Содержание к диссертации
Введение
1. Общая организация секреторного пути 12
1.1. Транслокация белка из цитозоля в эндоплазматический ретикулум (ЭР) 12
1.2. Внутриклеточная система транспорта секреторных белков 12
1.2.1. Комплексы окаймления СОРИ и COPI участвуют в транспорте белков между ЭР и аппаратом Гольджи ,.,
1.2.2. Клатриновое окаймление участвует в транспорте белков из поздних компартментов аппарата Гольджи в лизосомы (вакуоль), от плазматической мембраны в аппарат Гольджи или лизосому (вакуоль) 15
1.2.3. Секретируемые белки покидают эукариотическую клетку преимущественно конститутивным образом ,fi
1.2.4. Слияние транспортных везикул с мембранами происходит при участии цитозольиыхи мембранных белков . ,7
1.3. Сортировка секреторных белков в секреторных путях 18
1.3.1. Сортировка растворимых белков 18
1.3.2. Сортировка мембранных белков, проходящих начальные этапы секреторного "У 20
1.3.2.1. Сигналы локализации белков в мембранах аппарата Гольджи 21
1.3.3. Сигналы сортировки трансмембранных белков в лизосомы 23
1.4. Модификации секреторных белков 24
1.4.1. Гликозилирование 24
1.4.1.1. N-гликозилирование 24
1.4.1.2. О-гликозилирование 26
1.4.2, Протеолитический процессинг 26
2. Контроль качества укладки белков в ЭР (ERQC) 28
2.1. Сборкам укладка белков происходит в ЭР 28
2.1.1. В дрожжах S. cerevisiae идентифицированы сборочные факторы 28
2.2. Контроль качества укладки белков в ЭР 29
2.2.1. Роль моноглюкозилированиых N-гликозидов в системе контроля качества (ERQC) 29
2.2.2. Роль кальнексина и кальретикулипа в системе контроле качества (ERQC) 30
2.3. Модель контроля качества укладки белков в ЭР млекопитающих 30
2.4. Контроль качества укладки белков отличается у дрожжей Sch. pombe, S.cerevisiae и млекопитающих
2.5. Маннозидаза I участвует в формировании сигнала для системы деградации неправильно свернутых белков »
2.6. Альтернативные модели системы контроля качества в клетках млекопитающих.. 33
2.7. ERp57 в комплексе с кальнексином/кальрети кули ном способствует правильной укладке белков ~ .
2.8. Модель контроля качества укладки белков в дрожжах S. cerevisiae - контроль качества без участия кальнексина, кальретикулипа и глюкозилтрансферазы (GT) -,
2.9. Гомолога компонентов системы укладки белков в дрожжах Н. polymorpha 36
3. Ответ клетки на накопление неправильно свернутых белков (UPR) 36
3.1. НАС J -активация механизма UPR 37
4. Деградация белков в секреторном пути 38
4.1. Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD) 38
4.1.1. Компоненты система убиквитинилирования в клетках дрожжей 39
4.1.2. Компоненты системы ERAD в клетках дрожжей 40
4.2. Деградация белков в вакуоли 42
4.2.1. Вакуоль 42
4.2.2. Некоторые белки, проходящие путь секреции, направляются в вакуоль на деградацию 43
4.2.3. Рецептор вакуолярного сортинга VpslOp способен направлять в вакуоль
неправильно свернувшиеся белки ,~
Постановка задачи исследования 45
Материалы и методы 47
1. Штаммы микроорганизмов 47
1.1. Условия культивирования 47
1.2. Штаммы бактерий . coli , 47
1.2.1. Среды для выращивания Е. coli 47
1.3. Штаммы дрожжей 47
1.3.1. Среды для выращивания дрожжей 55
2. Генетические методы 55
2.1. Трансформация дрожжей Н. polymorpha и S. cerevisiae 55
2.2. Выделение и анализ ДНК клеток Н. polymorpha 56
2.3. Гибридизациониый анализ дрожжевой ДНК 56
3. Клонирование 57
3.1, Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 57
3.2. Трансформация Е. coli 57
4. Методы работы с белками 58
4.1. Тестирование ферментативной активности uPA 58
4.2. Индукция экспрессии uPA в штаммах Н. polymorpha iiS. cerevisiae 60
4.3. Измерение суммарного клеточного белка (биуретовый метод) 60
4.4. Электрофорез и иммуноблоттинг 61
4.5. Анализ uPA из культуральной среды 61
4.6. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов 61
4.7. Определение количества uPA в препаратах культуральной среды или дрожжевых лизатах с использованием иммуноблоттинга
5. Получение антисыворотки против карбоксипептидазы Y (CPY) 63
6. Плазмнды 64
6.1. Место стыковки сигнальной последовательности с различными вариантами uPA 66
Результаты
- Комплексы окаймления СОРИ и COPI участвуют в транспорте белков между ЭР и аппаратом Гольджи
- Слияние транспортных везикул с мембранами происходит при участии цитозольиыхи мембранных белков
- Контроль качества укладки белков в ЭР
- Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD)
Введение к работе
Введение, Актуальность проблемы. Дрожжи являются удобным модельным объектом для изучения секреторного аппарата эукариотической клетки, поскольку позволяют эффективно использовать весь арсенал методов классической и молекулярной генетики. Сходство организации секреторного пути у разных эукариот позволяет использовать дрожжи в качестве организма хозяина для экспрессии секреторных белков других эукариотических организмов. При этом белок должен приобрести правильную конформацию и различные модификации. Для достижения более высоких выходов чужеродных белков исследователи стали использовать в качестве организмов-хозяев не только традиционный объект молекулярно-генетических исследований -Saccharomyces cerevisiae, но и другие виды дрожжей, в том числе метилотрофные дрожжи Hansenula polymorpha. Однако, многие процессы, происходящие в секреторном пути, не консервативны и существенно дивергировали у разных организмов в ходе эволюции. Очевидно, что с этим связано то, что многие белки высших эукариот неспособны эффективно секретироваться клетками дрожжей. Одним из таких белков является человеческий активатор плазминогена урокиназного типа (иРА). Изучение факторов, влияющих на эффективность секреции рекомбинантных белков клетками дрожжей, может дать ключ к пониманию эволюционных особенностей организации дрожжевого секреторного аппарата, что, в свою очередь, позволит направленно менять свойства реципиентных штаммов и делать их пригодными для получения активных и правильно модифицированных белковых продуктов.
Цели и задачи исследования. Данная работа была направлена на изучение эволюционных особенностей дрожжевого секреторного аппарата, обуславливающих низкую эффективность секреции белков высших эукариот клетками дрожжей. В связи с этим были поставлены следующие
экспериментальные задачи: \ -V^*'***'**'
«ЙЕЙ/
1) Выяснить причины неэффективной секреции иРА клетками дрожжей.
2) Определить, какие домены иРА определяют низкую эффективность
секреции.
3) Изучить механизмы, приводящие к увеличению эффективности секреции
иРА в клетках мутантов ори24, ret 1-27 wpmtl Н. polymorpha.
Научная новизна. Несмотря на то, что ранее предпринимались попытки получить дрожжевые штаммы продуценты секретируемого иРА, высокого уровня секреции этого белка клетками дрожжей достичь не удавалось. В данной работе впервые было показано, что это ограничение уровня секреции связано не с недостаточным уровнем синтеза иРА, а с тем, что лишь небольшая часть синтезирующегося белка преодолевает дрожжевой секреторный аппарат и секретируется. Было показано, что иРА плохо секретируется клетками дрожжей по причине неэффективного сворачивания в эндоплазматическом ретикулуме, что при определенных условиях приводит к образованию высокомолекулярных агрегатов этого белка. Было показано, что соотношение белка в агрегированной и растворимой форме в клеточных лизатах зависит от его способности приобретать правильную конформацию и секретироваться. Это наблюдение было использовано для изучения причин увеличения уровня секреции иРА у ряда мутантных штаммов и было продемонстрировано, что мутации в генах OPU24, RET1 и PMTJ Н. polymorpha приводят к улучшению условий для правильного сворачивания иРА в дрожжевом ЭР, за счет чего увеличивается эффективности секреции иРА
Практическое значение работы. В диссертации были разработаны подходы, позволяющие увеличить продукцию рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа клетками дрожжей. Эти подходы могут быть также использованы для увеличения продуктивности дрожжевых продуцентов других рекомбинантных белков.
Апробация работы. Основные результаты, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Москва, 2004), 8-ой Международной Пущинской
школе-конференции молодых ученых (Москва, 2004), III съезде Российского Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 2-ой Международной конференции сообщества по изучению Hansemtlapolymorpha (Tenerife, 2002).
Публикации, По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисных сообщений.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на <Д30» страницах и включает » рисунка, « Є » таблиц и список цитируемой литературы, содержащий <Рт> ссылок.
Комплексы окаймления СОРИ и COPI участвуют в транспорте белков между ЭР и аппаратом Гольджи
Для того, чтобы белки оставались в полости ЭР, существует два дополняющих друг друга механизма - система задержки и система возвращения белков в ЭР (Teasdaleand Jackson, 1996). Определенные последовательности внутри полипептидной цепи белков ЭР представляют собой сигнал «удерживания» белка в полости ЭР, в то время как дополнительные аминокислотные последовательности необходимы для возвращения в ЭР белков, покинувших этот компартмент. Растворимые ретикулярные белки содержат па С-конце последовательность KDEL (у млекопитающих) или K/HDEL (у дрожжей), которая необходима для возвращения белка из аппарата Гольджи (Mimro and Pelham, 1987; Pelham et al, 1988). Сигнальная последовательность H/KDEL узнается в аппарате Гольджи рецептором этой последовательности - Erd2p (Lewis and Pelham, 1990; Semenza et al., 1990). Этот рецептор связывается с последовательностью H/KDEL в Гольджи -компартменте, обладающем слабокислым рН, и отсоединяется в полости ЭР (Wilson et а/., 1993). Делеция этой последовательности приводила к секреции ретикулярных белков, а добавление этой последовательности к секреторным белкам вызывало перераспределение таких белков в полость ЭР (Munro and Pelham, 1987). Однако отрезание последовательности HDEL от жизненно важного белка Каг2р (ВІР) не было летально для клеток дрожжей (Semenza et al., 1990), предполагается, что необходимое количество Каг2р удерживается в полости ЭР, то есть существует дополнительный механизм(ы) для локализации белка Каг2р в ЭР.
Изучение различных ретикулярных белков показало, что локализация белков ЭР обеспечивается действительно двойным механизмом. Са -зависимый механизм задержки белков был обнаружен как основной для динамического рановеспого присутствия в ЭР белка кальретикулииа (Sonnichsen et al., 1994). При этом, последовательность KDEL, находящаяся па С- конце кальретикулииа, необходима для возвращения из Гольджи в ЭР небольшого количества этого белка (Sonnichsen et al., 1994). Таким образом, задержка в ЭР является доминантным механизмом в локализации кальретикулииа, в то время как возвращение представляет собой дополнительный механизм для правильной локализации этого белка.
Не так давно считалось, что экспорт белков из ЭР в аппарат Гольджи происходит без специального механизма, сортирующего белки, проходящие секреторный путь (Wieland et а!., 1987). Однако в ряде работ было показано, что белки, которые должны быть доставлены в аппарат Гольджи, отсортировывались и концентрировались в определенных участках ЭР, и затем упаковывались в везикулы, окаймленные комплексом СОРИ (Balche/ al., 1994; Barlowe et al, 1994; Bannykh et al., 1996; Rowe et al, 1996). Также было показано, что белки, обладающие гликозилфосфоинозитольными (GPI) якорями, транспортируются из ЭР в аппарат Гольджи отдельно - в везикулах, не содержащих других секреторных белков (Muniz et al., 2001). Однако механизм, который обеспечивает такую «селекцию», остается невыясненным.
В клетках млекопитающих лизосомные гидролазы «метятся» в цис-Гольджи при помощи маннозо-6-фосфатных групп, а в транс-сети Гольджи (TGN - trans Golgi network) такие гидролазы отсортировываются от других белков при помощи рецептора, узнающего маннозо-6-фосфат (M6PR) и направляются в лизосому (см. обзор Hille-Rehfeld, 1995).
В клетках дрожжей многие растворимые гидролазы (карбоксипептидаза Y (CPY), протеиназа А и протеиназа В (см. обзор Bryant and Stevens, 1998) в TGN отделяются от общего пула секреторных белков и направляются в вакуоль. Для этого необходимо наличие сигнала, иначе белок доставляется к клеточной поверхности. Для CPY была идентифицирована последовательность, которая представляла собой сигнал вакуолярного сортипга, - Q24RPL27 (Johnson et al., 1987; Vails et al., 1990). Нарушения в этой последовательности а также сверхэкспрессия CPY приводили к секреции этого вакуолярного белка, что свидетельствовало о существовании рецептора вакуолярного сортинга. И действительно, был идентифицирован рецептор, узнающий последовательность QRPL, им оказался продукт гена VPS10 (Marcusson et al, 1994). На данный момент существует модель сортинга CPY из позднего Гольджи в вакуоль: (1) неактивная форма CPY - npo-CPY, связывается с рецептором VpslOp в позднем Гольджи; (2) комплекс лиганд-рецептор транспортируется внутри транспортных пузырьков в эпдосомальпый (превакуолярный) компартмент (PVC); (3) npo-CPY отсоединяется от рецептора в PVC и транспортируется в мульти везикулярные тельца, затем в вакуоль, в то время как рецептор возвращается в поздний Гольджи и связывает следующую молекулу npo-CPY (Cereghino et al., 1995; Cooper and Stevens, 1996).
Для локализации мембранных белков также существуют сигналы сортировки. Erd2p - рецептор последовательности KDEL, как и другие трансмембранные белки I типа, содержит ди-лизиновый сигнал возвращения К(Х)КХХ: два аминокислотных остатка лизина находятся в положении «-3», «-4» или «-3», «-5» С-конца белка (Jackson et al., 1990; Lewis and Pelham, 1990; Semenza et al, 1990). Этот сигнал необходим для упаковывания мембранных белков в COPI-везикулы как в клетках млекопитающих (Jackson et al., 1993), так и в клетках дрожжей (Gaynor et al., 1994; Townsley and Pelham, 1994). Оказалось, что одна или сразу несколько белковых субъёдиниц коатомера COPI может содержать специфический участок (участки), которые и обеспечивают взаимодействие дилизинового мотива и коатомера (Gaynor et al., 1994; Letourneur et al., 1994). Таким образом, Erd2p связывает белки, содержащие последовательность KDEL, и возвращает их в ЭР в СОРІ-везикулах. Помимо того, что дилизиновый сигнал «возвращает» белки, у некоторых мембранных белков он играет роль сигнала задержки в ЭР. Например, химеры, содержащие последовательность ККАА активно задерживались в ЭР, и при этом их локализация не менялась в мутантах с нарушенным СОРІ окаймлением (Anderssone;a/., 1999).
Стоит отметить, что отбор ret мутантов дрожжей, который проводился с целью поиска мутантов, дефектных по возвращению (retrieval) белков, содержащих дилизиновую сигнальную последовательность, послужил одним из главных подтверждений in vivo роли COPI в обратном транспорте белков - из цис-Гольджи в ЭР. Дефект обратного транспорта проявлялся в секреции рецептора феромона (Ste2p), содержащего последовательность ККХХ. При этом был идентифицирован ген RET1, который кодирует а-субъединицу коатомера COPI в клетках дрожжей (Letourneur et al., 1994).
Слияние транспортных везикул с мембранами происходит при участии цитозольиыхи мембранных белков
Как в клетках млекопитающих, так и в дрожжевых клетках белки, проходящие пути секреции, принимают конечную третичную конформациго в ЭР. Механизм контроля качества укладки белков (ERQC - endoplasmic reticulum quality control) - это механизм узнавания и задержания неправилыю свернутых белков в ЭР. Он обеспечивает созревание транслоцировагшых белков и деградацию неправильно свернувшихся молекул. Система ERQC является важным «фильтром», благодаря ей неправилыю свернутые белки, а, следовательно, нефункциональные в дальнейшем продукты, элиминируются уже на начальном этапе секреторного пути.
До сих пор неизвестно, какое именно общее свойство белков используется эукариотическими организмами для контролирования правильности укладки белков в ЭР. Однако, тот факт, что система контроля качества (ERQC) должна уметь распознавать огромное множество различных белков, не обладающих гомологией и очевидной похожестью третичных структур, позволил предположить, что сами белки не могут обладать универсальной сигнальной детерминаитой. Возможно, для большинства белков эту роль может выполнять N- гликозид, присоединяемый к белку еще в процессе транслокации.
Интересные результаты, свидетельствующие о важной роли N-гликозидов белков, были получены Jakob и коллегами (Jakob et al., 1998). Они нарушили гены в дрожжах S. cerevisiae, кодирующие ферменты, вовлеченные как в синтез Dol-P-P гликозидов, так и в процессинг N- гликозида белка. И получили мутанты трех видов, которые содержали в ЭР гликопротсиды с одним, с двумя глюкозными остатками или без таковых. Когда эти мутанты подвергались стрессовым условиям, увеличение ВіР-кодирующей мРНК было намного больше в тех мутантах, где обнаруживались гликопротеиды с двумя глюкозными остатками или гликопротеиды без глюкозных остатков, чем в клетках мутантов с моноглюкозилированными гликопротеидами. Этот результат указывал на то, что моноглюкозилированные гликозиды были каким-то образом задействованы в процесс контроля качества ERQC и возможно способствовали укладке белков.
Одновременно с поиском общего свойства сворачиваемых белков широко изучалось влияние шаперонов на процесс укладки белков, среди них кальнексин -резидентный мембранный белок ЭР (CNX; Cnxlp у Sch.pombe и Cnelp у S.cerevisiae), и его растворимый гомолог - кальретикулин (CRT; отсутствует у дрожжей).
Первоначальные сведения об участии кальнексина и кальретикулина в ERQC свидетельствовали о том, что эти белки ведут себя как лектины, которые узнают моноглюкозилироваппые гликозиды высоко манпозного типа, и как классические шапероны, взаимодействующие с белками (Baksh et al., 1995; Corbett et al., 1999; Dedhar, 1994). Было показано, что в клетках млекопитающих кальнексин может образовывать комплексы с глико протеидам и, но не с неглюкозилированными протеидами, и частичное отщепление глюкозных остатков необходимо для связывания (Hammond et al., 1994; Ou et ah, 1993), Однако другие исследования выявили, что стабильные и долго живущие комплексы образовывались также между кальнексином и є- субъединицей Т-клеточного рецептора, не обладающего аспарагин-связанной гликозидной цепью (Loo and Clarke, 1994; Rajagopalan et al, 1994).
Было обнаружено, что взаимодействие кальпексина/кальретикулина с гликопротеидом способствует укладке белка (Zhang et al., 1997; Hebert et al., 1996). A связывание с моноглюкозилированными гликозидами предотвращает агрегацию неправильно свернутых белков. Предполагается, что связывание кальретикулина с гликозидом может быть сигналом для вовлечения других шаперонов, необходимых для правильного сворачивания белка (Zapun et ah, 1998; Oliver et ah, 1999). Однако взаимодействие с кальнексином/кальретикулином не является жизненно необходимым для эукариотических клеток (Ray et al., 1991; Reitman et al., 1982).
Hclentus и коллеги предложили модель контроля качества свертывания белков в клетках млекопитающих (Zhang et al., 1997). В соответствии с этой моделью (рисунок 6), после удаления двух глюкозных отстатков с N- гликозида (Glc3Man9GlcNAc2— GlcMan9GlcNAc2) глюкозидазой I (GI) и глюкозидазой II (GII), полученный моноглюкозилированный гликозид узнается кальнексином или кальретикулином.
После отщепления третьей глюкозы глюкозидазой GII гликопротеид (MangGlcNAc2 -полипептид) отсоединяется от кальпексина/кальретикулина и продолжает свой путь в аппарат Гольджи, Однако если он неправильно свернут, гликопротеид остается субстратом для глюкозилтрансферазы (GT). он реглюкозилируется и опять связывается с кальнексином/кальретик} лином. Таким образом, предложенная модель включает три основных компонента: 1) GT сенсора третичной структуры гликопротеидов (Hammond and Helenius, 1994; Sousa and Parodi, 1995). добавляющего глюкозу к N-гликозиду неправильно свернутого гликопротеида: 2) катьнексин/катьретикулин. которые удерживают моноглюкозилированные гликопротеиды в ЭР и 3) GII- «освобождающий» агент, позволяющий диссоциировать комплексу гликопротеид - кальнексин/кальретикулин.
Хотя все выше перечисленные три компонента присутствуют в дрожжах Sch. pombe. у дрожжей S. cerevisiae нет GT, но моноглюкозилированные олигосахариды могут быть образованы частичным отщеплением глкжозных остатков. Как упоминаюсь выше, у Sch. pombe. так и у S. cerevisiae есть катьнексин подобные молекулы, но нет гомолога для растворимой формы - каїьретикулина (Parlali el а!.. 1995а: Parlati el a!.. 1995b: Jannatipour andRokeach, 1995).
Контроль качества укладки белков в ЭР
Белки культуральных сред или клеточных лизатов разделяли в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Для анализа белков с молекулярным весом более 50 кДА использовали 8-10% ПААГ, для белков с молекулярным весом менее 50 кДА - 10-12% ПААГ. Для анализа методом иммупоблоттинга после проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Towbin et al., 1979). Обработку антителами и визуализацию комплексов осуществляли с помощью набора ECL (Amersham, UK) в соответствии с прилагаемым протоколом. В работе были использованы моноклональные антитела против uPA uig-1, любезно предоставленные Домагатским СП., а также поликлональные антитела против CPY (см. пункт 5 раздела «Материалы и методы»),
Для анализа секретировавшегося uPA белки культуральных сред концентрировали в 20 раз осаждением с помощью 10% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) в присутствии 0.017% дезоксихолата натрия. Осадок промывали ацетоном три раза. Сушили 10 минут при 37СС. Растворяли в 1х буфере для образцов SB1 (60mM Tris НС1 рН 7.8, 5% глицерин, 2% SDS, 1% Р-меркаптоэтанол, 0,001% бромфенол синий). Образцы перед нанесением на ПААГ кипятили в течение 4-7 мин.
Клетки из 0,5 мл культуральной среды после индукции осаждали центрифугированием в микроцентрифуге «Эппендорф» (4000 об/миц (300g), 2мин), после чего промывали дистиллированной водой и разрушали в буфере TBS (ЗОмМ Tris-HCl, рН 7,5; 150мМ NaCl), содержащем 1-2 мМ дитиотрейтола, 2мМ EDTA и ингибиторы протеаз - 2 мМ PMSF, «Complete» (смесь ингибиторов протеаз Boehringer Mannheim), при помощи встряхивания со стеклянными бусами на шейкере «Vortex» на максимальной скорости 4 раза по 1 мин, охлаждая после каждого встряхивания 30 секунд во льду. После этого добавляли еще примерно 200 мкл буфера TBS с ингибиторами (см. выше), перемешивали и переносили полученную суспензию в новые 1,5 мл пробирки. Для получения различных субклеточных фракций образцы центрифугировали (+4С, ротор JS-4,2, центрифуга Beckman J-6B, США) при 1000 об/мин (300g) 10 мин, полученный супернатант центрифугировали в микроцентрифуге «Эппендорф» (10000g, 10 мин, +4С). К полученному суперпатанту (С 10000) добавляли 4х кратный буфер для образцов SB4 (240мМ Tris-HCl рН7.8, 20% глицерин, 8% SDS, 4% р-меркаптоэтанол, 0,004% бромфенол синий), осадок (О10000) суспендировали в 1х буфере для образцов SB1 (бОмМ Tris НС1 рН7.8, 5% глицерин, 2% SDS, 1% р-меркаптоэтанол, 0,001% бромфенол синий). Для приготовления тотальных препаратов внутриклеточных белков по методу В.В. Кушнирова (Kushnirov, 2000) клетки дрожжей суспендировали в 100 мкл дистиллированной воды, добавляли 100 мкл 0.2М NaOH, перемешивали на максимальной скорости с использованием «Vortex» и инкубировали в течение 3-5 минут при комнатной температуре. После этого клетки осаждали в микроцентрифуге «Эппендорф» 14000 об/мин, 15 секунд), щелочь аккуратно удаляли с помощью водоструйного насоса. Клетки суспендировали в 100 мкл 1х буфера для образцов SB1 и немедленно кипятили 3 минуты. Затем клетки осаждали центрифугированием (14000 об/мин, 10 секунд).
Образцы перед нанесением на ПААГ кипятили в течение 4-7 мин.
Приготовленные образцы перед нанесением на ПААГ нормировали на концентрацию общего белка в клетках при помощи микробиуретового метода, как было описано выше (см. п.4.3, раздела «Материалы и методы»). В дорожки ПААГ наносили равные объемы образцов и их разведений. Разведения готовили при помощи їх буфера для нанесения SB1. В качестве стандарта наносили на ПААГ серию разведений препарата иРА, экспрессированного в E.coli (от 400 до 50 нг в дорожку). Затем методом иммуноблоттинга выявляли иРА в образцах. Интенсивность сигнала, визуализируемого на рентгеновской пленке и соответствующего форме иРА м.в. 50кДА, оценивали после сканирования (сканер EPSON Perfection 2400 PHOTO) при помощи программы Scionlmage. На основании полученных оценок строили калибровочные кривые для определения количества иРА в образцах. Если в анализируемом штамме экспрессировался гликозилированный иРА, то приготовленный образец перед нанесением на ПААГ обрабатывали в течение 1 часа при 37С эндогликозидазой Н (EndoH, Sigma) в концентрации 0.07ед/мкл (для удаления N-гликозидных цепей).
Фрагмент CPY Н. polymorpha, соответствующий зрелой форме белка, содержащий 6His, был экспрессирован в Е. соїі. Для этого был сконструирован экспрессионный вектор pCNR2, которым трансформировали бактериальный штамм NM522. Трансформанты вырастили в индукционной среде PI (1,35% пептон; 0,25% дрожжевой экстракт; 0,5% NaCl) в течение ночи. Ночную культуру разбавили в 50 раз средой 2YT, содержащей 0,2 мкМ IPTG (изопропилтио-Р-Э-галактозид), инкубировали 4 часа в условиях хорошей аэрации. Клетки собрали центрифугированием. Полученный осадок суспендировали в растворе лизоцима (0,4 мг/мл) объемом 1/30V (где V - объем исходной культуры). К полученной суспензии, содержащей тельца включения, добавили Triton Х-100 до 1%, Tris НС1 рН9-9,2 до 50 мМ, EDTA до ЮмМ, NaCl до 0,5М. После фрагментации ДНК шприцем, суспензию отцентрифугировали, осадок несколько раз промыли Triton Х-100 и растворили в буфере, содержащем мочевину (8М мочевина, 0,1М NaCl, 0.02М Tris НС1 рН8.0). Белок очистили с помощью сорбента TALON (ClonTech) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя сорбента. Очищенный белок использовали для иммунизации мышей. Иммунизация и изоляция проводилась А. В. Семеновым.
Методом иммуноблоттинга было показано, что полученная сыворотка содержит антитела, которые специфично связываются с CPY Н. polymorpha (рисунок 11). Эти антитела также были способны связаться с CPY S. cerevisiae (данные не приведены).
Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD)
Одной из стратегий для изучения устройства секреторного аппарата, является анализ мутаций, влияющих на секрецию. Низкая эффективность секреции uPA клетками дрожжей позволяет отобрать мутантные штаммы, с увеличенной способностью к секреции этого белка. В лаборатории молекулярной генетики ранее была получена коллекция мутантов Н. polymorpha, с увеличенной способностью к секреции uPA. В ряде случаев были идентифицированы гены, в которых произошли мутации.
В данной работе мы анализировали проявления мутаций retl-27, ори24, pmtl и pmrlA Н. polymorpha с точки зрения их влияния на секрецию uPA. Мутация pmtl снижает степень О-гликозилирования секретируемых белков, поскольку нарушает один из белков семейства протеин-О-мапнозилтрансфераз, осуществляющих перенос первого маннозного остатка О-гликозидных цепей на сериновые и треониновые аминокислотные остатки белков, синтезирующихся в ЭР. Ген OPU24 кодирует пирофосфорилазу ГДФ-маннозы -фермент, обеспечивающий синтез соединения, которое используется в качестве донора остатков маннозы для синтеза гликозидных цепей белков. С этим связано то, что мутация ори24 приводит к нарушению гликозилирования белков. Ген PMR1 кодирует мембранную Са + АТФазу, которая обеспечивает транспорт Са + против градиента концентрации из цитозоля в средние цистерны аппарата Гольджи. Инактивация этого гена приводит к сильному снижению концентрации ионов кальция в компартментах секреторного пути. Мутация retl-27 нарушает С-концевой домен а-субъединицы белкового комплекса COPI, который обеспечивает везикулярный транспорт между компартментами секреторного пути, COPI-зависимый транспорт, в частности, обеспечивает возвращение в ЭР резидентных и неправильно уложенных белков из промежуточного компартмеита.
Описанные в предыдущих разделах данные позволяли утверждать, что важную роль в секреции uPA играет эффективность его сворачивания в ЭР. Низкая эффективность укладки молекул белка может приводить к его накоплению в ЭР, что мешает укладке вновь синтезируемых молекул. С этой точки зрения существенным является своевременная элиминация неправильно свернутых молекул, которая осуществляется системой ERAD. С другой стороны, известно, что некоторые аберрантные белки, проходя секреторный путь, могут направляться с помощью рецептора VpslOp из поздних компартментов аппарата Гольджи в вакуоль для деградации (Hong et al., 1996; Holkeri and Makarow, 1998). Основываясь на этом, мы сконцентрировались на анализе проявлений «сверхсекреторных» мутаций, связанных с их влиянием на эффективность сворачивания uPA в ЭР, на процесс деградации неправильно свернутых белков в ЭР и на VpslOp-зависимый транспорт белков в вакуоль. Чтобы исследовать роль вакуолярной деградации в секреции uPA мы также исследовали проявления мутаций в генах VPS10 и PEP4. Ген VPS10 кодирует рецептор, транспортирующий белки из аппарата Гольджи в вакуоль, а ген РЕР4 - вакуолярную протеиназу А, активирующую другие вакуолярные протеазы.
Нарушение гена PMR1 в дрожжах S. cerevisiae приводит одновременно к увеличенной эффективности секреции uPA и к нарушению вакуолярного Vps Юр-зависимого транспорта белков в вакуоль (Rudolph et al., 1989; Melnick et al., 1990; Durr et al., 1998). Нарушение этого гена в дрожжах Н. polymorpha также приводит к нарушению вакуолярного Vps Юр-зависимого транспорта (Плотникова Т.А., не опубликовано). Одним из белков, направляемых с помощью рецептора Vps Юр из поздних компартменов аппарата Гольджи в вакуоль, является карбоксипептидаза Y (CPY). При нарушении VpslOp-зависимой сортировки в вакуоль, этот белок секретируется в культуральную среду. Поэтому мы решили проверить, не приводят ли «сверхсекреторные» мутации в генах Н. polymorpha РМТ1, OPU24 и RET1 к секреции CPY в культуральную среду. Для этого клетки анализируемых штаммов выращивали в жидкой среде, после этого белки из культуральной среды концентрировали осаждением при помощи ТХУ и анализировали методом иммуноблоттинга с антителами против CPY. Оказалось, что заметное увеличение количества CPY в культуральной среде по сравнению со штаммом дикого типа было только у мутантаpmll (рисунок 21).
Для того чтобы проверить, сопровождается ли нарушение сортировки в вакуоль в клетках дрожжей увеличением секреции uPA, была получена делеция гена VPS10 в штамме с экспрессиошюй кассетой uPA-Q. Это нарушение действительно привело к секреции вакуолярного белка CPY в культуральную среду (данные не приведены).
Оказалось также, что при росте на среде, содержащей фибрин, мутант AvpslO образовывал зоны лизиса значителыю большие по сравнению со штаммом дикого типа (рисунок 22). Это могло говорить об увеличении эффективности секреции uPA клетками мутанта, однако при анализе активности uPA в культуральной среде фибринолитический тест показывал одинаковую активность uPA, секретирусмого мутантом и диким типом (данные не приведены).
Методом иммуиоблоттинга также было показано, что мутант секретирует uPA-Q не лучше;, чем штамм дикого типа (рисунок 23А). При этом uPA-Q детектировался исключительно в виде формы, мигрирующей на уровне 30 кДа, которая образуется в результате протеолитического процессинга полноразмерного белка.
Чтобы понять природу несоответствия оценки эффективности секреции при выращивания клеток на твердой среде, содержащей фибрин, и количественного определения uPA в жидкой среде, мы исследовали влияние условий индукции экспрессии на активность и протеолитический процессинг этого белка. В эксперименте, описанном в п.2. раздела «Результаты», по индукции экспрессии uPA в жидкой среде выращивание проводили в 50 мл пластиковых пробирках. При этом инокулят (ночная культура в среде YPD 0.1М NaCl) разводили индукционной средой в 6 раз. Оказалось, что если выращивание проводить в стеклянных пробирках, то в случае штамма дикого типа большая часть uPA секретируется в форме с молекулярной массой 50 кДа, соответствующей полноразмерному белку. Уменьшение количества инокулята с 1/6 до 2/15 от конечного объема дополнительно снижало протеолиз. Однако в условиях, когда у штамма дикого типа протеолитический процессинг uPA практически отсутствовал, штамм с делецией гена VPS10 все также секретировал только процессированный белок (рисунок 23Б). При этом концентрация uPA в культуральной среде4 оцененная методом иммуиоблоттинга, была приблизительно 0.09 мкг/мл для штамма дикого типа и 0.06 мкг/мл для мутанта.
