Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы «Роль клеточных и гуморальных факторов в формировании резистентности организма к вирусу гриппа»
1.1. Вирус гриппа и его репродукция в клетках-мишенях. Механизмы повреждения респираторных органов при вирусной гриппозной инфекции
1.2. Влияние экзогенных и эндогенных факторов на инфекционность вируса гриппа, восприимчивость клеток-мишеней и резистентность организма к вирусу гриппа
1.2.1. Система интерферона 20
1.2.2. Генетически опосредованная врожденная резистентность к ортомиксовирусам - ген Мх
1.2.3. Клетки неспецифического противовирусного иммунитета —нейтрофилы и макрофаги
1.2.4. Особенности гемагглютинина ВГ, обусловливающие тропизм вируса к различным тканям и его инфекционность
1.2.5. Воздействие экзогенных факторов на ВГ и резистентность к ВГ организма хозяина
1.2.6. Значение белков сурфактанта для защиты легких от вирусной гриппозной инфекции
1.3 Влияние глюкокортикоидов на общую резистентность организма и восприимчивость клеток-мишеней к вирусу гриппа
1.4 Влияние глюкокортикоидов на функциональную активность нейтрофилов и макрофагов бронхоальвеолярного тракта как факторов резистентности при вирусной гриппозной инфекции
1.5 Легкие как орган секвестрации и метаболизации нейтрофилов в норме и при инфекционном воспалении.
Механизмы реализации и значение этой функции легких в развитии воспалительного процесса
2 Материалы и методы 62
2.1. Лабораторные животные 62
2.2. Вирус гриппа и определение его концентрации 62
2.3. Используемые препараты 63
2.4. Определение почечных индексов (ПИ) органов мышей 65
2.5. Получение первичных культур клеток легких и трахеи 65
2.6. Цитологические исследования 66
2.7. Получение бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ)
2.8. Получение монослоя клеток БАЛЖ мышей 68
2.9. Определение фагоцитарной активности АМф и Нф(а) БАЛЖ 68
2.10. Определение потенциальной биоцидной активности АМф и Нф(а) БАЛЖ по продукции ими супероксид-анионрадикалов
в НСТ-тесте
2.11. Интраназальное заражение животных ВГ и определение 50% летальной дозы (ЛД5о) ВГ
2.12. Аэрозольное заражение животных и определение 50% аэрогенной инфицирующей дозы (АИД5о) для легких и трахеи мышей
2.13. Оценка восприимчивости к ВГ клеток легких и трахеи in vitro
2.14. Определение наличия ВГ в ткани легких и трахеи или в суспензии клеток легких и трахеи
2.15. Определение титра интерферона в легких 73
2.16. Микроскопические исследования тканей органов мышей 73
2.17. Статистические методы 74
2.18. Экспериментальные группы мышей и схемы введения препаратов
3 Результаты собственных исследований 78
3.1. Изучение влияния глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога на органы-мишени для ГКГ и клетки крови у мышей. Выбор доз и схем введения кеналога для последующего моделирования и исследования пониженной резистентности мышей к вирусу гриппа
3.2. Изучение показателей резистентности мышей к вирусу гриппа A/Aichi/2/68 после предварительного введения глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога
3.3. Изучение восприимчивости клеток-мишеней и активности фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа после введения глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога
3.4. Изучение возможности коррекции пониженной резистентности к вирусу гриппа, возникающей после введения глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога, с помощью иммуностимулятора хитокарбоксиметилглюкана
4 Обсуждение результатов собственных исследований 136
Выводы 147
Список использованной литературы
- Влияние экзогенных и эндогенных факторов на инфекционность вируса гриппа, восприимчивость клеток-мишеней и резистентность организма к вирусу гриппа
- Влияние глюкокортикоидов на общую резистентность организма и восприимчивость клеток-мишеней к вирусу гриппа
- Определение почечных индексов (ПИ) органов мышей
- Изучение восприимчивости клеток-мишеней и активности фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа после введения глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога
Введение к работе
АИДзо - 50% аэрогенная инфицирующая доза вируса АМф - альвеолярные макрофаги БАЛЖ - бронхоальвеолярная лаважная жидкость в/б - внутрибрюшинное введение (внутрибрюшинно) в/м - внутримышечное введение (внутримышечно) ВАЖ - вирусаллантоисная жидкость ВГ - вирус гриппа ГК - глюкокортикоиды д^ЗГ — зимозановые гранулы с отложениями диформазана ЕК - естественные (натуральные) киллеры ЗГ - зимозановые гранулы (зимозан) и/н - интраназальное введение (интраназально) ИД50 - 50% инфицирующая доза вируса ИЛ - интерлейкин ИПАР - индекс продукции анионрадикалов ИФН - интерферон КИДзоН - 50%) клеточная инфицирующая доза вируса, нормированная на 1 млн. клеток — кеналог
• 50%) летальная доза вируса
• лейкоциты
• лимфоциты
• макрофаги
• моноциты
• нейтрофилы
• нейтрофилы в бронхоальвеолярной лаважной жидкости
• после заражения
• подкожное введение (подкожно) п и - почечные индексы (органов: тимуса, селезенки, надпочечника,
печени)
РГА - реакция гемагглютинации РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы РНК - рибонуклеиновая кислота РХ - раствор Хенкса СМФ - система мононуклеарных фагоцитов ТВЛ - титры вируса в легких УПАР - удельная продукция анионрадикалов УФА - удельная фагоцитарная активность ФНОа - фактор некроза опухолей а ЭИДзо - 50% эмбриональная инфицирующая доза вируса С - концентрация вируса гриппа в аэрозоле НА, Н - гемагглютинин вируса гриппа Ig - десятичный логарифм I95 - 95%-й доверительный интервал М - среднее значение m - ошибка среднего N - число клеток в крови, БАЛЖ или препаратах п - количество наблюдений/образцов, количество животных NA, N - нейраминидаза вируса гриппа Р - достоверность отличия, доверительная вероятность р - вероятность ошибки, уровень значимости р - коэффициент осаждения аэрозоля Т - время экспозиции в аэрозоле W - объемная скорость дыхания ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Огромную роль в формировании резистентности организма к вирусу гриппа А играют факторы неспецифического или врожденного иммунитета: внеклеточные (термолабильные р-липопротеины, компоненты слизи и сурфактанта) и клеточные, к которым относятся макрофаги, нейтрофилы и естественные киллеры в органах дыхания [http://www.immun.ru/immun/mme/mme2; Медуницын Н.В., 2004; Kamps B.S. and Reyes-Teran G. 2006; Mayer G., 2006; Пак Г. и др. 2008]. При этом фагоциты (макрофаги и нейтрофилы) представляют собой первую линию противовирусной защиты, препятствуя продуктивной адсорбции вируса гриппа на клетках-мишенях, тогда как естественные киллеры распознают и уничтожают уже инфицированные, вируспродуцирующие клетки [Шишкина Л.Н. и др., 2001; Le Vine A.M. et al., 2002; Hawgood S. et al., 2004; Медуницын H.B., 2004; Санин A.B., 2005; Mayer G., 2006; Мейл Д. и др., 2007; Маянский Д.Н., 2008].
Немаловажную роль играет локальная воспалительная реакция, опосредованная неспецифическими клетками-эффекторами (прежде всего макрофагами и нейтрофилами) и гуморальными медиаторами (цитокинами, протеазами, активными формами кислорода, фрагментами комплемента и пр.), которая направлена на ограничение распространения вируса в организме и его фиксации в воротах инфекции. Позже, по мере развития инфекционного процесса, подключаются антиген-специфические факторы иммунитета [Мейл Д. и др., 2007; Пак Г. и др. 2008; http://www.immun.ru/immun/mme/mme2].
Резистентность организма к вирусам зависит от функционального состояния его основных физиологических систем, в регуляции которого принимают участие глюкокортикоидные гормоны. Известно, что глюкокортикоидные гормоны являются необходимым действующим началом при возникновении стрессовых ситуаций, требующих мобилизации адаптационных возможностей организма [Федоров Б.М., 1991; Похилько А.В. и др., 1995; http://www.clinpharma.com]. Однако в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях было показано, что стресс вызывает в организме человека и животных снижение количества Т- и Влимфоцитов в периферической крови, подавление первичного и вторичного иммунного ответа на различные антигены, снижение активности ЕК и Мф, подавление способности клеток продуцировать интерферон и т.д. Полагают, что все эти эффекты могут быть обусловлены повышением уровня циркулирующих глюкокортикоидных гормонов [http://www.clinpharma.com; http://medic.claw.ru/mz_2ClS.htm; Sheridan J.F. et al., 2000; Frustaci A. et al., 2003]. Кроме того, на фоне стресса у экспериментальных животных наблюдается активация латентных вирусных инфекций и более тяжелое течение инфекционных заболеваний, в том числе гриппа, а так^се подавление специфического иммунного ответа при вакцинации [Парусов В.Н., 1981; Фролов Б.А. и др., 1991; Похилько А.В. и др., 1995; Ожерелков С В . и Кожевникова Т.Н., 2005; Villard J., 2006].
Глюкокортикоиды широко используются в клинической практике в качестве средств неотложной терапии и для коррекции ряда гипериммунных состояний, а таюке в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся агранулоцитозом [McGivney S.A. and Ogirala R.G., 1994; Сигидин Я.А. и др., 1994; Машковский М.Д., 1998; Barnes P.J., 1998; van der Velden V.H., 1998; Ozkiris A. and Erkilic K., 2005; http://www.clinpharma.com]. В отличие от цитостатиков иммуносупрессивные свойства глюкокортикоидов не связаны с митостатическим действием. Их эффект является результатом подавления разных этапов иммуногенеза: миграции стволовых и В-клеток, взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, торможения высвобождения цитокинов из лимфоцитов и макрофагов и других реакций иммунной системы [Машковский М.Д., 1998].
Несмотря на то, что глюкокортикоиды являются ценными терапевтическими средствами, они могут вызывать ряд побочных эффектов, в том числе понижение сопротивляемости к различным инфекциям [Машковский М.Д., 1998]. При этом даже с учетом того, что глюкокортикоиды обладают иммунодепрессивным и противовоспалительным влиянием, нельзя дать однозначного и полного ответа, почему глюкокортикоиды повышают подверженность организма инфекционным заболеваниям, в том числе гриппу, и усиливают тяжесть их течения.
Вместе с тем хорошо известно, хотя и остается без должного внимания иммунологов и инфекционистов, что глюкокортикоиды вызывают ускорение созревания и выход нейтрофилов из синусов костного мозга, способствуя возникновению нейтрофилеза в крови [Горизонтов П.Д., 1981; Шишкина Л.Н. и др., 1987; Шишкина Л.Н. и др., 1988; Машковский М.Д., 1998; Fukakusa М. et al., 2005]. При этом есть доказательства того, что избыточное количество циркулирующих нейтрофилов удаляется из организма главным образом через легкие, которые являются одним из мест секвестрации и метаболизации нейтрофилов [Cohen А.В. and Rossi М., 1983; Шишкина Л.Н. и др., 1987; Шишкина Л.Н. и др., 1988; Игнатьева М.И. и др., 1993; Suwa Т. et al., 2001; Bums A.R. et al., 2003].
Что касается роли нейтрофилов в защите организма от вируса гриппа и в развитии инфекционного процесса, то до сих пор она остается спорной и неоднозначной [Jakab G.J. et al., 1983; Fujisawa H., 2001; Пак Г. и др., 2008].
Известно, что количество нейтрофилов и макрофагов в легких увеличивается в ответ на размножение вируса гриппа в клетках-мишенях [Jakab G.J. et al., 1983; Шишкина Л.Н. и др., 2001; Fujisawa Н, 2001; Wareing M.D. et al., 2007; Пак Г. и др., 2008; Teske S. et al., 2008]. Однако остаются практически не изученными роль макрофагов и нейтрофилов в развитии осложнений и возможность коррекции патологических процессов при гриппе, часто возникающих на фоне повышенного уровня глюкокортикоидов в организме.
Считают также, что восприимчивость клеток-мишеней респираторных органов к вирусу гриппа определяет дальнейшее развитие инфекционного процесса [Wijburg O.L. et al., 1997; Маянский А.Н., 1999]. Однако неизвестно, каким образом повышенный уровень глюкокортикоидов влияет в целом на течение гриппозной инфекции, и в частности, на восприимчивость клетокмишеней респираторных органов к вирусу гриппа. В связи с этим, в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования.
Цель исследования. Разработать экспериментальную модель пониженной резистентности организма к вирусу гриппа и оценить восприимчивость к нему респираторных органов, а также роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в развитии гриппозной инфекции после предварительного введения синтетического глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога на органы-мишени для глюкокортикоидов (тимус, печень, селезенка,
надпочечники) и клетки крови у мышей. Выбрать дозы и схемы введения кеналога для последующего моделирования и исследования пониженной резистентности мышей к вирусу гриппа.
2. Определить показатели резистентности мышей к адаптированному штамму вируса гриппа A/Aichi/2/68 после предварительного введения кеналога.
3. Провести сравнительный анализ показателей восприимчивости легких и трахеи (in vivo) и клеток легких и трахеи (in vitro) к штамму вируса гриппа A/Aichi/2/68 у мышей после предварительного введения кеналога.
4. Исследовать влияние кеналога на особенности функционирования альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в легких у мышей, инфицированных вирусом гриппа.
5. Оценить возможности коррекции пониженной резистентности организма к вирусу гриппа, возникающей после введения кеналога, с помощью имму но стимулятора хитокарбоксимети л глюкана.
Научная новизна работы.
Впервые разработана лабораторная модель пониженной резистентности организма к вирусу гриппа (штамм A/Aiclii/2/68 H3N2), воспроизводимая с помощью однократного подкожного введения глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога в дозе 5 мкг/г массы мыши за 4 сут до заражения вирусом гриппа.
Впервые обнаружено, что после предварительного введения мышам кеналога восприимчивость легких и трахеи (in vivo) и первичной суспензионной культуры клеток легких и трахеи (in vitro) к вирусу гриппа не повышается.
Впервые установлено, что продукция вируса гриппа в легких у животных, предварительно получавших кеналог, в начале инфекционного процесса повышается, а потом понижается относительно контроля из-за ускоренного истончения пула вирус-продуцирующих клеток на ранних сроках развития гриппозной инфекции.
Впервые показано, что у мышей, предварительно получавших кеналог, при инфицировании вирусом гриппа наблюдается снижение доли и функциональной активности альвеолярных макрофагов в легких.
Впервые продемонстрировано, что пониженная резистентность организма к вирусу гриппа у животных, предварительно получавших кеналог, обусловлена более сильными, чем в контроле, повреждениями легких, связанными с увеличением количества и биоцидной активности нейтрофилов.
Впервые показано, что развитие гриппозной инфекции на фоне действия кеналога характеризуется значительным численным и функциональным преимуш,еством нейтрофилов над альвеолярными макрофагами. Доказано, что резкий дисбаланс между популяциями альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, наблюдаемый после введения кеналога и последующего заражения вирусом грипа, является одной из основных причин более тяжелых патоморфологических изменений в легких, что лежит в основе пониженной резистентности и, как следствие, повышенной гибели животных.
Впервые обнаружено, что предварительное введение стимулятора макрофагальной активности хитокарбоксиметилглюкана на фоне индуцированной кеналогом пониженной резистентности мышей к вирусу гриппа обеспечивает ее коррекцию благодаря восстановлению баланса между показателями количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов.
Практическая значимость работы. В данной работе доказано, что соотношение количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости при введении мышам глюкокортикоида кеналога в дозе 5 мкг/г с последующим заражением вирусом гриппа или без него соответствует определенным патоморфологическим изменениям легочной ткани. Эти показатели объективно отражают тяжесть воспалительного процесса и обретают диагностическую и прогностическую ценность в пульмонологии для принятия правильных тактических решений в процессе лечения заболеваний легких, в том числе для предотвращения развития острого респираторного дистресс-синдрома взрослых или других нейтрофил-зависимых повреждений легочной ткани.
Как показано в данной работе, своевременное применение стимуляторов функциональной активности альвеолярных макрофагов, например, хитокарбоксиметилглюкана или его аналогов, может способствовать уменьшению риска развития чрезмерных поврелсдений легочной ткани и возникновения пониженной резистентности организма к вирусу гриппа на фоне применения высоких доз глюкокортикоидов, хронического стресса или гиперкортицизма.
Разработанная нами лабораторная модель пониженной резистентности организма к вирусу гриппа (штамм A/Aichi/2/68 H3N2), воспроизводимая с помощью однократного подкожного введения глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога и последующего заражения вирусом гриппа, может быть рекомендована для тестирования противовирусной, иммуностимулирующей или антипротеазной активности препаратов, которые могут представлять интерес для применения в качестве средств этиотропной или патогенетической терапии гриппа.
Положения, выносимые па защиту:
1. Пониженная резистентность к вирусу гриппа (штамм A/Aichi/2/68 H3N2) у мышей, предварительно получавших глюкокортикоид пролонгированного действия кеналог, характеризуется уменьшением ЛДзо вируса гриппа, повышением степени повреждения легких и летальности животных, увеличением продукции вируса гриппа и снижением концентрации интерферона в легких в ранние сроки после инфицирования вирусом гриппа.
2. При пониженной на фоне действия кеналога резистентности мышей к вирусу гриппа восприимчивость к нему легких и трахеи (in vivo) и первичных суспензионных культур клеток этих органов (in vitro) не повышается.
3. Основной причиной пониженной резистентности организма к вирусу гриппа на фоне действия кеналога является более сильное повреждение легких, которое развивается вследствие дисбаланса между альвеолярными макрофагами и нейтрофилами, возникающего из-за усиленного притока нейтрофилов, индуцированного введением кеналога и заражением вирусом гриппа, и недостаточной функциональной активности альвеолярных макрофагов.
4. Коррекция пониженной резистентности организма к вирусу гриппа, возникающей на фоне действия кеналога, возможна с помощью иммуностимуляторов, обладающих способностью повышать функциональную активность альвеолярных макрофагов, например, хитокарбоксиметилглюкана.
Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены на отечественных и зарубежных конференциях: V Сибирский физиологический съезд, 29.06 - 01.07 2005 г., Томск, Россия;
2-я Международная конференция «Наука-Бизнес-Образование Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда», 10-13 мая 2005, Пущино, Россия;
2-я Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», 20-21 октября 2005 г., Москва, Россия; Biological Medical Defense Conference, October 26-27 2005, Munich, Международная конференция «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 21-23 июня 2006 г., Ульяновск, Россия; III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 27-29 сентября 2006 г., Новосибирск, Россия;
3-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 7-9 ноября 2007 г., Новосибирск, Россия; Международная научно-практическая конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», 20-22 мая 2008 г., Алматы, Казахстан.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи, из них 3 - в журнале Вестник РАМН (2006, 2007) и 1 - на сайте электронного журнала в Интернете (http://www.medline.ru/public/last/).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах, содержит 13 рисунков и 35 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка литературы, содержащего 57 отечественных и 329 зарубежных источников.
Вклад автора в диссертационную работу. Материал диссертации получен и проанализирован лично автором под руководством и при участии к.б.н. Шишкиной Л.Н. Статистическая обработка данных произведена при участии к.т.н, Жукова В.А. Световая и электронная микроскопия препаратов проведена при помощи и участии профессора Рябчиковой Е.И., д.м.н.
Малковой Е.М., к.б.н. Омигова В.В., н.с. Таранова О.С. и ст. лаборанта Филипповой Ю.С. Титры ИФН определены при участии к.б.н. Булычева Л.Е. Аэрозольные исследования сделаны с участием к.б.н. Пьянкова О.В. Вирусологические исследования проведены с помощью н.с. Петрищенко В.А., а также инженеров Окуловой Л.М., Копыловой Е.О. и ст. лаборантов Кириченко Т.Б., Генераловой Т.И, Прудниковой Н.В. и Соловей И.М. Работы с использованием хитокарбоксиметилглюкана выполнены благодаря помощи профессора Короленко Т.А. Всем перечисленным сотрудникам автор выражает огромную и искреннюю благодарность.
Влияние экзогенных и эндогенных факторов на инфекционность вируса гриппа, восприимчивость клеток-мишеней и резистентность организма к вирусу гриппа
Интерфероны представляют собой семейство цитокинов, обладающих противовирусной активностью [Stark G.R. et al., 1998; Samuel C.E., 2001; Lenschow DJ. et al., 2007]. Их подразделяют на два типа [Wang X. et al., 2000; Samuel C.E., 2001; Ellis T.N. and Beaman B.L., 2004]. Интерферон І типа (ИФН-І) известен как вирус-индуцируемый интерферон и включает ИФН-а (лейкоцитарный), ИФН-Р (фибробластный) и ИФН-со. ИФН-І нарабатывается в ответ на инфицирование клеток вирусами. Интерферон II типа (ИФН-И) является иммунным (ИФН-у), поскольку его синтез индуцируется митогенными и антигенными стимулами. Показано, что нейтрофилы способны синтезировать ИФН-а и -Р в культурах, в то время как ИФН-у синтезируется только in vivo определенными клетками иммунной системы (натуральные киллеры (НК), клетки CD4+ ТЫ-типа и С08+-цитотоксические супрессорные клетки) [Samuel С.Е., 2001; Biron С.A. and Sen G.C., 2001; Ellis T.N. and Beaman B.L., 2004].
Вирус гриппа с ыграл ключевую роль в открытии ИФН [Isaacs A . and Lindenmann J., 1957] и в последующем изучении антивирусного действия белков семейства Мх [Lu Y. et al., 1995; Kochs G. and Haller O., 1999].
Еще в 1957 году Alick Isaacs и Jean Lindenmann обнаружили в клетках цыпленка, инфицированных ВГ, растворимый фактор (интерферон), обеспечивающий развитие устойчивости клеток к воздействию как ВГ, так и других различных вирусов [Isaacs A. and Lindenmann J., 1957]. Это оригинальное наблюдение наряду с результатами, полученными Nagano и Kojima в 1958 году, послужило начальной точкой в исследовании системы ИФН и молекулярно-генетических механизмов ее функционирования [Nagano Y. and Kojima Y., 1958].
На рисунке 2 представлены особенности цикла репликации ВГ на фоне действия ИФН-І и ИФН-1-индуцируемого белка Мх. Рисунок 2. Схематическая диаграмма репликативного цикла вируса гриппа, отражающая точки приложения действия интерферон-индуцируемых белков Мх и PKR [Samuel С.Е., 2001]. Вирионы ВГ, имеющие сферическую форму, связываются с поверхностным клеточным рецептором посредством гликопротеина — НА. Эндоцитоз вирусных частиц сопровождается их частичным раздеванием и высвобождением в цитоплазму вирусного нуклеокапсида (волнистые линии соответствуют восьми фрагментам одноцепочечной минус-РНК вируса). Нуклеокапсид транспортируется в клеточное ядро, где осуществляется его первичная транскрипция с помощью вирион-ассоциированной РНК-полимеразы. Затем в цитоплазме происходит трансляция полноразмерных транскриптов. Интерферон-индуцированная протеинкиназа R (PKR) ингибирует данный процесс благодаря фосфорилированию фактора инициации трансляции eIF-2 (eukaryotic initiation factor 2). Вирусный белок NS1, связывающий двуцепочечную РНК, выступает в качестве антагониста PKR. Семейство интерферон-индуцируемых антивирусных белков Мх, по-видимому, оказывает влияние на транспортировку вирусного нуклеокапсида и синтез РНК. Антивирусное действие Мх белков определяется их ГТФ-азной активностью. Вновь синтезированные нуклеокапсиды могут участвовать в последующей транскрипции или экспортироваться в цитоплазму, где происходит сборка новых вирусных частиц, высвобождение которых происходит с помощью цитоплазматической мембраны клетки путем почкования.
ИФН-І играет ключевую роль в ответе организма на гриппозную инфекцию, оказывая стимулирующее действие на многочисленные гены, продуктами которых являются такие антивирусные белки, как протеинкиназа R (PKR) и Мх [Lenschow DJ. et al., 2007]. После прикрепления к поверхности клетки ВГ посредством эндоцитоза проникает в цитоплазму. Этот процесс сопровождается частичным «раздеванием» вириона и выходом вирусного нуклеокапсида в цитозоль. Затем нуклеокапсид транспортируется в ядро клетки, где происходит транскрипция вирусной РНК, катализируемая вирусной РНК-полимеразой, и сборка нового нуклеокапсида, который может участвовать в дальнейшей транскрипции либо экспортироваться в цитоплазму. В последнем случае при взаимодействии с плазматической мембраной клетки образуется новая вирусная частица, способная отпочковаться от «материнской» клетки и в дальнейшем продолжить процесс инфицирования других клеток. Синтезированная под влиянием ИФН-І PKR способна ингибировать процесс трансляции с помощью фосфорилирования eIF-2, что приводит к инактивации накопленного в процессе вирусной репликации NS1-белка ВГ, который связывает двунитчатую РНК (dsPHK). ИФН-1-индуцируемые антивирусные белки семейства Мх воздействуют на процессы транспортировки вирусного нуклеокапсида и синтеза РНК [Samuel С.Е., 2001].
У мышей ИФН-І эффективно работает против ВГ только при наличии белка Mxl, причем большинство мышей инбредных линий несут дефектные аллели гена, кодирующего Mxl [Koerner I. et al., 2007].
Чувствительность различных вирусов к ИФН обычно рассматривают с учетом их интерферон-индуцирующей активности. Отмечено, что наиболее патогенные вирусные штаммы индуцируют ИФН в меньшей степени и, соответственно, меньше подвержены его действию. Это объясняется быстрым ингибированием синтеза клеточных РНК и белков, необходимых для наработки ИФН [Volckaert-Vervliet G. and Billiau А., 1977]. Подобная закономерность справедлива и в отношении ВГ, который является малоактивным индуктором ИФН. Способность стимулировать интерферонообразование установлена для ВГ типа А (субтипы H1N1 и H3N2), В и С [Hayman A. et al., 2006]. Указанное свойство ВГ с наибольшей очевидностью выявляется в опытах на куриных эмбрионах. Культуры тканей, зараженные ВГ, обычно продуцируют невысокие количества ИФН, а перевиваемые клеточные культуры не вырабатывают его вовсе [Соловьев В.Д. и др., 1976]. Чувствительность различных штаммов вируса гриппа к ИФН и их интерферон-индуцирующая активность не могут быть охарактеризованы однозначно, поскольку полученные в этом отношении результаты разнообразны и порой противоречивы. Отмечена различная степень чувствительности ВГ к действию разных типов ИФН в клеточных культурах [Подчерняева Р.Я. и др., 1981]. Тем не менее, штаммы ВГ типа А оказываются в целом более чувствительными к ИФН, чем штаммы ВГ типа В [Соловьев В.Д.и др., 1976].
Интерфероны (особенно ИФН-І) наряду с другими факторами воспалительного ответа, такими как фактор некроза опухоли (ФНО) и интерлейкин-6 (ИЛ-6), начинают синтезироваться в течение 1-х суток после инициации гриппозной инфекции [Fritz R.S. et al., 1999; Van Reeth К., 2000; Kaiser L. et al., 2001; Seo S.H. et al., 2002]. ИФН-І вырабатывается инфицированными эпителиальными клетками [Julkunen I. et al., 2000], а также макрофагами, моноцитами и дендритными клетками [Julkunen I. et al., 2000; Cella M. et al., 2000; Matikainen S. et al., 2006] при образовании вирусной двунитчатой РНК в ходе репликативного цикла ВГ [Stark G.R. et al., 1998]. Высокие титры ИФН-І определяются уже в 1-е сутки от момента инфицирования ВГ, а пик продукции ИФН наступает через сутки после обнаружения максимального титра ВГ как в назальных смывах, так и в сыворотке крови [Fritz R.S. et al., 1999].
Влияние глюкокортикоидов на общую резистентность организма и восприимчивость клеток-мишеней к вирусу гриппа
Работы Когновицкой А.И. и др. показали, что культивирование клеток человека (перевиваемые культуры кожно-мышечной ткани эмбриона) при 43 С приводит к значительному повышению их чувствительности к цитопатогенному действию исследуемых вирусов (и в частности ВГ). Характерно, что репродукция этих вирусов в данных условиях не отличается от таковой в клетках, выращиваемых в стандартных условиях. Также отмечено резкое ингибирующее действие высоких температур на способность клеток продуцировать ИФН [Когновицкая А.И. и др., 1987].
Штаммы ВГ А с расщепляемым НА высоко чувствительны к значению рН=5, в то время как штаммы ВГ с нерасщепляемым НА (подобно PR8) выживают при этих условиях [Scholtissek С. et al., 1988]. Все исследованные Scholtissek С. Н5- и Н7-штаммы оказались в данном плане весьма лабильными, в то время как инфекционность НЗ-штаммов оставалась стабильной независимо от источников выделения ВГ А. У нескольких HI-штаммов активность НА была необратимо утрачена при значениях рН, вызывающих потерю инфекционности. Эти наблюдения могут, в частности, объяснить закономерности распространения ВГ уток в озерной воде [Scholtissek С, 1985].
В отличие от устойчивости к изменению рН, термостабильность не является характерной чертой НА, поэтому был сделан вывод, что корреляции между стабильностью штаммов ВГ при кислых значениях рН и температурой культивирования инфицированных клеток не существует [Scholtissek С, 1985].
Было изучено влияние кислых значений рН на инфекционность и нейраминидазную активность штаммов ВГ А человека, лошади и птиц. Экспозиция штаммов ВГ А человека и лошади в условиях рН=3 приводила к полной потере их инфекционности и нейраминидазной активности, тогда как все исследованные штаммы подтипов Hav6N2 и Hav7Neq2 ВГ птиц сохраняли некоторую остаточную степень инфекционности и 38% исходной активности NA. Авторами предполагается наличие взаимосвязи выявленных отличительных свойств ВГ птиц [Stallknecht D.E. et al., 1990].
В условиях воздействия на организм грызунов озона, диоксина, диоксида серы, фосгена, а также ультрафиолетового излучения было показано увеличение заболеваемости гриппом, длительности течения инфекции и смертности животных, что не было связано с подавлением вирус-специфического иммунного ответа [Ryan L.K. et al., 2002; Martins L.C. et al., 2002]. Исследования показали, что повышение смертности от гриппозной инфекции не соответствовало нарастанию титра ВГ в легких мышей, подвергавшихся воздействию диоксина [Burleson G.R. et al., 1996; Warren Т.К. et al., 2000] и озона [Selgrade M.K. et al., 1988]. Тем не менее, работы с применением традиционных агентов, обладающих иммуносупрессивной активностью (рентгеновские лучи и циклофосфамид), демонстрируют увеличение концентрации ВГ в легких наряду с повышением заболеваемости инфицированных грызунов [Hurd J. and Heath R.B., 1975; Frankova V., 1989].
На модели грызунов было также показано, что на течение вирусной инфекции оказывает влияние воздействие выхлопных газов. ВГ репродуцируется преимущественно в клетках, которые также являются главными мишенями для поллютантов (эпителий респираторного тракта). При использовании растворенных выхлопных газов в культуре клеток респираторного эпителия человека было обнаружено, что поллютанты повышают чувствительность клеток к вирусу гриппа. Эти изменения не сопровождаются подавлением продукции антивирусных медиаторов, поскольку отмечается повышение уровня ИФН-В и усиление интерферон-зависимой передачи сигналов и стимуляции экспрессии соответствующих генов. Большинство эффектов, индуцированных воздействием поллютантов, обусловлены окислительным стрессом и увеличением сродства ВГ к респираторным эпителиальным клеткам [Jaspers I. et al., 2005].
Значение белков сурфактанта для защиты легких от гриппозной инфекции В защите организма от внедрения разнообразных патогенов, включая ВГ А, важную роль играют коллектины - секреторные коллагеноподобные белки, которые, как было показано, связывают, агглютинируют и нейтрализуют ВГ in vitro [Heasman SJ. et al., 2003; Hartshorn K.L. et al., 2000]. Белки сурфактанта A и D (SP-A и SP-D) относятся к коллектинам, синтезируемым в воздухоносных путях и в легких и оказывающим влияние на течение гриппозной инфекции in vivo [Hawgood S. et al., 2004]. SP-D продуцируется альвеолоцитами 2 типа и нереснитчатыми бронхиолярными эпителиальными клетками (клетки Клара) и секретируется в просвет воздухоносных путей [Durham P.L. et al., 1993; Ballard P.L. et al., 1997; Dong Q. and Wright J.R., 1998; Tan R.C. et al, 1999; Cole T.J. et al., 2004; Provost P.R. and Tremblay Y., 2005].
Ранее было обнаружено, что связывание SP-D с вирусом гриппа А находится в зависимости от гликозилирования специфических сайтов на НА1 36 домене НА, в то время как связывание SP-A с НА 1-доменом определяется гликозилированием карбогидрат-распознающего домена SP-A [Hawgood S. et al., 2004]. Изучение ингибирования гемагглютинации показало, что SP-A и SP-D человека, свиньи и лошади проявляют более выраженную ингибиторную активность в отношении штаммов ВГ А по сравнению с легочными коллектинами, полученными от животных других видов. Такая активность SP-D является результатом взаимодействий, опосредованных аспарагин-связаным олигосахаридом, локализованным в карбогидрат-распознающем домене SP-D, который отсутствует в структуре гомологичных белков, охарактеризованных на сегодняшний день. Присутствие этого сиалированного олигосахаридного фрагмента увеличивает антигриппозную активность SP-D, что демонстрируется при изучении вирусной агрегации, инфекционного потенциала ВГ и антивирусного ответа Нф [van EijkM. et al., 2003].
Определение почечных индексов (ПИ) органов мышей
В препаратах первичных культур клеток легких и трахеи, окрашенных по Паппенгейму-Крюкову, при увеличении 1000 в световом микроскопе Axiovert-40 (Цейс, Германия) оценивали процентное содержание различных типов клеток: реснитчатых эпителиальных клеток, альвеолоцитов 1 и 2 типов, моноцитов-макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и прочих клеток. Идентификацию клеток при световой микроскопии осуществляли на основе характерных для них морфологических признаков [Абрамов М.Г., 1979].
Реснитчатые эпителиальные клетки имеют крупные размеры, сохраняют цилиндрическую форму, цитоплазма ацидофильна. Крупное, круглое без инвагинаций ядро интенсивно окрашивается основными красителями, часто встречается глыбчатое распределение хроматина, лежит в центральной или базальной части клетки. Для апикальной поверхности характерно наличие ресничек, которые сохраняются частично или полностью и являются основным признаком для идентификации клетки.
Альвеолоциты 1 типа на цитологических препаратах имеют округлую форму, поверхность клетки неровная, цитоплазма слабо эозинофильная (светло-розовая). Ядро небольшое, круглое, плохо воспринимает окраску, практически сливаясь с окружающей цитоплазмой.
Альвеолоциты 2 типа — небольших размеров, их форма кубическая (редко) или округлая (чаще). Ядро небольшое, круглое, интенсивно, равномерно окрашено. Цитоплазма яркая, азурофильная, видны темные точечные включения или единичные светлые вакуоли.
Макрофаги варьируют в размерах, преобладают небольшие круглые клетки. Ядро маленькое, эксцентрично расположенное, цитоплазма имеет пенистый вид (много оптически прозрачных вакуолей) и множественные гетерогенные включения, азурофильна. Моноциты отличаются четким, более крупным бобовидным ядром, меньшим количеством цитоплазмы, единичными вакуолями, большей ацидофильностыо цитоплазмы.
Лимфоциты - мелких и средних размеров клетки, в которых ядро занимает значительную часть клетки. Ядро круглое, гомогенно и интенсивно окрашивается. Цитоплазма в виде тонкого ободка, базофильна. Плазматические клетки овальные, имеют эксцентрично расположенное ядро со специфическим распределением хроматина.
Нейтрофилы - клетки небольших и средних размеров, 10-12 мкм в диаметре, отличаются сегментарными ядрами, которые интенсивно, равномерно окрашиваются. Эозинофилы - клетки крупнее нейтрофилов, 12 мкм в диаметре. Ядро часто состоит из двух сегментов, реже 3 и более. Цитоплазма слегка базофильна, содержит крупную, ярко окрашенную эозином зернистость.
Прочие клетки - ядросодержащие клетки, которые при данных условиях окраски и микроскопирования препаратов нельзя было с уверенностью отнести к тому или иному определенному типу.
У эвтаназированных животных вынимали из грудной полости весь сердечно-легочный комплекс вместе с трахеей. В трахею вставляли шприцевую иглу с затупленным концом. Трижды промывали полость легких при осторожном введении шприцем 1 мл среды RPMI с гепарином (5 ЕД/мл). В одной пробе объединяли БАЛЖ, полученную от трех мышей. Полученную суспензию центрифугировали 15 минут при 1500 об/мин (центрифуга ОПН-3, Россия). Супернатант сливали, а к полученному осадку добавляли 1 мл среды RPMI с 10% эмбриональной сыворотки (ICN Biomedicals Inc, США) и определяли концентрацию клеток в камере Рейхарта. Исходя из этого, рассчитывали количество клеток, в среднем полученное из легких от одной мыши. Затем 30 мкл из суспензии клеток БАЛЖ использовали для получения препаратов, окрашенных по Паппенгейму-Крюкову, в которых под световым микроскопом (Биолам-П-1, Россия) при увеличении 900 определяли процентное содержание различных типов клеток в БАЛЖ: АМф, Нф(а), Лф и Эф. Остальное количество использовали для получения монослоев клеток БАЛЖ с целью последующей оценки фагоцитарной и супероксид-продуцирующей способности АМф и Нф(а) [Шишкина Л.Н. и др., 2001].
Изучение восприимчивости клеток-мишеней и активности фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа после введения глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога
Вирус гриппа (ВГ) является самым известным и распространенным среди вирусов, вызывающих инфекционные заболевания дыхательных путей. Ежегодно эпидемии гриппа в мире приводят к 3,5 млн. случаев тяжелого течения заболевания и к 300-500 тыс. случаев со смертельным исходом [CDC, 2005]. Вместе с тем, отсутствие сведений о строгой зависимости между факторами противовирусной резистентности и исходом гриппа делает особенно актуальным изучение патогенетических механизмов, определяющих тяжесть его течения. Предполагается, что понижение резистентности к вирусам и усугубление тяжести вирусных инфекционных заболеваний, в том числе гриппа, могут быть обусловлены повышением уровня циркулирующих ГКГ [Парусов В.Н., 1981; Фролов Б.А. и др., 1991; Похилько А.В. и др., 1995; Машковский М.Д., 1998; Sheridan J.F. et al., 2000; Frustaci A. et al., 2003; http://medic.claw.ru/mz_2C 1S .htm].
Однако исследования только иммунных и нейрогуморальных механизмов развития и течения гриппозной инфекции на лабораторных моделях с применением ГК не дают полного представления о причинах ухудшения течения заболевания и повышения летальности у животных [Парусов В.Н., 1981; Фролов Б.А. и др., 1991; Похилько А.В. и др., 1995; Dobbs СМ. et al., 1996]. Для выяснения последовательности событий, происходящих при инфицировании ВГ на фоне повышенного уровня ГК в организме, необходимо создать адекватную, удобную и воспроизводимую экспериментальную модель пониженной резистентности к ВГ. Первый этап нашей работы был посвящен решению именно этой задачи, что было достигнуто путем однократного подкожного введения мышам 15-17 г синтетического глюкокортикоида пролонгированного действия — кеналога (Кн) в дозе 5 мкг/г массы мыши за 4 сут до заражении ВГ. Введение мышам Кн именно в этой дозе вызывало появление в организме характерных глюкокортикоидных эффектов: понижение ПИ надпочечника, тимуса и 137 селезенки, нейтрофилез в крови, подавление функциональной активности АМф и увеличение количества Нф и в легких [Горизонтов П.Д., 1981; Шишкина Л.Н. и др., 1987; Шишкина Л.Н. и др., 1988; Игнатьева М.И. и др., 1993; Машковский М.Д., 1998; Fukakusa М. et al., 2005].
Известно, что при достижении высокого уровня ГК в организме наблюдается инволюция надпочечников, связанная с подавлением их функции по механизму отрицательной обратной связи через уменьшение выработки гипоталамусом кортикотропин-рилизинг-фактора, последующее снижение синтеза аденокортикотропного гормона гипофиза и атрофии железистой гормон-продуцирующей ткани надпочечников [Горизонтов П.Д., 1981; Машковский М.Д., 1998; http://medbiol.ru/medbiol/endocrinology/0003e9cf.htm; ht1p://www.ogmas dents.narod.m/Prodvinut/Inform_5_l_l.htm]. Закономерное для повышенного уровня ГК снижение массы тимуса и селезенки происходит вследствие подавления дифференцировки Т-лимфоцитов, инволюции лимфоидной ткани, снижения содержания белка, угнетения синтеза ДНК и деления клеток. В тимусе под влиянием ГК усиливается также апоптоз корковых лимфоцитов [Cidlowski J.A. et al., 1996; Машковский М.Д., 1998; Данилов Р.К., 2001], обусловленный ингибированием продукции ИЛ-1 и ИЛ-2 [Northrop J.P. et al., 1992; Dobbs CM. et al., 1996; Lanza L. et al., 1996; Guizani L. et al., 1996; King K.L. et al, 1998].
В связи с тем, что мыши ICR массой 13-15 г проявляли самую высокую чувствительность к Кн, но масса печени у них достоверно уменьшалась, что было нехарактерным действию ГК и свидетельствовало о еще недостаточном развитии ферментативной системы синтеза гликогена у мышей этой группы [Сигидин Я.А. и др., 1988], в последующих экспериментах при исследовании резистентности к ВГ мы использовали мышей массой 15-17 г.
Одним из наиболее значимых для нашего исследования эффектов Кн явилось увеличение абсолютного и относительного содержания Нф в крови мышей. Данный эффект характерен для всех ГК, поскольку они способствуют ускорению созревания Нф в костном мозге и их выходу в ситемный кровоток 138 [Горизонтов П.Д., 1981; Bjomson B.N. et al., 1985; Шишкина Л.Н. и др., 1987; Игнатьева М.И. и др., 1993; Машковский М.Д., 1998; Nieweglowska N. et al., 2003; Thanasak J. et al., 2004; Комарова O.B. и др., 2004; Schleimer R.P. et al., 2004; Fukakusa M. et al., 2005]. Также показано дозозависимое угнетение ГК апоптоза Нф, приводящее к увеличению срока их жизни [Сох G., 1995; Kato Т. et al., 1995; Liles W.C. et al., 1995; Meagher L.C. et al., 1996; Daffern P.J. et al., 1999]. Shezen E. et al. и Im S.Y., et al. (1989) в экспериментах с подшиванием капсулы с дексаметазоном под кожу мышей наблюдали развитие нейтрофилеза в крови, обусловленного КСФ-зависимой пролиферацией миелоидных клеток-предшественников наряду с подавлением образования моноцитарных колоний [Shezen Е. et al., 1985; Im S.Y., et al., 1989].
Известно также, что на фоне введения ГК у человека и животных развивается дозозависимая относительная и абсолютная эозинопения, моноцитопения и лимфопения [Blomena Е. et al., 1990; Машковский М.Д., 1998]. Но в собственных экспериментах мы не отмечали снижения абсолютного количества Лф в крови у мышей на 2, 4, 6 и 14 сут после введения Кн. Возможно, это связано с тем, что даже в норме у мышей в крови процент Лф выше, чем у других животных, и варьирует от 63 до 75% при содержании Нф от 6,7 до 37,2%, Мц от 0,7 до 2,6%, Эф от 0,9 до 3,8% и общем количестве лейкоцитов крови от 5,1x10/мм до 11,6x10/мм [http://vetdoctor.ru/spravka/lab. -php?animal=6&pokazatel].
