Введение к работе
Актуальность проблемы. Нарушения функции почек различного генеза являются распространенной клинической патологией, часто угрожающей жизни больного. Несмотря на прогресс в развитии методов терапии, не уменьшается количество пациентов с ишемической острой почечной недостаточностью (ОПН), высока смертность от этого состояния (Himmelfarb J. and Ikizler T.A., 2007). Острый некроз скелетных мышц (рабдомиолиз) и обусловленная им миоглобинурия также являются достаточно распространенной патологией, ведущей к развитию ОПН (Zager R.A., 1996). Поскольку основной причиной рабдомиолиза (также называемого краш-синдромом, наблюдаемого при техногенных и природных катастрофах, военных действиях) являются травмы, сопровождающиеся раздавливанием тканей, эта проблема представляется чрезвычайно актуальной из-за высокой клинической распространенности и тяжести течения болезни (Vanholder R. et al., 2000). При хронической почечной недостаточности (ХПН) возникает необходимость замещения функции поврежденного органа путем гемодиализа или трансплантации почки, что серьезно ухудшает качество жизни больного (Mucsi I. et al., 2008) и является крайне затратным с экономических позиций. Все это указывает на необходимость изучения фундаментальных клеточно-биологических процессов, лежащих в основе повреждения и механизмов защиты почки, а также разработки новых подходов к терапии и профилактике нарушений функций почек.
В последнее время становится очевидным, что механизмы патологических процессов, протекающих в почке, всвязаны с развитием «окислительного стресса» (Cadenas E. and Sies H., 1985), который является выраженным и в значительной мере необратимым деструктивным процессом, ведущим к гибели клеток нефрона и функциональной несостоятельности органа (Basnakian A.G. et al., 2002).
Основными участниками цепи событий, приводящих к окислительному стрессу, являются активные формы кислорода и азота (АФК и АФА, соответственно). Однако их роль не сводится к повреждающим реакциям, они также участвуют и в сигнальных путях, ведущих к защите клетки и органа (Зоров Д.Б.и др., 2005). Центральной фигурой как повреждающих, так и защитных путей следует признать митохондрии, и именно исследование их функционирования в условиях различных почечных патологий может помочь в составлении целостной картины регуляции выживания или гибели клетки в ходе развития окислительного стресса.
Нет сомнений, что итоговыми результатами исследований фундаментальных механизмов повреждения почки должна стать разработка принципиально новых стратегий защиты почки, причем выявление центральных звеньев деструктивного процесса позволит разработать универсальные методы защиты, актуальные для самых разных почечных патологий.
В этой связи нами были выбраны два направления разработки нефропротекторных технологий. В основе первой лежит повышение толерантности почки к окислительному стрессу, направленное на снижение тяжести повреждения в условиях его развития. Основными средствами для достижения этой цели являются фармакологические препараты с антигипоксическим и мембранопротекторным действием, и методы физиологического и фармакологического прекондиционирования клеток почки. Вторым направлением стало исследование возможностей улучшения функции поврежденной почки с помощью клеточных технологий, то есть использования различных типов стволовых и прогениторных клеток для регенеративной терапии почечной ткани.
В основе действия антигипоксантов лежит активация анаэробной продукции макроэргических соединений на фоне дефицита кислорода в клетке (Костюченко А.Л. и Семиголовский Н.Ю., 2002), тогда как антиоксиданты уменьшают последствия окислительного стресса, устраняя избыток свободных радикалов, и тем самым препятствуют возникновению повреждений клеток и ткани почки (Koyner J.L. et al., 2008). Однако, пока нет убедительных клинических данных о способности антиоксидантов предотвращать ишемическое повреждение (Kromhout H., 2001), что отчасти объясняется проблемой доставки этих соединений в места генерации АФК в нужное время и достаточном количестве для снижения окислительного стресса (Becker L.B., 2004). В этой связи наиболее перспективным представляется принципиально новое направление разработки антиоксидантов для терапии заболеваний связанных с окислительным стрессом – создание антиоксидантов, направленно доставляемых в митохондрии (Скулачев В.П., 2007).
Основным началом всех подходов клеточной терапии является использование стволовых клеток или специализированных почечных клеток на разных этапах дифференцировки. Данная область может быть охарактеризована, как использование различных типов клеток для восстановления поврежденной почки за счет стимуляции собственных репаративных процессов в ткани, регенерации структур почки или биоинженерии (Little M.H., 2006). Однако, механизмы взаимодействия стволовых клеток с тканью поврежденного органа изучены слабо, особенно в отношении почечной ткани. Остается неясным, какие типы клеток (эмбриональные, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, прогениторные клетки почки и др.) наиболее эффективны в защите и восстановлении функций почки, а также каким образом может реализовываться положительной эффект клеточной терапии: интеграцией введенных клеток в почку, с последующей дифференцировкой и встраиванием в нефрон (Morigi M. et al., 2004), паракринным влиянием (Togel F. et al., 2005) или различными межклеточными взаимодействиями вплоть до слияния клеток (Bussolati B. and Camussi G., 2007). В данной работе исследовалась не только возможность восстановления функций почки с помощью клеточной терапии, но и механизмы взаимодействия стволовых клеток в поврежденной тканью.
Исходя из вышеизложенного, в работе исследованы на клеточном уровне механизмы развития самых распространенных в клинической практике почечных патологий, таких как острая ишемическая почечная недостаточность и миоглобинурия, вызванная рабдомиолизом. Изучена возможность предотвращения и терапии дисфункции почки с помощью фармакологического и ишемического прекондиционирования, применения митохондриально-адресованных антиоксидантов и клеточной терапии.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было исследование роли митохондрий клеток почки в повреждающих и защитных сигнальных путях при почечной недостаточности, вызванной ишемией/реперфузией и миоглобинурией, а также поиск стратегий нефропротекции и восстановления почечной ткани.
Задачи исследования:
-
изучение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки при острой почечной недостаточности, вызванной ишемией/реперфузией и рабдомиолизом;
-
исследование механизмов продукции активных форм кислорода и азота в клетках почки при ишемии/реперфузии и рабдомиолизе;
-
выявление роли митохондрий в развитии окислительного и нитрозильного стресса;
-
изучение действия физиологического прекондиционирования (ишемической и гипоксической тренировки) на выраженность патологических изменений при ишемии/реперфузии почки;
-
исследование механизмов прекондиционирования почки и защиты от дисфункции с помощью фармакологических агентов: ингибиторов киназы гликогенсинтазы-3 (GSK-3) и митохондриально-адресованных антиоксидантов;
-
изучение эффекта введения стволовых и прогениторных клеток на функции почки при острой и хронической почечной недостаточности;
-
исследование механизмов межклеточных взаимодействий стволовых клеток с дифференцированными клетками органа и роли митохондрий в этих процессах.
Научная новизна работы. В работе показана ведущая роль митохондрий в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки, в управлении гибелью клетки, а также возможность участия в процессах клеточной дифференцировки.
Показано нарушение работы митохондриального аппарата клеток почки, выражающееся в падении трансмембранного потенциала, индукции неспецифической проницаемости митохондрий, их набухании и фрагментации при И/Р почки. Впервые на модели ишемии/реперфузии почки показано, что основными источниками повышенной продукции активных форм кислорода и NO являются митохондрии. Показано, что ишемия/реперфузия вызывает запуск в клетках почки апоптотических сигнальных путей, которые реализуются через транслокацию в митохондрии белка Вах и выход из митохондрий цитохрома с.
Обнаружено, что физиологическое прекондиционирование (воздействие периодов гипоксии на животное или кратковременные периоды ишемии почки), и фармакологическое прекондиционирование хлоридом лития вызывают ингибирование киназы GSK-З, предотвращают развитие неспецифической проницаемости митохондрий, снижают повреждение митохондрий и генерацию активных форм кислорода и, в конечном счете, защищают почку от повреждения.
Изучение механизмов острой почечной недостаточности при рабдомиолизе показало, что именно повреждение митохондрий и развитие в них перекисного окисления является одной из основных причин дисфункции почки. Показано, что миоглобин индуцирует в митохондриях гиперпродукцию активных форм кислорода и NO, окисление митохондриальных мембран и разобщение окислительного фосфорилирования.
Исследование влияния митохондриально-адресованных антиоксидантов 10-(6'-пластохинонил) децилтрифосфония (SkQ1) и 10-(6'-пластолхинонил) децил-родамина (SkQR1), показало их высокую эффективность в предотвращении окислительного стресса в почечных клетках после ишемии и защите почки от повреждения. Эти соединения уменьшают гибель клеток почечного эпителия, снижают выраженность пост-ишемической почечной недостаточности и повышают выживание животных с острой почечной недостаточностью.
Введение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) нормализует функциональное состояние почки при хронической и острой почечной недостаточности, способствует уменьшению выраженности патоморфологических изменений в почечных канальцах, и повышает выживание животных. Показано образование различных типов межклеточных контактов между стволовыми и дифференцированными клетками и передача по этим контактам цитоплазмы и митохондрий, что может играть роль в определении направления дифференцировки стволовых клеток и в развитии их терапевтического эффекта.
Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования углубляют представления о фундаментальных клеточных механизмах, лежащих в основе развития окислительного стресса и повреждения почки при таких клинически распространенных почечных патологиях, как острая ишемическая почечная недостаточность и миоглобинурия.
Показано нефропротективное действие ионов лития, митохондриально-адресованных антиоксидантов семейства SkQ и ишемического прекондиционирования, что позволяет использовать их для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать, предупреждать обращать патологические изменения при острой почечной недостаточности, миоглобинурии и краш-синдроме, оперативных вмешательствах. Показано, что введение ММСК способствует улучшению функций почки при ОПН и ХПН, что дает основание для использования ММСК для терапии этих патологий. Результаты исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии, биохимии, нефрологии и патофизиологии.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При ишемии/реперфузии почки митохондрии клеток почечных канальцев являются основными источниками АФК и NO, что указывает на ведущую роль этих органелл в развитии окислительного стресса.
-
Ионы лития, гипоксическое и ишемическое прекондиционирование вызывают ингибирование GSK-3b, что предотвращает негативные последствия ишемии/реперфузии почки, снижая продукцию активных форм кислорода в митохондриях, гибель клеток почечных канальцев и выраженность признаков почечной недостаточности.
-
Миоглобин вызывает перекисное окисление липидов митохондрий почки как при рабдомиолизе in vivo, так и при воздействии на изолированные митохондрии почки in vitro
-
Митохондриально-адресованные антиоксиданты SkQ и SkQR1 эффективно предотвращают развитие окислительного стресса в клетках почки при ишемии/реперфузии и восстанавливают нарушенные функции почки.
-
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при введении животным способствуют уменьшению выраженности повреждения почек при острой и хронической почечной недостаточности
-
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки могут при совместном культивировании образовывать контакты с клетками почки и другими дифференцированными клетками. Между контактирующими клетками происходит транспорт клеточного содержимого, в том числе митохондрий.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах отдела биоэнергетики НИИ Физико-Химической биологии им. А.Н.Белозерского. Отдельные аспекты работы представлялись на Международной конференции “Ломоносов”, (Москва, 2001, 2006, 2007, 2008), 5-ой конференции “Биология — наука 21-го века” (Пущино, 2001, 2007), 6-ой школе Джона Хамфри по иммунологии (Пущино, 2002), конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), 3-ем съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной научной школе «Free radicals and diseases: gene expression, cellular metabolism and pathophysiology» (Греция, 2004), конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), европейских биоэнергетических конференциях EBEC (Москва, 2006, Дублин, 2008), конференции FEBS2007 (Вена, 2007), конференции Mitochondrial physiology. MiP2007 64th Harden conference (Австрия, 2007), XI съезде урологов России (Москва, 2007), Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2008).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 64 печатных работах, из них 25 – в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация написана на 325 страницах, состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы включает 34 отечественных и 558 иностранных источника.
