 1988). Изучение путей проникновения ЛП в клетку, их последующая внутриклеточная локализация являются совершенно необходимыми для понимания как регуляторной роли ЛП, так и участия моноцитов/макрофагов в обмене липопротеинов. Макрофаги не только рецепторным путем поглощают модифицированные липопротеины, но и активно способствуют выведению холестерина и фосфолипидов насцентными липопротеинами высокой плотности с участием АТФ~ связанного кассетного транспортера (АВСА1) и аполипопротеина Е (Scott R. е.а., 2002).
В Институте биохимии СО РАМН изучены молекулярные механизмы участия резидентных макрофагов в регуляции экспрессии генов в нормальных гепатоцитах (Панин Л.Е., 1998; Panin L.E., е.а., 2002). Они связаны с рецептор-обусловленным эндоцитозом макрофагами фракции липопротеинов высокой плотности третьего подкласса и стероидных гормонов, формированием биологически активного комплекса, в состав которого входит аполипопротеин A-I и восстановленные формы стероидных гормонов (тетрагидросоединения), последние образуются в макрофагах при участии 5а- и 5|3-редуктаз (Sawyer N.J., е.а., 1964). Образовавшийся комплекс попадает в ядра гепатоцитов, где взаимодействует с депротеинизированными участками ДНК. Взаимодействие осуществляется в области повторов типа (GCC)n. Происходит разрыв водородных связей между парами азотистых оснований с образованием однонитевых участков, с которыми
взаимодействует РНК-полимераза. Это ведет к усилению экспрессии генов. Предварительные данные, полученные в Институте биохимии СО РАМН позволяют предполагать, что аналогичный механизм регуляции экспрессии генов существует и в опухолевых клетках, В таком случае скорость опухолевого роста будет зависеть от функционального состояния макрофагов, которые всегда присутствуют в большом количестве в опухолевых тканях.
В связи с этим, целью нашего исследования являлось изучение роли макрофагов в метаболизме липопротеинов плазмы крови в норме и в условиях опухолевого роста.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности поглощения и метаболической деградации липопротеинов плазмы крови макрофагами в норме и в условиях опухолевого роста.
2. Выяснить участие липопротеинов крови в комплексообразовашш с эндотоксином (липополисахарид из Escherichia coli) и полисахаридами (карбоксиметилированный P-D-гликан и сульфоэтилированный p-D-гликан) и направленном транспорте их в макрофаги.
3. Изучить влияние полисахаридов на содержание в макрофагах регуляторных белков аполипопротеина Е и ингибитора цистеиновых протеиназ - цистатина С в норме и в условиях опухолевого роста.
Научная новизна. Впервые показано, что поглощение и метаболическая деградация белкового компонента липопротеинов (как ЛПНП, так и ЛГТВП) перитонеальными макрофагами мышей с НА-1 гепатомой снижено по сравнению с контрольными клетками.
Впервые на культуре перитонеальных макрофагов показано, что процесс их инкубации сопровождается появлением пика белковой флуоресценции с максимумом 335-336 нм, свидетельствующей о секреции макрофагами в среду инкубации белков и продуктов
перекисного окисления липидов (460 нм). При инкубации макрофагов с ЛГШП количество секретированных продуктов перекисного окисления липидов повышалось. Впервые показано стимулирующее влияние тетрагидрокортизола на поглощение и метаболическую деградацию белкового компонента липопротеинов высокой плотности (аполипопротеина A-I) как нормальными, так и опухолевыми клетками.
Связывание полисахаридов (липополисахарида из Escherichia coli (ЛПС), карбоксиметилированного p-D-гликана (КМГ) и сульфоэтилированного P-D-гликана (СЭГ)) с липопротеиновыми фракциями сопровождалось изменением интенсивности триптофановой флуоресценции, коротковолновым сдвигом максимума и увеличением электрофоретической подвижности ЛП-фракций к аноду.
Впервые показано, что спектр внутриклеточных белков макрофагов с НА-1 гепатомой значительно отличается от нормальных клеток: снижено содержание низкомолекулярных белков (6-12 кДа) и повышено содержание высокомолекулярных белков.
Показано, что полисахариды (ЛПС, КМГ и СЭГ) повышали
внутриклеточное содержание аполипопротеина Е в контрольных
макрофагах. В опухолевых клетках полисахариды снижали
внутриклеточное содержание аполипопротеина Е в
высокогликозилированной препроформе, но увеличивали содержание апоЕ в дегликозилированной форме.
Впервые показано влияние липопротеинов на секрецию ингибитора цистеиновых протеиназ - цистатина С перитонеальными макрофагами мышей в норме и при опухолевом росте.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования позволяют глубже понять механизмы поглощения и метаболической деградации липопротеинов макрофагами в норме и при опухолевом росте. Полученные результаты свидетельствуют о том, что
скорость опухолевого роста зависит от функциональной активности макрофагов, а именно: от их способности к синтезу и секреции аполипопротеина Е, что имеет принципиальное значение в противоопухолевой защите организма.
Исследования по оценке характера и степени связывания липопротеинов. плазмы крови с полисахаридами очень важны для оценки роли изучаемых комплексов в ответе организма на инфекционные агенты. Полученные результаты могут служить примером возрастающей очевидности взаимоотношений между функциональной активностью иммунокомпетентных клеток и липидиым обменом.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Поглощение и метаболическая деградация макрофагами белкового компонента липопротеинов низкой и высокой плотности при опухолевом росте снижено по сравнению с контролем.
Тетрагидрокортизол - восстановленная форма кортизола повышает поглощение и метаболическую деградацию белкового компонента ЛПВП макрофагами.
Липопротеины плазмы крови образуют комплексы с эндотоксином (липополисахарид из Escherichia coli) и полисахаридами (карбоксиметилированный p-D-гликан и сульфоэтилированный J3-D-гликан).
Спектр внутриклеточных белков макрофагов с НА-1 гепатомой значительно отличается от нормальных клеток. Снижено содержание низкомолекулярных белков (6-12 кДа) и повышено содержание высокомолекулярных белков.
Липопротеины оказывают стимулирующее влияние на секрецию цистатина С перитонеальными макрофагами мышей в норме и при опухолевом росте.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационного исследования доложены на III молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2001); III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммуиореактивности» (Красноярск, 2004); I Съезде физиологов СНГ «Научные труды I Съезда физиологов СНГ» (Сочи, 2005). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающих 31 отечественных и 189 зарубежных источника. Материалы диссертации изложены на 141 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 35 рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии СО РАМН.
Общие представления о липопротеинах
Одной из самых больших групп сложных сывороточных белков крови являются липопротеины (ЛП). Липопротеины впервые были описаны Машбефом в 1929 г. Было показано, что белково-липидные комплексы -это слолсные молекулярные ассоциации, относительно устойчивые к действию органических растворителей и разрушающиеся при обработке крови денатурирующими или поверхностно-активными веществами. Соединения содержали белок, названный позднее белком Машбефа, и липиды: лецитин и эфиры холестерина, а по электрофоретической подвижности ЛП белки соответствовали глобулинам. Липопротеины осуществляют транспорт липидов из мест их всасывания и синтеза в жировые депо или другие органы, в которых происходит дальнейшая утилизация липидов, а также обеспечивают нормальный обмен липидов между кровью и клетками организма. Это, по-видимому, основная роль ЛП (Панин Л., Поляков Л., 1987; Панин Л. и др., 1992).
Одним из характерных свойств ЛП является их гетерогенность. В связи с этим следует отметить, что в настоящее время единая классификация ЛП отсутствует. В основу существующих классификаций легли такие свойства ЛП как: их плавучая плотность при ультрацентрифугировании, электрический заряд частиц и состав белковых компонентов, так называемых, апопротеинов или правильнее аполипопротеинов (апо) (КлимовА., 1999).
По классификации, основанной на разделении ЛП методами ультрацентрифугирования в градиентах плотности солевых растворов, выделяют: хиломикроны (ХМ) с плотностью менее 0,950 г/мл, ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП) с плотностью 0,950 - 1,006 г/мл, ЛП низкой
плотности (ЛПНП) с плотностью 1,006 - 1,063 г/мл и ЛП высокой плотности (ЛПВП) с плотностью 1,063 - 1,210 г/мл (Климов А., 1999).
Согласно другой классификации, основанной на разделении ЛП методами электрофореза, выделяют ХМ, пре-бета-ЛП (ЛПОНП), бета-ЛП (ЛПНП) и альфа-ЛП (ЛПВП). ЛП указаны в порядке повышения электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле, в котором разделение происходит не только по заряду, но и по размеру частиц. Характер разделения ЛП при электрофорезе на бумаге, агарозе или ацетатцеллюлозе несколько иной (Климов А., 1999).
ЛП, несмотря на существенные различия, имеют и черты сходства. Все они представляют собой соединения, состоящие из белка, триглицеридов, фосфолипидов, холестерина и его эфиров. ЛП хорошо растворимы в водных средах за счет наружной белковой части и полярных головок фосфолипидов, обладающих зарядом. величина гидрофобного ядра. Поверхностный слой составляет около 2,2 нм. Обработанные смесью органических растворителей (хлороформ-метанол, этанол-диэтиловый эфир и др.) ЛП теряют свой липидный компонент и разрушаются. Очистка и разделение делипидированных ЛП с помощью хроматографических и иммунохимических методов позволили в настоящее время выделить около 20 различных апопротеинов, отличающихся друг от друга по аминокислотному составу, вторичной структуре и свойствам (ICostner К., 2002).
Алауповиком (Alaupovic, 1971) была предложена концепция о существовании семейств ЛП, характеризующихся определенным белковым набором (А, В и С). В зависимости от количества липидного компонента члены одного семейства могут иметь различные коэффициенты флотации, электрофоретическую подвижность и появляться во фракциях ЛП с различной плотностью. Частицы, в составе которых присутствует только один тип апопротеинов, еще называют первичными ЛП.
В дальнейшем ABC-система классификации семейств ЛП существенно осложнилась в связи с тем, что были открыты новые белковые компоненты. Оказалось, что апоА и апоС представляют собой группы, состоящие из нескольких белков. Их стали обозначать римскими цифрами, например, A-I, А-П, A-IV, C-I, С-П, С-Ш. Учитывая перекрестное распределение апопротеинов внутри одного класса ЛП, их различия по свойствам, скорости катаболизма и т.д. эта классификация оказалась также несовершенной (Alaupovic, 1971).
Следует заметить, что приведенные классификации не исключают, а в определенной степени, дополняют одна другую и в настоящее время используются в равной мере. Гетерогенность ЛП обусловлена разнообразием апоЛП. Молекулярная масса у различных апоЛП варьирует от 550 000 Да - у апоВ до 6500 Да - у апоС (Климов А., 1999). Биосинтез апоЛП и механизм его регуляции изучен недостаточно полно. Однако известно, что основными местами синтеза являются печень и тонкий кишечник. Обнаружено, что синтез апоЛП может происходить и в других тканях. Есть данные о синтезе апоВ в почках петушков (Blue, е.а., 1980), а также о синтезе апоА в скелетных мышцах цыплят (Tarugi, е.а., 1989). Показан синтез апоЕ в мозге, коре надпочечников, почках, селезенке и яичниках (Reue, е.а., 1984; Elshoursbagy, е.а., 1985). Синтез апоЛП является лимитирующим звеном в процессе образования и секреции ЛП. Это следует из экспериментов с использованием ингибиторов белкового синтеза - пуромицина или циклогексимида (Janero, е.а., 1983; Hahn, е.а., 1992).
Молекулярные массы, основные места синтеза, распределение в плазме и возможные функции апоЛП приведены в таблице 1. Функции апоЛП можно отчетливо разделить на три категории: активация внеклеточных ферментов, связывание с рецепторами, участие в синтезе липопротеиновых частиц de novo.
Значительная часть апоЛП (В, Е, D,C-III) являются гликопротеинами, содержащими в своем составе углеводы: галактозу, маннозу, глюкозамин, фукозу и сиаловые кислоты. Наличие углеводов обуславливает значительную гетерогенность апоЛП, которая проявляется при изоэлектрическом фокусировании, а также в известном колебании молекулярных масс при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Так апоС-Ш существует в трех изоформах, отличающихся по содержанию сиаловых кислот (0, 1, или 2 остатка на молекулу белка), это: апоС-Ш-0, апоС-Ш-1 и апоС-Ш-2 (Климов А., 1999).
Скевенджер-рецепторы
Нами в качестве модели метаболической деградации ЛП макрофагами изучено влияние на ЛПНП протеолитического фермента трипсина. На рис. 11 представлены результаты электрофоретического переноса на нитроцеллюлозную мембрану белков ЛПНП, проинкубированных с мышиными резидентными МФ, где количество дополнительных полос было не менее 10 (дорожка 2), а также после гидролиза ЛПНП трипсином в концентрации 10 мкг/мл среды, где также появились дополнительные фракции, проявляющие иммунореактивность к антителам против аполипопротеина В человека (дорожка 3). На обеих дорожках картины были схожими. Отчетливую иммунореактивность проявили белковые фрагменты с молекулярными массами от 100 до 10 кДа (до 15 фракций). Следует отметить, что картина распределения белков на блоте, сохраняющих иммунореактивные эпитопы, в целом, соответствовала полученной после электрофоретического разделения ЛПНП и продуктов их гидролиза в ПААГ при окраске с помощью Кумасси G-250. Таким образом, повышение скорости миграции липопротеиновых частиц к аноду при электрофорезе в агарозном геле и повышение электроотрицатьности заряда свидетельствует о лимитированном протеолизе и частично об окислительной модификации макрофагами белкового компонента ЛПНП. Появление дополнительных низкомолекулярных фрагментов апоВ, по данным электрофореза в SDS ПААГ, подтверждает участие макрофагов в метаболической деградации (протеолитическом расщеплении) белкового компонента липопротеинов. Скорость опухолевого роста зависит от функционального состояния макрофагов. В Институте биохимии СО РАМН впервые описано участие резидентных макрофагов в регуляции экспрессии генов в гепатоцитах. Мы полагаем, что подобный механизм может участвовать в пролиферации опухолевых клеток. В связи с этим нами были изучены поглощение и метаболическая деградация липопротеинов различных классов как нормальными МФ (контроль), так и опухолевыми клетками (МФ мышей с НА-1 гепатомой).
Липопротеины низкой и высокой плотности человека инкубировали с перитонеальными контрольными и опухолевыми макрофагами мышей. После инкубации клетки дважды промывали средой RPMI-1640 для удаления неприкрепившихся клеток и лизировали 0,5% дезоксихолатом натрия и 1% Тритоном Х-100. Методами электрофореза в ПААГ, иммуноэлектроблоттинга исследовали поглощение и внутриклеточную деградацию белкового компонента ЛП. На рис. 12 представлена электрофореграмма внутриклеточных белков контрольных и опухолевых макрофагов мышей, а также после инкубации их с ЛПВП. На рисунке видно, что спектры внутриклеточных белков опухолевых и контрольных макрофагов резко отличаются между собой (сравните 1 и 5 дорожки). В белковом спектре лизатов макрофагов мышей с экспериментальной НА-1 гепатомой содержалось значительно меньшее количество низкомолекулярных белков, соответствующих по подвижности белкам семейства апопротеинов С. Следует отметить, что молекулярные массы этих белков совпадают или близки молекулярным массам некоторых цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-ос). С другой стороны содержание средне- и высокомолекулярных белков в опухолевых макрофагах было выше по отношению к контролю.
Присутствие в среде инкубации ЛПВП в течение 2-х часов приводило к поглощению их макрофагами (дорожки 2 и 4). Среди внутриклеточных белков МФ в клеточном лизате появился белковый банд, соответствующий по молекулярной массе аполипопротеину A-I (28,3 кДа). Относительное количество ЛПВП, поглощенных макрофагами мышей с НА-1 гепатомой, было значительно ниже такового в нормальных клетках.
Молекулярные механизмы участия резидентных макрофагов в регуляции экспрессии генов в гепатоцитах связаны с рецепторно-обусловленным эндоцитозом МФ ЛПВПз фракции и стероидных гормонов, формированием биологически-активного комплекса между апоА-I и восстановленных форм стероидных гормонов (тетрагидрокортизола) (Усынин И.Ф., 1996).
Исследование поглощения и метаболической деградации белкового компонента липопротеинов нами осуществлялось после добавления в среду инкубации тетрагидрокортизола в концентрации 1х10 6М. На рис. 13 представлена электрофореграмма внутриклеточных белков макрофагов, полученных от мышей с экспериментальной НА-1 гепатомой, инкубированных с ЛПВП в присутствии и в отсутствии гормона. На дорожках 3 и 4 отчетливо видно стимулирующее влияние тетрагидрокортизола на поглощение основного белкового компонента липопротеинов высокой плотности опухолевыми макрофагами. Также, как и на рис. 12 среди внутриклеточных белков МФ в клеточном лизате появляется белковый банд, соответствующий по молекулярной массе аполипопротеину A-I (М.м.=28,3 кДа), дорожки 3, 4.
Методом иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических анти-апоА-1-антител, показано стимулирующее влияние тетрагидрокортизола на поглощение и метаболическую деградацию основного белкового компонента липопротеинов высокой плотности (аполипопротеина A-I) как нормальными, так и опухолевыми макрофагами (рис.14).
Толл-подобные рецепторы (TLR)
В настоящее время внимание исследователей обращено на выяснение роли липопротеинов в транспорте ксенобиотиков и различных биологически активных веществ (Поляков Л.М., 1998, Поляков Л.М., Панин Л.Е., 1998, 2000). Имеются данные, что липопротеины наряду с липополисахарид-связывающим белком (lipopolysaccharid binding protein) также могут являться переносчиками полисахаридов в плазме крови (Vreugdenhil, е.а., 2001).
Поэтому нами было проведено изучение роли липопротеинов в связывании бактериального липополисахарида (ЛПС), карбоксиметилированного гликана (КМГ) и сульфоэтилированного гликана (СЭГ). Для установления характера и степени связывания липопротеинов с вышеперечисленными лигандами использовали метод тушения триптофановой флуоресценции.
Высокая специфичность и чувствительность флуоресцентных методов позволяет их широко применять для анализа взаимодействий типа "белок-лиганд" (Лакович Дж., 1986). В Институте биохимии СО РАМН показано, что при взаимодействии ЛП с некоторыми лигандами (стероидные гормоны, тироксин, бенз(а)пирен) изменяются оптические свойства белка (Поляков Л.М., 1998, Часовских М.И. и соавт., 1992). Характерный коротковолновый сдвиг флуоресценции триптофанилов в структуре ЛП легко объяснятся особенностями микроокружения: полярного для водного раствора триптофана и неполярного (липидного) в структуре ЛП-частиц. Взаимодействие стероидных гормонов и тироксина с ЛІТВП сопровождалось тушением флуоресценции триптофана. При этом форма спектра, его полуширина практически не изменялись. Наблюдался небольшой голубой сдвиг на 1-3 нм, что объясняется локальными информационными перестройками белкового компонента ЛП после взаимодействия его с гормоном. Наибольшее снижение флуоресценции было показано для ЛПВП (55-65%). Значительно менее выраженный данный эффект был при взаимодействии со стероидными гормонами ЛПОНП и ЛПНП, соответственно на 30-35% 15-20%. Тушение флуоресценции для тироксина и стероидных гормонов носило насыщаемый характер и достигало максимума при определенном молярном соотношении лиганда с белком (Панин Л.Е. и соавт., 1992, Биушкина Н.Г. и соавт., 1992).
В настоящем исследовании показано, что взаимодействие полисахаридов с ЛП-фракциями сопровождалось изменением интенсивности триптофановой флуоресценции и, как правило, небольшим коротковолновым сдвигом максимума от 2 до 6 нм, что, вероятно, обусловлено тушением триптофановых люминофоров и относительным увеличением вклада общей белковой флуоресценции за счёт тирозина (рис. 23). Взаимодействие ЛПС с ЛПВП сопровождалось увеличением флуоресценции триптофана на 25%, а при взаимодействии ЛПС с ЛПНП наблюдалось выраженное тушение флуоресценции на 35-40%. Взаимодействие ЛПОНП с ЛПС сопровождалось увеличением флуоресценции триптофана на 10% (рис. 24). 1 При анализе взаимодействия перечисленных полисахаридов с изолированным, электрофоретически чистым аполипопротеином апоА-1 наблюдалось снижение флуоресценции триптофана (рис. 25) Так при взаимодействии апоА-I с ЛПС , КМГ и СЭГ наблюдалось снижение флуоресценции на 20%, 40% и 10% соответственно, то есть, особенно это было выражено при связывании апоА-I с КМГ.
Таким образом, методом тушения триптофановой флуоресценции установлено, что в процессах комплексообразования липопротеинов с полисахаридами (ЛПС, КМГ, СЭГ) принимает участие белковый компонент липопротеинов, при этом переносимые лиганды связываются на поверхности ЛП-частиц. Судя по всему, механизм образования таких комплексов, как ЛПС-ЛП, КМГ-ЛП и СЭГ-ЛП, в большей части, можно отнести к типичному лиганд-рецепторному взаимодействию. В целом, взаимодействия ЛП-частиц с полисахаридами приводило к таким конформационным изменениям структуры белка.
Связывание липополисахаридов с различными классами липопротеинов нами исследовалось также с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (рис. 26). Поскольку ЛПС является отрицательно заряженной структурой за счет остатков фосфорной кислоты, его взаимодействие с липопротеинами должно увеличивать скорость миграции липопротеиновых частиц к аноду.
На представленном рисунке хорошо видно, что добавление ЛПС к ЛПНП в концентрации 10 мкг/мл практически не влиял на электрофоретическую подвижность ЛП-частиц (рис,26 А, дорожка 2). Однако при концентрации ЛПС 20 мкг/мл электрофоретическая подвижность ЛПНП возрастала, что свидетельствует о значительном увеличении отрицательного заряда и модификации белкового компонента липопротеиновых частиц (рис. 26 А, дорожка 3).
При инкубации ЛПВП и ЛПОНП с ЛПС (10 и 20 мкг/мл) мы наблюдали увеличение отрицательного заряда ЛП-частиц и их электрофоретической подвижности пропорционально количеству добавленного ЛПС (А, дорожки 5, 6; Б, дорожки 2, 3). При этом увеличивалась скорость миграции к аноду как второго, так и третьего подкласса ЛПВП.
При анализе взаимодействия изолированного, электрофоретически чистого апоА-I с ЛПС (10 и 20 мкг/мл) скорость электрофоретической подвижности увеличивалась пропорционально количеству добавленного полисахарида (рис. 26 Б).
Таким образом, комплексообразование липопротеинов с полисахаридами сопровождается увеличением отрицательного заряда ЛП-частиц и скорости миграции при электрофорезе в геле агарозы. Это явление, вероятно, можно объяснить модификацией положительно заряженных остатков аргинина и лизина белкового компонента ЛП-частиц за счет ионного взаимодействия с отрицательно заряженными остатками фосфорной кислоты молекулы липополисахарида. В дальнейших исследованиях важно было оценить, как влияют одни полисахариды или добавленные в среду инкубации вместе с ЛПВП или ЛПНП на функциональную активность нормальных и опухолевых макрофагов.
Изучение образования комплексов липопротеинов с полисахаридами бактериального и дрожжевого происхождения
В Институте биохимии СО РАМН изучены молекулярные механизмы участия резидентных макрофагов в регуляции экспрессии генов в нормальных гепатоцитах (Панин Л.Е., 1998; Panin L.E., е.а., 2002). Они связаны с рецепторно-обусловленным эндоцитозом макрофагами ЛПВП3 фракции и стероидных гормонов, формированием биологически активного комплекса, в состав которого входит аполипопротеин A-I и восстановленные формы стероидных гормонов (тетрагидросоединения). Последние образуются в макрофагах при участии 5а- и 5(3-редуктаз (Sawyer N.J., е.а., 1964). Образовавшийся комплекс попадает в ядра гепатоцитов, где взаимодействует с депротеинизированными участками ДНК. Взаимодействие осуществляется в области повторов типа (GCC)n. Происходит разрыв водородных связей между парами азотистых оснований с образованием однонитевых участков, с которыми взаимодействует РНК-полимераза. Это ведет к усилению экспрессии генов. Предварительные данные, полученные в Институте биохимии СО РАМН позволяют предполагать, что аналогичный механизм регуляции экспрессии генов существует и в опухолевых клетках. В таком случае скорость опухолевого роста будет зависеть от функционального состояния макрофагов, которые всегда присутствуют в большом количестве в опухолевых тканях. В связи с этим, нами было изучено влияние печеночных и перитонеальных макрофагов на метаболическую деградацию липопротеинов различных классов в норме и при опухолевом росте. Метаболическую деградацию липопротеинов низкой плотности мышиными перитонеальными макрофагами изучали с помощью электрофореза в геле агарозы. Исследование электрофоретической подвижности ЛПНП показало, что 2-х часовая инкубация макрофагов с ЛПНП изменяет скорость миграции липопротеиновых частиц к аноду. Для сравнительной оценки метаболической деградации липопротеинов макрофагами проведены аналогичные исследования с полиморфноядерными лейкоцитами - нейтрофилами. Поскольку известно, что нейтрофилы не только оказывают влияние на функцию макрофагов, но также проявляют цитолитический и цитостатический эффект на опухолевые клетки, действуют на систему комплемента. Нейтрофилы играют важную роль в тканевом метаболизме, осуществляя присущую им секреторную деятельность (Лаврова B.C., и др., 1992). Взаимодействуя с бактериальными токсинами, нейтрофилы вырабатывают и выделяют в окружающую среду различные цитокины. Цитотоксический потенциал нейтрофилов по отношению к опухолевым клеткам существенно повышает ИЛ-6. Противоопухолевым действием обладает и ИЛ-12 (Scliwarz А., е.а., 2002). Снижение продукции последнего значительно подавляет противоопухолевую активность МФ (Majumder, е.а., 2002; Hiraki, е.а., 2002). Участие нейтрофилов в фагоцитозе, хемотаксисе, дегрануяяции определяется взаимодействием их с многочисленными лигандами, которые оказывают свое влияние на клетку через рецепторы, имеющиеся как на цитоплазматических, так и на внутренних мембранах. В качестве лигандов выступают лектины, опиоидные пептиды, фрагменты комплемента, антитела, глюкокортикоиды и липопротеины.
Нами не обнаружено влияние нейтрофилов на подвижность ЛПНП в геле агарозы при 2-часовой инкубации. Однако, длительная инкубация в течение 24 часов приводила к повышению скорости миграции ЛП-частиц к аноду, что указывает на возможность участия нейтрофилов в метаболической деградации липопротеинов. Возможна также их окислительная модификация. Так, окислительная модификация апопротеинов в ЛПНП, в частности апо-В-100, приводит к фрагментации белковой цепи, модификации лизиновых остатков ее альдегидами и кетонами, появляющимися в результате распада гидроперекисей, и обогащению карбонильными группами. Все это приводит к увеличению электрофоретической подвижности ЛПНП.
Известно, что в метаболической деградации липопротеинов макрофагами участвуют протеиназы, в частности, МФ секретируют протеолитические ферменты (например, катепсин В, D и др.), способные гидролизовать апоВ. (Белова Л.А., др., 2000). Несмотря на потерю остатков лизина и аргинина из апо-В во время протеолиза, количество "активных" остатков лизина не уменьшается, что указывает на образование новых "активных" остатков лизина во время пространственной реорганизации оставшихся фрагментов апоВ, и/или на устойчивость основных доменов апоВ к протеолитическому расщеплению (Paananen К., Kovanen Р.Т., 1994; Paananen К., е.а., 1995).
В модельных системах Пиха и соавт. (Piha М., е.а., 1995) установили, что протеолиз ЛПНП трипсином, химотрипсином или проназой приводит к образованию и высвобождению фрагментов апоВ из ЛПНП и запускает процесс слияния частиц. При инкубации обработанных протеиназами частиц ЛПНП с макрофагами только агрегированные частицы ЛПНП захватывались и подвергались дальнейшей деградации (Piha М., Lindstedt L., Kovanen Р.Т., 1995). Следовательно, протеолитическая модификация ЛПНП может влиять на их взаимодействие с МФ.
Нами в качестве модели метаболической деградации ЛП макрофагами изучено влияние на ЛПНП протеолитического фермента трипсина. В результате электрофоретического переноса на нитроцеллюлозную мембрану белков ЛПНП, предварительно проинкубированных с МФ, а также после гидролиза ЛПНП трипсином появились дополнительные фракции, проявляющие иммунореактивность к антителам против апоВ. Причем на обеих дорожках картины были схожими. Отчетливую иммунореактивность проявили белковые фрагменты с молекулярными массами от 100 до 10 кДа (до 15 фракций). Следует отметить, что картина распределения белков на блоте, сохраняющих иммунореактивные эпитопы, в целом, соответствовала полученной после электрофоретического разделения ЛПНП и продуктов их гидролиза в ПААГ при окраске с помощью Кумасси G-250. Таким образом, увеличение скорости миграции липопротеиновых частиц к аноду при электрофорезе в агарозном геле и повышение у них электроотрицатьности свидетельствует о лимитированном протеолизе и частично об окислительной модификации белкового компонента ЛПНП при инкубации их с макрофагами. Появление дополнительных низкомолекулярных фрагментов апоВ, по данным электрофореза в SDS ПААГ, подтверждает участие макрофагов в метаболической деградации (протеолитическом расщеплении) белкового компонента липопротеинов.
