Введение к работе
Актуальность проблемы
Инфекционные заболевания, несмотря на все усилия, предпринимаемые мировым врачебным и научным сообществами, остаются серьёзной проблемой, унося каждый год миллионы человеческих жизней. Особую актуальность проблема инфекционных заболеваний приобретает в последнее время, что связано с рядом факторов, среди которых можно выделить увеличение плотности и мобильности населения, возникновение штаммов патогенов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, появление и распространение новых заболеваний за счет расширения ареала обитания человека и создания в ходе хозяйственной деятельности новых ниш обитания микроорганизмов. Таким образом, в настоящее время особо необходима интенсификация исследований в области профилактики и лечения инфекционных заболеваний.
Туберкулез уносит каждый год около 2 млн жизней, занимая лидирующие позиции по числу смертей от инфекционного заболевания, вызываемого одним возбудителем, и уступая по этому показателю лишь ВИЧ/СПИД. Возбудителем туберкулёза является внутриклеточная паразитическая бактерия Mycobacterium tuberculosis. По данным ВОЗ, около 3 0% населения Земли инфицированы М. tuberculosis, при этом вероятность развития активной формы туберкулёза в течение жизни у латентных носителей патогена составляет 10%, что соответствует возникновению 8-9 млн новых случаев туберкулеза в мире каждый год. Развитие инфекционного процесса проходит через несколько стадий, на каждой из которых Mycobacterium tuberculosisподвергается характерному спектру внешних негативных воздействий. Успешное выживание патогена на каждой из этих стадий требует от него быстрой адаптации к изменениям условий среды обитания, каковой является организм хозяина. В основе подобных адаптации лежит динамическое изменение экспрессии генов патогена.
Так как изменения в экспрессии генов, возникающие в ответ на защитную реакцию организма хозяина, являются необходимым условием для выживания и размножения патогенных бактерий, то изучение подобных изменений необходимо для лучшего понимания молекулярных механизмов патогенеза туберкулеза. Анализ микобактериального транскриптома in vivo позволяет установить гены, активирующиеся на различных стадиях заболевания, и, следовательно, помочь в разработке новых лекарственных препаратов и диагностических средств.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлось выявление динамических изменений экспрессии генов Mycobacterium tuberculosis в тканях модельных организмов, обладающих генетически детерминированными различиями устойчивости к заболеванию, а также их структурный и сравнительный анализ.
Были поставлены следующие задачи:
Разработать новый экспериментальный подход для изучения транскриптома внутриклеточных патогенов в системе in vivo. Оценить эффективность метода на модельной системе - охарактеризовать транскриптом М. tuberculosis штамма H37Rv в инфекционной системе (легкое мыши, инфицированной М. tuberculosis). Разработать программные алгоритмы статистической и биоинформатической обработки получаемых массивов данных.
С использованием разработанного метода получить наборы последовательностей М. tuberculosisH37Rv, транскрибирующихся в тканях легкого инфицированных мышей линии I/St, сверхчувствительных к инфекции, и В6, резистентных к инфекции, на 4-й и 6-й неделях с момента заражения. Определить нуклеотидные последовательности транскриптов методом массированного секвенирования.
Провести сравнительный анализ экспрессии генов М. tuberculosis в легочной ткани инфицированных мышей; определить гены, меняющие уровень своей экспрессии при развитии инфекции; выявить биохимические пути, с помощью которых М. tuberculosis адаптируется к защитной реакции организма хозяина.
Научная новизна и практическая ценность работы
В ходе данной работы был разработан новый метод обогащения образца тотальной кДНК, полученной из инфицированной ткани хозяина, фрагментами кДНК бактериального патогена. Метод КлИП (Клонирование Идентичных Последовательностей) основан на гибридизации двух пулов ДНК и последующей избирательной амплификации целевой фракции фрагментов ДНК за счет эффекта супрессии ПЦР. Метод универсален и может быть применен для получения РНК как других внутриклеточных паразитических или симбиотических бактерий, так простейших и вирусов.
Разработанный нами метод был применен для анализа транскриптомов М. tuberculosisH37Rv из легочной ткани инфицированных мышей линии A/Sn на 9-й неделе с момента инфекции. Мыши линии A/SnYCit (A/Sn) при инфекциях М. tuberculosis проявляют сравнительно высокий уровень резистентности к заболеванию. Анализ транскриптома М. tuberculosis выявил изменения в профиле экспрессии генов патогена, характерные для хронической фазы инфекции, которая характеризуется определенными функциональными перестройками, в частности, усилением метаболизма липидов и переходом к нитратному клеточному дыханию.
В ходе экспериментальной работы были получены библиотеки кДНК М. tuberculosis из тканей легкого инфицированных модельных организмов (мышей), обладающих различными уровнями генетически детерминированной резистентности к заболеванию. Впервые был осуществлен анализ последовательностей микобактериальных кДНК при помощи метода полномасштабного секвенирования RNA-Seq. В ходе работы подобраны оптимальные способы статистического анализа данных и создан набор программ, позволяющих эффективно обрабатывать большое количество нуклеотидных последовательностей, отбирая необходимые по заданному ряду критериев.
Было установлено несколько молекулярно-генетических детерминант, характеризующих М. tuberculosis из различных моделей инфекции; выявлен ряд генов, продукты которых являются необходимыми для размножения бактерий и развития инфекции вне зависимости от генотипа хозяина и представляют тем самым объекты потенциального терапевтического воздействия. Дальнейшие исследования в области изучения экспрессии генов патогена позволят расширить спектр молекулярно-генетических детерминант, характеризующих развитие инфекции по тому или иному пути, что, в свою очередь, даст возможность более точной диагностики и достоверного прогнозирования течения заболевания и, следовательно, выбора оптимальной стратегии лечения.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 160 листах машинописного текста, имеет
традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы,
экспериментальной части, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов,
списка цитируемой литературы, включающего 233 ссылки, и 4 приложений.
