Введение к работе
Актуальность проблемы. Программируемая клеточная смерть (ПКС) является особой формой гибели клетки, инициированной внутриклеточной программой. Разные формы ПКС встречаются практически у всех эукариотических организмов, включая одноклеточные. Апоптоз является одним из трех основных типов клеточной смерти, встречаемых у животных. В сравнении с двумя другими основными типами клеточной смерти у животных - аутофагией и регулируемым некрозом - процессы апоптоза к настоящему времени исследованы лучше всего как с биохимической, так и с морфологической точек зрения. Классический апоптоз сопровождается характерными морфологическими признаками: округлением погибающей клетки, снижением клеточного объема, конденсацией хроматина, сегментацией ядра и очень небольшими ультраструктурными модификациями цитоплазматических органелл. Кроме того, наблюдается сморщивание плазматической мембраны, которая, однако, не теряет непроницаемости до финальных стадий процесса клеточной смерти, а также разделение погибающей клетки на части, известные как апоптотические тельца. В конце процесса такие апоптотические тельца поглащаются фагоцитами и деградируют внутри них с помощью лизосом.
В отличие от животных у растений, как и у многих представителей других царств живых организмов, как минимум, по двум причинам по определению не может быть «классического» апоптоза: (і) из-за наличия плотной клеточной стенки, что делает невозможным образование апоптотических телец; (іі) из-за отсутствия у растений клеток, способных к фагоцитозу (van Doom et al, 2011).
Интенсивные исследования ПКС в течении последних 30-ти лет выявили большое разнообразие в типах развития клеточной смерти, встречающихся даже у одного и того же организма. Многие из них описаны морфологически, в то время как данные об их биохимических механизмах пока охарактеризованы очень не полно. Для того, чтобы унифицировать критерии для определения разных типов клеточной смерти у животных, был создан комитет по номенклатуре клеточной смерти, который периодически публикует и обновляет рекомендации по использованию терминов в данной области. При этом, по мере накопления новых данных о молекулярных механизмах развития процессов ПКС рекомендуется переходить от морфологических определений к биохимическим (Galluzzi et al, 2012). Аналогичная работа по классификации типов клеточной смерти проводится сообществом исследователей, изучающих ПКС в растениях (van Doom et al, 2011).
Каспазы являются идеальными эффекторами для обеспечения процессов ПКС по трем причинам. Во-первых, каспазы конститутивно экспрессируются в виде неактивного зимогена. Таким образом, некоторое их количество постоянно присутствует в клетке и после активации может выполнить свою функцию в достаточно сжатые сроки. Во-вторых, реакции протеолитического расщепления, катализируемые каспазами, являются необратимыми. В третьих, существенным преимуществом является определенная полиспецифичность каспаз, что обусловливает расщепление, с одной стороны, многих субстратов, а с другой -нерасщепление абсолютно всех белков. У представителей царства животных каспазы достаточно консервативны, однако их количество и типы могут сильно варьировать у разных организмов.
Несмотря на то, что феномен ПКС характерен для всех видов живых организмов, представители семейства каспаз встречаются только у представителей царства животных. После публикации полноразмерных геномов резушки (Arabidopsis thaliana L.) и риса (Oryza sativa L.) стало окончательно очевидно, что у растений (по крайней мере, у этих двух видов) нет генов каспаз, которые можно было бы идентифицировать с помощью простых инструментов поиска гомологичных генов. Тем не менее, накопление многочисленных данных о том, что в процессах развития ПКС у растений детектируется каспазо-подобная активность (Bonneau et al, 2008), стимулировало исследователей примененить специальные биоинформатические методы, которые позволили обнаружить у растений очень отдаленных родственников протеиназ, относящихся к семейству каспаз, -метакаспазы (Uren et al, 2000). Кроме того, к настоящему времени охарактеризовано еще несколько протеиназ, активность которых, как считается, необходима при развитии некоторых видов ПКС у растений. Такими протеиназами являются: вакуолярный процессирующий фермент (VPE), представитель субтилизин-подобного семейства протеиназ, названный фитаспазой, а также еще две сериновые протеиназы SAS-1 и SAS-2 (Chichkova et al, 2010; Coffeen and Wolpert 2004; Hatsugai et al, 2004). Несмотря на то, что у животных известно более тысячи природных субстратов каспаз (Crawford et al, 2013), у растений к настоящему времени охарактеризован единственный природный субстрат протеиназ, обеспечивающих развтите ПКС в растениях. Им является субстрат фитаспазы - белок VirD2, но его расщепленее фитаспазой скорее всего не связано с процессами развития ПКС (Chichkova et al, 2010).
В условиях хронического стресса энодоплазматического ретикулума (ЭПР), индуцированного переполнением люмена ЭПР несвернутыми или неправильно свернутыми белками, часто развиваются процессы ПКС. В дополнение к функции, направленной на запуск механизмов, восстанавливающих гомеостаз ЭПР -процесса, названного ответом на несвернутый белок (ОНБ; unfolded protein response), способствующего выживанию клетки, - существуют сигнальные пути развития ОНБ, приводящие к развитию ПКС (Sano and Reed 2013). Вирусные патогены, продуцирующие большие количества вирус-специфических белков, значительная часть из которых является мембранными, используют различные стратегии для использования процессов ОНБ в целях обеспечения максимально продуктивной инфекции (Zhang and Wang 2012). Стресс ЭПР и развитие ОНБ являются базовыми реакциями, свойственными всем эукариотическим организмам. Недавно было показано, что инфекция, вызываемая X вирусом картофеля (ХВК) у растений, а также вирус-специфический гидрофобный транспортный белок ТБГЗ ХВК способны индуцировать стресс ЭПР, ОНБ и, в некоторых условиях, последующее развитие ПКС (Ye et al, 2011; 2013). Несмотря на активные исследования, проводимые в последние годы, механизмы, используемые вирусами для осуществления тонких настроек фундаментальных процессов развития ОНБ для обеспечения собственной продуктивной инфекции, до сих пор остаются, во-многом, не ясными (Zhang and Wang 2012).
Цель работы. Настоящая работа была направлена на выявление новых молекулярных механизмов развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции.
Задачи исследования.
-
Охарактеризовать функциональную роль метакаспазы растений тсП-Ра в процессах развития ПКС при морфогенезе и в условиях стресса.
-
Выявить и охарактеризовать природный субстрат метекаспазы растений тсП-Ра. Исследовать влияние протеолитического расщепления природного субстрата, инициируемого тсП-Ра, на его функциональные свойства.
-
Выявить гомологи субстрата, расщепляемого тсП-Ра, у животных. Исследовать возможность протеолитического расщепления такого гомолога в процессе развития апоптоза.
-
Исследовать внутриклеточную локализацию гидрофобных белков ТБГЗ и цистеин богатого белка вируса курчавости верхушек картофеля. Определить функциональную роль белка ТБГЗ в процессах транспорта вирусов растений.
-
Исследовать возможность индукции стресса ЭПР и последующего развития ПКС при экспрессии гидрофобных белков вирусов растений.
-
Исследовать особенности экспрессии гидрофобных белков вируса курчавости верхушек картофеля при развитии вирусной инфекции.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые биохимически охарактеризована метакаспаза растений тсП-Ра. В результате проведенных работ показано, что в отличие от каспаз животных, представляющих из себя аспартат-специфичные цистеиновые протеиназы, тсП-Ра является аргинин/лизин-специфичной цистеиновой протеиназой. Также впервые показано, что протеолитическая активность тсП-Ра является необходимой у растений для развития ПКС при морфогенезе и ответе на стресс. Несмотря на особенную субстратную специфичность, функция тсП-Ра является аналогичной функциям каспаз: на начальных этапах ПКС тсП-Ра локализуется в цитоплазме, а при развитии ПКС она транслоцируется в ядро и инициирует его деградацию. В настоящей работе также впервые показано, что эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является неизменным компонентом деградома как у растений, так и у животных. Выявлено, что у растений протеолитическое расщепление TSN в ходе развития ПКС осуществляется метакаспазой, в то время как у животных протеолитическое расщепление TSN в процессе развития апоптоза осуществляется каспазой-3, причем это протеолитическое расщепление TSN негативно влияет на его функциональную активность. Кроме того, в работе показано, что эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является необходимым фактором выживаемости как у растительных, так и у животных клеток.
При выполнении настоящей работы была создана модельная система для изучения транспорта вирусов растений, содержащих тройной блок генов (ТБГ). Показано, что продукт экспрессии ТБГ, мембранный белок ТБГЗ вируса курчавости верхушек картофеля (ВКВК; Potato mop-top virus; PMTV), индуцирует образование из мембран ЭПР телец-включений на клеточной периферии, образование которых необходимо для осуществления внутриклеточного и межклеточного транспорта РНК-связывающего белка ТБГ1. В тоже время, в настоящей работе продемонстрировано, что именно белок ТБГЗ индуцирует стресс ЭПР, следствием которого является ОНБ. Такой ответ, имеющий целью компенсировать функциональные повреждения ЭПР, вызывает клеточную смерть при условии длительного воздействия факторов, приводящих к стрессу ЭПР. При
выполнении данной работы выяснилось, что аналогичным потенциалом индуцировать стресс ЭПР обладает еще один мембранный, богатый цистеином белок, экспрессируемый ВКВК. Проведенные в настоящей работе исследования особенностей экспрессии мембранных белков ВКВК выявили молекулярные механизмы, с помощью которых вирусы снижают уровень экспрессии белков, способных индуцировать развитие ПКС.
При исследовании интегральных мембранных белков был разработан новый оригинальный метод определения топологии таких белков в живых клетках.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном семинаре отдела сигнальных путей клетки и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» 15 мая 2013 года. Материалы работы докладывались на всероссийских и международных конференциях: Iі Aschersleben Symposium 'New Aspects of Resistance Research on Cultivated Plants', (Ашерслебен, Германия, 1999 г.), IXth Conference on Virus Diseases of Gramineae in Europe, (Йорк, Великобритания, 2001 г.), Ш-ий Всероссийский биохимический съезд, (Санкт-Петербург, 2002 г.), VHIth International Congress of Plant Pathology (Крайстчерч, Новая Зеландия, 2003 г.), 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions (Санкт-Петербург, 2003 г.), Conference "Cell Biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants" (Ялта, Украина, 2004 г.), XXII SPPS Congress (Умео, Швеция, 2005 г.), Научно-практическая конференция «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства» (Коренево, Моск. обл., 2008) Научно-практическая конференция «Современные тенденции и перспективы инновационного развития картофелеводства» (Чебоксары, 2011 г.).
Публикации. По результатам работы опубликовано 17 статей в рецензируемых научных изданиях. Основные результаты и теоретические обобщения опубликованы в ведущих журналах, входящих в список журналов, рекомендованных ВАК, и/или индексируемых базами данных Web of Science и Scopus (Биохимия, Current Drag Targets, Journal of General Virology, Molecular Plant-Microbe Interactions, Nature Cell Biology, Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America, The Plant Journal), а также в международных журналах (Beitrage zur Ztichtungsforschung и NATO Science Series I: Life and Behavioural Sciences).
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».
