Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфофункциональные аспекты поражения дыхательной системы при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких (обзор литературы) 16
1.1. Морфология бронхиальной стенки в норме 16
1.2. Патоморфоз бронхиальной астмы 18
1.3. Классификация бронхиальной астмы 32
1.4. Патоморфоз хронической обструктивной болезни легких 33
1.5. Классификация хронической обструктивной болезни легких 49
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Объект исследования 53
2.2. Критерии включения/исключения 53
2.3. Клинико-функциональная характеристика больных бронхиальной астмой, включенных в исследование 56
2.4. Клинико-функциональная характеристика больных хронической обструктивной болезнью легких, включенных в исследование 62
2.5. Материал исследования 64
2.6. Методы исследования 64
2.6.1. Морфологическое исследование слизистой оболочки бронхов 64
2.6.2. Цитологическое исследование бронхиальных смывов 70
2.6.3. Цитологическое исследование индуцированной мокроты 71
2.6.4. Биохимический анализ бронхиальных смывов индуцированной мокроты 72
2.6.5. Иммунологическая оценка показателей бронхиальных смывов и индуцированной мокроты 74
2.6.6. Определение активности фактора Виллебранда в сыворотке крови 75
2.6.7. Статистическая обработка результатов 75
Глава 3. Результаты собственных исследований 77
3.1. Структурная характеристика слизистой оболочки бронхов при различных формах бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 77
3.1.1. Морфологическая характеристика слизистой оболочки бронхов у больных различными формами бронхиальной астмы 78
3.1.2. Морфологическая характеристика слизистой оболочки бронхов у больных со среднетяжелыми (II ступень) и тяжелыми (III степень) стадиями хронической обструктивной болезни легких 129
3.2. Морфометрический анализ слизистой оболочки бронхов при различных формах бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 146
3.2.1. Морфометрический анализ слизистой оболочки бронхов при среднетяжелой и тяжелой терапевтически чувствительных формах бронхиальной астмы 146
3.2.2. Морфометрический анализ слизистой оболочки бронхов при тяжелой терапевтически чувствительной и терапевтически резистентной бронхиальной астме 151
3.2.3. Морфометрический анализ слизистой оболочки бронхов при II (среднетяжелой) и III (тяжелой) стадиях хронической обструктивной болезни легких 159
3.2.4. Морфометрический анализ слизистой оболочки бронхов при различных фенотипах тяжелой терапевтически резистентной формы бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 167
3.3. Морфофункциональное состояние клеток воспалительного инфильтрата слизистой оболочки бронхов при различных формах бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 173
3.3.1. Морфологическое и функциональное состояние клеток воспалительного инфильтрата слизистой оболочки бронхов при среднетяжелой и тяжелой терапевтически чувствительной форме бронхиальной астмы 173
3.3.2. Морфологическое и функциональное состояние клеток воспалительного инфильтрата слизистой оболочки бронхов при тяжелых терапевтически чувствительных и терапевтически резистентных формах бронхиальной астмы 176
3.3.3. Морфологическое и функциональное состояние клеток воспалительного инфильтрата слизистой оболочки бронхов при II и III стадии хронической обструктивной болезни легких 189
3.3.4. Морфологическое и функциональное состояние клеток воспалительного инфильтрата слизистой оболочки бронхов при различных фенотипах тяжелой терапевтически резистентной формы бронхиальной астмы и хронически обструктивной болезни легких 193
3.4. Морфологическая характеристика капилляров слизистой оболочки бронхов при различных формах бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 199
3.4.1. Морфологическая характеристика капилляров слизистой оболочки бронхов при среднетяжелой и тяжелой терапевтически чувствительной форме бронхиальной астмы 199
3.4.2. Морфологическая характеристика капилляров слизистой оболочки бронхов при тяжелой терапевтически чувствительной и терапевтически резистентной бронхиальной астме 204
3.4.3. Морфологическая характеристика капилляров слизистой оболочки бронхов при среднетяжелой и тяжелой стадиях хронической обструктивной болезни легких 212
3.4.4. Морфологическая характеристика капилляров слизистой оболочки бронхов при различных фенотипах тяжелой терапевтически резистентной формы бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 216
3.5. Морфологическая оценка клеточных и молекулярных маркеров воспаления при различных формах бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 222
3.5.1. Клеточные и молекулярные маркеры в бронхиальном содержимом при среднетяжелой и тяжелой терапевтически чувствительной форме бронхиальной астмы 223
3.5.2. Клеточные и молекулярные маркеры в бронхиальном содержимом при тяжелой терапевтически чувствительной и терапевтически резистентной формах бронхиальной астмы 232
3.5.3. Клеточные и молекулярные маркеры различных воспалительных вариантов в бронхиальном содержимом при среднетяжелой и тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких 247
3.5.4. Клеточные и молекулярные маркеры бронхиального содержимого при тяжелых терапевтически резистентных формах бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 254
3.5.5. Сравнительное исследование клеточных и молекулярных маркеров воспалительных реакций в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте при различных фетотипах тяжелых форм бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких 264
Глава 4. Обсуждение результатов 266
Заключение 300
Выводы 303
Практические рекомендации 305
Литература 306
- Патоморфоз бронхиальной астмы
- Морфологическая характеристика слизистой оболочки бронхов у больных различными формами бронхиальной астмы
- Морфометрический анализ слизистой оболочки бронхов при различных фенотипах тяжелой терапевтически резистентной формы бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких
- Клеточные и молекулярные маркеры в бронхиальном содержимом при тяжелой терапевтически чувствительной и терапевтически резистентной формах бронхиальной астмы
Введение к работе
Актуальность проблемы
Функциональная морфология воздухоносных путей и легких в норме и при ряде патологических состояний изучена весьма детально (Непомнящих Г.И., 1990; Непомнящих Г.И., 1997; Чучалин А.Г., 2000; Chung K.F., 2000; Majo J., 2001; Davies D.E., 2003; Непомнящих Г.И., 2005; Кузьмин А.З., 2007; Непомнящих Д.Л., 2010). Оценка изменений, развивающихся в бронхо-легочной системе при том или ином патологическом процессе служит основой для понимания закономерностей компенсаторно-приспособительных реакций в органах дыхания (Непомнящих Г.И., 2005; Непомнящих Д.Л., 2010).
Воспаление дыхательных путей, спровоцированное инфекцией, травмой или действием аллергенов, приводит к характерным патоморфологическим и клиническим проявлениям бронхо-легочных заболеваний, среди которых 15-25 % приходится на тяжелую бронхиальную астму и тяжелую стадию хронической обструктивной болезни легких, сопровождающихся высокой частотой жизнеугрожающих обострений и смертностью пациентов (Огородова Л.М., 2001; Smith H., 2002; Княжевская Н.П., 2003; Шапорова Н.Л., 2003; Чучалин А.Г., 2004; Eder W., 2006; Holgate S.T., 2006; Авдеев, С.Н., 2007; Черняев А.Л., 2007; Barnes, P.J., 2007; Волкова Л.И; Wenzel S.E., 2009; Redington A.E., 2010; Чучалин А.Г., 2010).
Тяжелая бронхиальная астма и тяжелая стадия хронической обструктивной болезни легких являются важными медико-социальными проблемами, так как на их долю приходится 80% всех затрат, связанных с заболеваниями бронхо-легочной системы: сюда входят как прямые затраты на медикаментозное обеспечение, оказание дорогостоящей экстренной помощи, так и непрямые затраты в связи с длительными периодами нетрудоспособности пациентов (Черняев А.Л., 1998; Огородова, Л.М., 2001; Чучалин А.Г., 2004).
По результатам проведенных в последние годы эпидемиологических исследований (AIRE, AIRCEE, AIA, НАБАТ) контроль над заболеванием у пациентов с тяжелой бронхиальной астмой регистрируется лишь у 5-20% больных, что связано в первую очередь с неадекватным степени тяжести лечением. В зависимости от чувствительности к терапии астму разделяют на чувствительную и резистентную формы. К последней относят астму тяжелого течения, характеризующуюся недостаточным контролем, несмотря на применение адекватных доз ингаляционных кортикостероидов.
Терапевтически резистентная бронхиальная астма отличается выраженным полиморфизмом: к ней относятся «brittle» фенотип (нестабильная форма) и «астма с фиксированной бронхообструкцией» (гормонозависимая) (Holgate S.T., 2004; Огородова Л.М., 2005; Кобякова О.С., 2005; Barnes, P.J., 2007; Wenzel S.E., 2009).
Клиницисты нередко сталкиваются с проблемой дифференциальной диагностики тяжелых форм бронхиальной астмы и тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких. До настоящего времени четко не определены морфологические предикторы развития тяжелой, терапевтически резистентной бронхиальной астмы, а также не разработаны дифференциальные критерии патоморфоза тяжелой астмы и тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких.
Единственным способом получения достоверной информации о морфо-функциональном состоянии бронхиального дерева являются бронхоскопические методы исследования, хотя эти манипуляции инвазивны и могут спровоцировать утяжеление состояния пациентов (Виггинс Дж., 1991; Davies D.E., 2003; Непомнящих Г.И., 2005; Boulet L.P., 2008). В этой связи заслуживает внимания возможность анализа индуцированной мокроты и бронхиальных смывов, клеточный и молекулярный состав которых, по-видимому, отражает состояние бронхиального дерева (Авдеев С.Н., 1998; Rutgers S. R., 2000; Цой А.Н., 2007; Hudy M.H., 2010).
Морфо-функциональные изменения в органах дыхания, основанные на анализе биоптатов слизистой оболочки бронхов в сопоставлении с исследованием бронхиальных смывов и индуцированной мокроты, могут служить базисом для выявления тканевых, клеточных и молекулярных предикторов тяжелого течения бронхиальной астмы, а также дифференциальных критериев между бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких.
Цель работы
Цель диссертационной работы выявить ведущие тканевые, клеточные и молекулярные взаимодействия в воздухоносных путях при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких.
Задачи исследования:
-
Изучить морфо-функциональные особенности слизистой оболочки бронхов у пациентов с тяжелой терапевтически чувствительной и терапевтически резистентной бронхиальной астмой.
-
Оценить состояние тканевых, клеточных и молекулярных компонентов бронхиальной стенки и сопоставить их с клинико-функциональными параметрами у больных терапевтически резистентной бронхиальной астмой «brittle» фенотипа (нестабильная астма).
-
На основании диагностики функций внешнего дыхания, гистологического, иммуно-гистохимического, ультраструктурного анализа бронхобиоптатов, цитологического, иммунологического и биохимического исследования бронхиальных смывов и индуцированной мокроты выявить тканевые, клеточные и молекулярные механизмы, характерные для терапевтически резистентной бронхиальной астмы фенотипа «астма с фиксированной бронхообструкцией» (гормонозависимая).
-
Дать морфо-функциональную характеристику бронхобиоптатов, бронхиальных смывов и индуцированной мокроты при тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких.
-
Выявить тканевые, клеточные и молекулярные маркеры, отличающие тяжелую бронхиальную астму от тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких.
Научная новизна
Проведено комплексное морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки бронхов, бронхиальных смывов и индуцированной мокроты при тяжелой бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких.
Впервые показано, что резистентная к терапии бронхиальная астма сопровождается более высокой концентрацией оксида азота в бронхиальном содержимом на фоне повышения функциональной активности тучных клеток и слизеобразующей функции бокаловидных экзокриноцитов в слизистой оболочке бронхов.
Получены новые данные, играющие ключевую роль при разделении тяжелой терапевтически резистентной астмы на «brittle» фенотип и «астма с фиксированной бронхообструкцией» это усиление экспрессии рецепторов к трансформирующему фактору роста 1 на клетках бронхиального эпителия, возрастание удельного объема митохондрий и лизосом в реснитчатых эпителиоцитах, увеличение доли «светлых» и «темных» эндотелиоцитов капилляров слизистой оболочки бронхов, а также снижение концентрации интерлейкина-10 в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте.
Впервые продемонстрировано, что высота эпителиального пласта и толщина базальной мембраны, плотность распределения CD4+- и CD8+-лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки бронхов, удельный объем капилляров закрытого типа, а также концентрация трансформирующего фактора роста 1, активность эластазы в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте являются наиболее информативными показателями при дифференциальной диагностике бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких.
Впервые обнаружено, что тканевые изменения слизистой оболочки бронхов коррелируют с морфологическими параметрами и функциональными особенностями клеток воспалительного инфильтрата, концентрацией иммунорегуляторных молекул, цитокинов и ростовых факторов в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте, а также с клинико-функциональными тестами, отражающими выраженность бронхообструктивного синдрома при тяжелой бронхиальной астме и тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких.
Впервые установлены положительные взаимосвязи между плотностью распределения макрофагов и дегранулированных эозинофилов в собственной пластинке слизистой оболочки бронхов, выраженностью экспрессии мРНК генов М3 – холинорецептора, Н1 – рецептора на этих клетках, концентрацией интерлейкина-4 в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте, а также показателями ПК20 (предельной концентрацией метахолина, вызывающей падение объема форсированного выдоха на 20% за 1 секунду) при бронхиальной астме фенотипа «brittle» (нестабильная форма).
Толщина базальной мембраны эпителиальной выстилки бронхов, концентрация трансформирующего фактора роста 1 в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте у пациентов с «астмой с фиксированной бронхообструкцией» (гормонозависимой) положительно коррелировала как с длительностью болезни, так и с параметрами суточной лабильности бронхов.
Выявлены отрицательные корреляции между плотностью распределения фибробластов, межэпителиальных нейтрофилов и СD8+-лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки бронхов, концентрацией фактора некроза опухоли в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте, а также индексом Тиффно (отношением объема форсированного выдоха за 1 секунду к жизненной емкости легких) при тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких.
Практическая значимость работы
Определение концентрации интерлейкина-4, трансформирующего фактора роста-1, активности эластазы и 1-протеиназного ингибитора в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте можно использовать для дифференциальной диагностики тяжелой бронхиальной астмы и тяжелой стадии хронической обструктивной болезни легких. Абсолютное число CD3+-СD4+-лимфоцитов, концентрация интерлейкина-8, 10 в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте являются значимыми маркерами при разделении тяжелой терапевтически резистентной бронхиальной астмы на «brittle» фенотип (нестабильную) и «астму с фиксированной бронхообструкцией» (гормонозависимую).
Множественные корреляции между концентрацией про- и противовоспалительных цитокинов, трансформирующего фактора роста-1, а также активностью эластазы и 1-протеиназного ингибитора в бронхиальных смывах и индуцированной мокроте позволяют рекомендовать индуцированное мокротоотделение как неинвазивный тест для идентификации варианта, выраженности и активности воспалительного процесса в дыхательных путях.
Результаты работы могут быть использованы в педагогическом процессе на кафедрах морфологии, гистологии, патологической анатомии и патологической физиологии, а также в аллергологических и пульмонологических отделениях функциональной диагностики научно-исследовательских институтов и учреждений практического здравоохранения.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах морфологии и общей патологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России; патологической анатомии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России; фундаментальных основ клинической медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России; госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.
Положения, выносимые на защиту:
-
К ведущим морфологическим признакам, определяющим резистентность к проводимой терапии у пациентов с тяжелой бронхиальной астмой, относятся усиленная дегрануляция тучных клеток в слизистой оболочке бронхов, сочетающаяся с гипертрофией бокаловидных экзокриноцитов, уплотнением в них секреторных везикул и расширением цистерн эндоплазматического ретикулума.
-
Тяжелая терапевтически резистентная бронхиальная астма «brittle» фенотипа (нестабильная астма) по тканевыми, клеточными и молекулярными признакам отличается от тяжелой терапевтически резистентной бронхиальной астмы фенотипа «астма с фиксированной бронхообструкцией» (гормонозависимой).
-
Ультраструктурные признаки регенераторно-пластической недостаточности эпителиоцитов бронхиальной стенки, периваскулярный фиброз, увеличение плотности распределения CD8+-цитотоксических клеток, а также эндотелиальная дисфункция капилляров слизистой оболочки бронхов ассоциированы с тяжелой стадией хронической обструктивной болезни легких.
-
Тяжелая бронхиальная астма и тяжелая стадия хронической обструктивной болезни легких формируют характерные для каждой нозологии патоморфологические признаки, которые могут идентифицироваться при исследовании бронхиальных смывов и индуцированной мокроты.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и представлены на Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию С.П. Карпова (г. Томск, 2003), Европейском респираторном конгрессе (Австрия, г. Вена, 2003) Швеция, г. Стокгольм, 2007) Всероссийской конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии, гистогенез и регенерация тканей" (г. Санкт-Петербург, 2004), Межрегиональной конференции "Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально значимых заболеваниях" (г. Новосибирск, 2004), V, VIII, X международных конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2004, 2007, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов (г. Новосибирск, 2007), VIII, IX международных конгрессах «Здоровье и образование XXI века» (г. Москва, 2007, 2008,), Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и в эксперименте» (г. Тюмень, 2008), Межрегиональной конференции «Актуальные проблемы медицины» (г. Абакан, 2008), IX, X конгрессах Международной ассоциации морфологов (г. Бухара, 2008; г. Ярославль, 2010), Международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (г. Санкт-Петербург, 2010), III Эмбриональном симпозиуме Международной ассоциации морфологов «Югра-Эмбрио-2011 «Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (г. Ханты-Мансийск, 2011), заседании экспертной комиссии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (г. Томск, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 40 работ, в том числе 22 полнотекстовые статьи в журналах из перечня ВАК РФ, 2 работы в зарубежной печати, 1 монография.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 344 страницах машинописного текста, иллюстрирована 132 рисунками и 52 таблицами и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, заключение и выводы. Список использованной литературы содержит 332 наименование, из них 110 - отечественных и 222 иностранных источников.
Патоморфоз бронхиальной астмы
Согласно современным исследованиям доминантными признаками при развитии БА являются генетическая предрасположенность к атопии, высокий ее индекс и гиперреактивность бронхиальных путей. Известны хромосомные кластеры (1 lql3, 5q31-33,13q), в которых тандемно располагаются гены, контролирующие иммунные реакции (HLA, гены Т-клеточных рецепторов TCR) и синтез провоспалительных цитокинов (интерферона-у, фактора роста тучных клеток, конститутивной и индуцибельной NO-синтазы, интерлейкинов-4,5,9,12,13 (IL-4,5,9,12,13), гранулоцитарно-макрофагального колониестиму-лирующего фактора (GM-CSF). Для больных БА характерен высокий уровень полиморфизма генов, регулирующих синтез этих медиаторов [25, 34, 64, 65, 69,97,140,225,242,320].
Воспаление дыхательных путей - ключевой момент патогенеза астмы [56, 79, 102, 107, 314].
У большого числа больных развитие БА связано с IgE-опосредованными механизмами. Основным звеном в индукции иммунного ответа при атопической (экзогенной) БА является активация Т-лимфоцитов антиген-презентирующими дендритическими клетками с поляризацией недифференцированных Т-хелперов (ТЪО) в Т-хелперы-2 (ТЬ2-подтип). Регуляция данного процесса осуществляется IL-4,5,9,13.
Важное значение при астме имеет дисбаланс между противо- и про-воспалительными цитокинами с доминированием последних. Среди широкого спектра данных иммунорегуляторных молекул ведущая роль при БА принадлежит интерлейкину-10 (IL-10), интерферону-у (INF-y) [23, 97, 193, 218].
В последние годы установлено, что при тяжелой форме астмы воспалительные реакции не всегда протекают по ТЪ2-механизму, а возможно формирование неэозинофильной модели воспаления с вовлечением тучных клеток (ТК), МФ, нейтрофилов (НФ) и основных иммунорегуляторных молекул. В этой связи стратегически оправданным является цитоморфологический анализ профиля основных эффекторных клеток, молекулярных маркеров в развитии тяжелой БА.
Постоянная персистенция хронического аллергического воспаления в слизистой оболочке воздухоносных путей, поддерживаемая цитокинами, хе-мокинами и ансамблем иммунокомпетентных клеток, может приводить к ее структурным нарушениям. Считается, что ремоделирование СОБ - доминантный признак тяжелого течения астмы.
В основе развития структурных нарушений в бронхопроводящей системе лежит эпителиально-стромальная дисфункция. В этой связи изменение гистоархитектоники бронхиальной стенки при астме затрагивает как эпителиальный пласт (десквамация и метаплазия эпителия), так и собственную пластинку СОБ (фиброз, гипертрофия, гиперплазия гладкомышечных клеток, васкулярное и нейрогенное ремоделирование) [91, 93, 111, 128, 176, 209, 224, 242,331,332].
Литературные данные о роли определенных клеточных и молекулярных факторов, вызывающих изменение структурной архитектоники бронхопроводящей системы при тяжелой БА, немногочисленны и касаются преимущественно полиморфно-ядерных лейкоцитов, базофилов и ТК.
Значение эозинофильных гранулоцитов в структурных нарушениях бронхиальной стенки при тяжелых формах бронхиальной астмы
Эозинофилы (ЭФ) часто обнаруживаются в большом количестве в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), в биопсийном и аутопсийном материале больных БА не только во время обострения, но и в период ремиссии.
В крови их число увеличивается до 8-20 %, причем высокая эозинофи-лия объясняется либо реакцией на медикаментозное лечение, либо глистной инвазией, сочетающейся с БА [92, 245]. Наибольшее количество циркулирующих ЭФ выявляется у больных атопической астмой легкой и средней степени тяжести [34, 82]. У этих групп пациентов дополнительно сообщается об увеличении клеток-предшественников ЭФ (CD34+, IL5Rct+) в костном мозге [86]. Считается, что повышенное содержание эозинофильных гранулоцитов в лаважной жидкости пропорционально эозинофилии крови [245, 274].
Биологически активные вещества, выделяемые ЭФ, стимулируют сокращение гладкой мускулатуры бронхов, секрецию слизи, оказывают повреждающее действие на эпителий стенок бронхиальных путей, вызывают дегрануляцию ТК и базофилов. Инициируя позднюю фазу воспаления, ЭФ приводят к развитию бронхиальной гиперреактивности [46, 91, 93, 103, 274].
Миграция ЭФ из кровеносных сосудов к месту воспаления связана с повышенной экспрессией специфических адгезивных молекул на эндотелии: Р- и Е-селектина (ELAM-1,2), молекул межклеточной адгезии (ICAM-1, CD54) и адгезии сосудистой стенки (VCAM-1) [93].
Доминирующими факторами дифференцировки, хемотаксиса, рекрутирования эозинофилов являются IL-5, CCL11 (eotaxin-1), CCL5 (RANTES). Перечисленные цитокины и хемокины обладают эотаксическими свойствами и пролонгируют выживаемость ЭФ в тканях-мишенях в связи с блокированием апоптоза [22, 32,49, 91,245].
В литературе нет четкого ответа на вопрос, влияет ли количество и функциональная активность ЭФ в бронхах на структурную перестройку бронхиального дерева, функции внешнего дыхания и, следовательно, на степень тяжести и полиморфизм астмы?
Некоторые исследователи подтверждают существование взаимосвязи между степенью тяжести астмы, количеством ЭФ и их медиаторов в крови, индуцированной мокроте (ИМ), БАЛ и образцах биоптатов бронхиального дерева. Так, в работах Огородовой Л.М., Сазонова А.Э. Деева И.А., Никитиной Л.Ю. (2005-2009) на культурах клеток и экспериментальной модели БА показана роль IL-5 и полиморфизма его гена в развитии тяжелого течения болезни и получены уникальные данные о снижении апоптотической гибели ЭФ, более выраженные у пациентов с тяжелой астмой [22, 32, 58].
Огородова Л.М., Кобякова О.С. и соавт. (2006) продемонстрировали различия по основным клеточным и молекулярным маркерам, ими выявлены значительные расхождения в патогенетических характеристиках отдельных фенотипов астмы, что было обусловлено гетерогенными патоморфологиче-скими и генетическими механизмами, лежащими в основе формирования данного типа заболевания [34, 41, 56,191].
Функциональная активность ЭФ связана с цитокинами, высокоосновными белками и ростовыми факторами, локализующимися в гранулах этих клеток [111, 274]. Установлено, что широкий спектр цитокинов, продуцируемых ЭФ (IL-4, 5, 11, 13), обладают не только цитотоксическим, аутокрин-ным, паракринным действием, но и активизируют функции фибробластов, НФ[91,317].
Описанные в многочисленных литературных источниках ассоциации концентрации IL-4, 5 в лаважной жидкости с выраженностью эозинофилии, субэпителиального фиброза, степенью тяжести заболевания свидетельствуют о нарушении процессов фиброзообразования у пациентов с тяжелой формой болезни [47, 78, 91, 111,112,115,246, 274].
Вопрос участия ЭФ в механизме фиброзообразования при тяжелых гетерогенных формах БА остается открытым. Установлено, что эозинофильные гранулоцити являются важными продуцентами металлопротеиназы-9, а НФ, МФ, эпителиальные клетки - тканевого ингибитора металлопротеиназы-9; повышение концентрации последнего в бронхиальных секретах на фоне сниженного или нормального количества металлопротеиназы-9 является важным признаком субэпителиального фиброза и коррелирует с выраженностью бронхиальной обструкции и тяжестью астмы [112, 115, 130, 167, 240, 246, 300, 304, 305].
Цитотоксический эффект ЭФ реализуется через высвобождение высокоосновных протеинов: главного основного протеина (major basis protein -МВР), эозинофильного катионного протеина (eosinophil cationic protein -ECP), эозинофильного нейротоксина, эозинофильной миелопероксидазы, а также активных радикалов кислорода, эйкозаноидов (сульфидопептидных лейкотриенов). Показано, что только МВР непосредственно влияет на процессы ремоделирования дыхательных путей через стимуляцию пролиферации фибробластов и усиления выработки IL-6, другие белки действуют опосредованно через повреждение эпителия [47, 78, 91, 184, 185, 317].
Морфологическая характеристика слизистой оболочки бронхов у больных различными формами бронхиальной астмы
Светооптически в собственной пластинке СОБ у пациентов со сред-нетяжелой БА наблюдались явления нарушения гемодинамики: субэпителиальный и периваскулярный отек, венозное полнокровие, запустевание и спазм артериол и мелких артерий (рис. 1).
Микроциркуляторное звено полнокровно, нередко отмечались явления лейкостаза, сочетающиеся с краевым стоянием полиморфно-ядерных лейкоцитов в капиллярах, прекапиллярах и артериолах.
Субэпителиальный отек собственной пластинки СОБ у этой группы пациентов нередко сочетался с меж- и внутриэпителиальным отеком (рис. 2).
Строма среднедолевого бронха у пациентов с БА средней степени тяжести отечна, коллагеновые волокна извитые, набухшие. У всех пациентов с этой формой БА в собственной пластинке СОБ обнаруживался смешанный диффузный лимфоплазмоцитарный инфильтрат с преобладанием эозино-фильных гранулоцитов (рис. 3).
В этих местах бронхиальный эпителий СОБ имел дистрофические и деструктивные изменения (грубодисперсная структура хроматина, зернистость и вакуолизация цитоплазмы, отсутствие ресничек), встречались фокусы усиленной десквамации эпителиоцитов и оголение базальной мембраны (рис. 4).
В эпителиальном пласте увеличивалась численность экзокриноцитов по отношению к реснитчатым эпителиоцитам до 1:3 (норма 1:4) с выраженными признаками гиперсекреции слизи (см. рис. 2, 3).
Электронно-микроскопическое исследование бронхобиоптатов у пациентов с БА средней степени тяжести показало «разобщение» эпителиального пласта за счет отека и резкого расширения межклеточных пространств с формированием многочисленных длинных цитоплазматических отростков (рис. 5).
В собственной пластинке СОБ у пациентов с данным фенотипом БА выявлялись участки с локальным нарушением целостности эпителиального пласта (рис. 6).
Альтерация реснитчатого аппарата эпителиоцитов сочеталась с формированием мелких цитоплазматических выростов и компактным скоплением множества частично деструктивных митохондрий в апикальной части клетки (рис. 7). В биоптатах СОБ при среднетяжелой БА обращала на себя внимание неоднородность ультраструктурной организации реснитчатых эпителиоцитов. Встречались клетки с частичным просветлением цитоплазматического матрикса и вакуолизацией эндоплазматической сети (рис. 8).
В популяции бокаловидных клеток определялись клетки с плотной упаковкой везикул слизистого секрета в апикальной части эпителиоцита, а также с признаками частичного или полного нарушения их целостности (рис. 20). Как правило, в этих клетках определялись множественные удлиненные диктиосомы гиперплазированного пластинчатого комплекса Гольджи с полиморфными осмиофильными секреторными гранулами (рис. 21).
У некоторых пациентов с тяжелой терапевтически чувствительной формой БА в бокаловидных клетках выявлялись как электронно-плотные, так и электронно-прозрачные секреторные гранулы (рис. 22).
Генетический материал в ядрах реснитчатых и бокаловидных эпите-лиоцитов у пациентов с тяжелой терапевтически чувствительной БА чаще встречался в виде эухроматина, который занимал центральное положение. В то же время в ядрах некоторых клеток, напротив, преобладал гетерохрома-тин, расположенный преимущественно в примембранной зоне. Нередко отмечали агрегацию (компактизацию) хроматина (рис. 23).
Бокаловидные клетки содержат большое количество прозрачных, светлых пузырьков, некоторые находились в стадии высвобождения секрета. Концевые отделы белково-слизистых желез собственной пластинки СОБ расширены, в некоторых из них обнаружены увеличенные в объеме миоэпи-телиальные клетки, оплетенные тонкими пучками коллагеновых волокон (рис. 26).
В бронхобиоптатах при тяжелой БА фенотипа «brittle» обращало на себя внимание большое количество эндокриноцитов, нередко находящихся в непосредственной близости друг от друга. В основном популяция этих клеток представлена «закрытыми эндокринными клетками», которые чаще всего локализовались в основании желез, имели округлую или треугольную форму с расширенным базисом и резко суженным апексом, мелким «косточковид-ным» ядром и слабо окрашенной «пенистой» цитоплазмой, а в эпителиальном пласте апудоциты представлены «открытым типом» (рис. 27).
Морфометрический анализ слизистой оболочки бронхов при различных фенотипах тяжелой терапевтически резистентной формы бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких
При морфометрическом исследовании биоптатов СОБ у пациентов с фенотипов БА «brittle» и «астма с фиксированной бронхообструкцией» нами констатировались более низкие значения УОбзэ, удельного объема соединительной ткани, высоты эпителиального пласта и более высокие параметры УОжел, УОмс и ширины базальной мембраны, чем при тяжелой стадии ХОБЛ. Это документировано самыми высокими значениями бокаловидно-клеточного индекса и самым низким базально-клеточным коэффициентом в бронхобиоптатах пациентов с обоими фенотипами астмы (табл. 13).
В результате морфометрического анализа УО митохондрий, ЭПС и ли-зосом в эпителиальных клетках СОБ установлено статистически значимое (р=0,009) увеличение площади этих органоидов в реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитах у пациентов с терапевтически резистентными формами БА фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной бронхообструкцией», в отличие от ХОБЛ. Обращают на себя внимание более высокие значения ЯЦО в базальных эпителиоцитах и более низкие - в реснитчатых и бокаловидных клетках у пациентов с обоими фенотипами тяжелой терапевтически резистентной БА по сравнению с пациентами, страдающими ХОБЛ (см. табл. 8, 11).
Дискриминантный анализ позволил выявить дифференциальные морфологические и функциональные критерии фенотипических различий между тяжелыми терапевтически резистентными формами БА и ХОБЛ.
Установлено, что наибольший вклад в различия клинико-морфологических тестов между астмой «brittle и ХОБЛ вносили такие показатели, как АОФВь ЯЦО и УО митохондрий в бокаловидных эпителиоцитах (табл. 14).
Решая уравнение ЛДФ на основе морфометрических параметров у лиц, страдающих БА фенотипа «астма с фиксированной бронхообструкцией» и тяжелой формой ХОБЛ, мы показали более высокие дискриминантные свойства для базально-клеточного индекса, ширины базальной мембраны и УО цистерн ЭПС в бокаловидных эпителиоцитах (табл. 15).
Резюме. Более тяжелое течение хронической обструктивной болезни легких сопровождалось увеличением высоты эпителиального пласта преимущественно за счет удельного объема базальных эпителиоцитов с одновременным уменьшением удельного объема митохондрий, эндоплазматиче-ской сети в эпителиальных клетках бронхов. Результаты дискриминантного и корреляционного анализа показали ведущую роль определения форсированной жизненной емкости легких, удельного объема покровного эпителия в прогнозе утяжеления хронической обструктивной болезни легких.
Слизистая оболочка бронхов больных с обоими фенотипами тяжелой формы бронхиальной астмы, в отличие от пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, характеризовалась более высокими значениями бо-каловидноклеточного индекса, ширины базальной мембраны и более низкими показателями высоты эпителия, относительного объема соединительной ткани и ядерно-цитоплазматического отношения в базальных эпителио-цитах.
Морфометрический анализ ультраструктур в клетках эпителиального пласта у пациентов с тяжелыми терапевтически резистентными формами бронхиальной астмы продемонстрировал увеличение удельного объема митохондрий, цистерн эндоплазматического ретикулума и лизосом по сравнению с лицами, страдающими тяжелой формой хронической обструктивной болезни легких.
В результате решения уравнения линейной дискриминантной функции обнаружено, что фенотипические различия между астмой «brittle» и тяжелой стадией хронической обструктивной болезни легких связаны с показателями обратимости бронхиальной обструкции после ингаляции бронхолитика, ядерно-цитоплазматическим отношением, удельным объемом митохондрий в бокаловидных эпителиоцитах, а между фенотипом «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» и тяжелой стадией ХОБЛ - с базально-клеточным индексом, шириной базальной мембраны, удельным объемом эн-доплазматической сети в бокаловидных эпителиоцитах.
Клеточные и молекулярные маркеры в бронхиальном содержимом при тяжелой терапевтически чувствительной и терапевтически резистентной формах бронхиальной астмы
Опираясь на данные бронхоскопии, в предыдущих разделах настоящего исследования мы показали ассоциации между проградиентно текущим воспалением в СОБ, тяжестью течения, а также отсутствием чувствительности к терапии и фенотипическими различиями БА.
В данной части работы проводилась сравнительная оценка цитологических, иммунологических, биохимических параметров БС и ИМ у пациентов с терапевтически резистентной и чувствительной астмой и устанавливались диагностические критерии фенотипических различий тяжелых форм БА.
Тяжелая терапевтически резистентная форма БА фенотипа «brittle» (нестабильная форма) отличалась от терапевтически чувствительной астмы статистически значимым (р=0,021) повышением общей клеточности БС и ИМ, преимущественно за счет гистиомакрофагальных клеточных элементов, ЭФ. Общее количество НФ у пациентов с астмой «brittle» было статистически значимо (р=0,038) ниже, чем у больных с терапевтически резистентной БА(рис. 116,117).
Оценивая популяционный статус ЛФ в БС и ИМ при исследуемом фенотипе астмы, мы констатировали повышение общего числа CD4+-, CD19+-клеток (табл. 41). При терапевтически резистентной форме БА фенотипа «brittle» соотношение CD4+/CD8+T-лимфоцитов составляло 3,592:1 (соответственно при тяжелой терапевтически чувствительной БА - 3,251:1).
Обращают на себя внимание существенно более высокие значения маркеров атопии у пациентов с тяжелой астмой «brittle»: JgE - 565,7±33,8 при «brittle»; 348,9±1,06 при тяжелой терапевтически чувствительной форме; IL-4/TNF-Y- 5,191 (3,124-6,248) при «brittle»; 2,638 (1,244-3,086) при тяжелой терапевтически чувствительной форме. Эти пациенты характеризовались более низкими значениями IL-8, 10 и повышением концентрацииTGF-Pi в БС и ИМ по сравнению с больными тяжелой терапевтически чувствительной формой БА (рис. 118,119).
Тяжелая терапевтически резистентная форма БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» (гормонозависимая) отличалась от астмы «brittle» и терапевтически чувствительной формы увеличением количества НФ в БС и ИМ. Число Г-МФ и ЭФ в исследуемых биологических материалах у больных астмой с фиксированной бронхиальной обструкцией (гормонозависимой) статистически значимо (р=0,006) ниже, чем у пациентов двух других групп (см. рис. 116, 117).
Оценка популяционного статуса ЛФ бронхиального содержимого при БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» (гормонозависимая) показала достоверное (р=0,008) снижение общего числа CD4+-, CD 19 -клеток с одновременным повышением количества CD8+-лимфоцитов по сравнению с астмой «brittle» и терапевтически чувствительной формой болезни, что отражалось в самом низком соотношении CD4+/CD8+T-лимфоцитов -1,109:1 (табл.41).
При анализе молекулярных маркеров воспаления в БС и ИМ у пациентов с астмой с фиксированной бронхиальной обструкцией (гормонозависимой), в отличие от двух других исследуемых форм астмы, выявлялось повышение концентрации IL-8, TNF-a. Низкие показатели атопии у пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» (гормонозависимая) проявлялись в снижении концентрации JgE до 107,34±14,5 и IL-4/TNF-y до 1,545 (1,173-2,245). Концентрация TGF-Pi в БС и ИМ при исследуемом фенотипе астмы статистически значимо (р=0,011) превышала показатели как при астме «brittle», так и при терапевтически чувствительной форме болезни (см. рис. 118,119).
В связи с тем что молекулярная основа реализации определенного типа воспаления, эпителиального повреждения и бронхиального фиброза при астме изучена недостаточно, нами предпринята попытка оценить показатели экспрессии рецепторов TGF-pi в клетках воспалительного инфильтрата и бронхиальных эпителиоцитах СОБ, а также концентрацию нейтрофильной эластазы и ее ингибитора в БС и ИМ при различных фенотипах тяжелой терапевтически чувствительной и резистентной к терапии БА.
При иммуногистохимическом исследовании бронхобиоптатов обнаружено, что рецепторы к TGF-Pi представлены на клетках бронхиального эпителия и МФ собственной пластинки СОБ (рис. 120).
Самая высокая экспрессия TGF-PJ на бронхиальных эпителиоцитах наблюдалась при астме с фиксированной бронхиальной обструкцией по сравнению с астмой «brittle» и терапевтически чувствительной формой болезни (рис. 121). Экспрессия TGF-PI на МФ собственной пластинки СОБ не отличалась у пациентов с терапевтически чувствительной и различными фенотипами терапевтически резистентной БА.
Сравнительная оценка активности эластазы и а і-протеиназного ингибитора показала, что самые высокие значения ферментативной и самые низкие показатели антипротеазной активности наблюдались в ИМ и БС при фенотипе «астма с фиксированной бронхообструкцией» по сравнению с астмой «brittle» и терапевтически чувствительной формой болезни (табл. 42).
При оценке значимости отдельных маркеров воспаления в формирование различий между группами больных с терапевтически чувствительной и терапевтически резистентной БА установлено, что доминантная роль при разделении пациентов на эти группы принадлежит концентрации IL-10 в БС и ИМ, а также экспрессии TGF-(3i в бронхиальных эпителиоцитах СОБ (табл. 43).
Количество СОЗ+-клеток и концентрация IL-8 играют ключевое значение в фенотипических различиях между анализируемыми группами пациентов с тяжелой терапевтически резистентной БА (табл. 44).
При проведении корреляционного анализа между цитологическими, иммунологическими и биохимическими параметрами БС и ИМ обнаружены множественные прямые и обратные ассоциации в исследуемых группах.
При тяжелой терапевтически резистентной форме БА фенотипа «brittle» определялись статистически значимые (р=0,008) положительные корреляции между концентрациями IL-4 в БС и в ИМ. Концентрация IL-4 в ИМ имела статистически значимые (р=0,034) положительные связи с абсолютным количеством ЭФ, TGF-P! и отрицательные (р=0,021) - с активностью эластазы в БС, которая формировала прямые ассоциации с абсолютным количеством бокаловидных клеток (р=0,016). Важно отметить, что концентрация IL-4 в ИМ положительно коррелировала с таким клинико-функциональным тестом, как суточная лабильность бронхов (р=0,023) (рис. 122).
При тяжелой терапевтически резистентной форме БА «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» концентрация TGF-Pi, TNF-a в БС формировала положительные ассоциации с аналогичными параметрами в ИМ (р=0,01), а также с абсолютным количеством бронхиальных эпителиоцитов с признаками дистрофии (р=0,03). Активность эластазы образовывала положительные взаимосвязи (р=0,008) с абсолютным количеством бронхиальных эпителиоцитов с признаками дистрофии. Функциональная активность агпротеиназного ингибитора положительно коррелировала (р=0,007) с абсолютным количеством гистиоцитов-макрофагов. Установлено, что концентрация TGF-Pi в ИМ образовывала отрицательные ассоциации с показателями суточной лабильности бронхов (р=0,006) (см. рис. 122).
Вышеописанные положительные и отрицательные ассоциации между клеточными и молекулярными маркерами в БС и ИМ подтверждают их участие в развитии гетерогенных типов воспаления и ремоделирования бронхиальной стенки при БА фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией».
