Содержание к диссертации
Введение
СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ II
1. МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ 12
2. СТРОЕНИЕ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ 14
2.1. Глюкан 16
2.2. Маннан 18
2.3. Хитин 22
2.4. Белок 23
3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ЛИЗИС КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ 26
3.1. Глюканазы 26
3.2. Маннаназы 35
3.3. Протеиназы 37
3.4. Хитиназы 41
3.5. Липазы 42
4. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ 47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 58
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 59
I. КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И УСЛОВИЯ ИХ
ВЫРАЩИВАНИЯ 59
2. ПОЛУЧЕНИЕ МЕТОЧНЫХ СТЕНОК ДРОЖЖЕЙ 61
3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 64
3.1. Хроматография КулЬТуралЬНОЙ ЖИДКОСТИ Bac.brevis штамм 5/4 на аффинных сорбентах бацитрацин аминосилохром и фенилборонат-сефароза 64
3.2. Хроматографа серИНОВОЙ ПротеИНаЗЫ Bac.brevis штамм 5/4 на сефадексе &-75 66
4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ АКТИВНОСТЕЙ . 67
4.1. Протеолитическая активность 67
4.2. Дрожжелитическая активность 69
4.3. Гликозидазные активности 70
5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 71
5.1. Определение белка 71
5.2. Определение редуцирующих Сахаров 72
5.3. Определение общего количества белка в клеточных стенках дрожжей 72
5.4. Определение общего количества углеводов в клеточных стенках дрожжей 73
6. И3ОЭЛЕКТРОФ0КУСИРООВАНИЕ 73
7. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 74
7.1. Электрофорез в полиакриламидном геле без додецилсульфата Na 74
7.2. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na 76
8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ПРОТЕИНАЗЫ
ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖЬЩКОСТИ Bac.brevis ШТАММ 5/4 . 77
8.1. Кислотный гидролиз белка 77
8.2. Определение полуцистина и метионина 77
8.3. Определение триптофана 78
8.4. Аминокислотный анализ белка 78
9. ОПРЩЕЯЕНИЕ N - КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВДКОСТИ ВАС .BRE7IS ШТАММ 5/4 78
9.1. Предварительная денатурация белка фенолом 78
9.2. Автоматический анализ аминокислотной последовательности белка 79
10. ЗОНАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ КЛЕТОК ДРОЖЕЙ С .UTILIS в ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ 79
11. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ С .UTILIS 80
12. ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ С .UTILIS ПРИМУЛИНОМ 82
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ... 83
1. ВЫБОР МИКРООРГАНИЗМА - АКТИВНОГО ПРОДУЦЕНТА ДРОКЖЕЛИТМЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 83
2. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ДРОЖЖЕЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ВАС .BRE7IS ШТАММ 5/4 89
3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СЕРИНОВОЙ ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ВАС .BREVIS ШТАММ 5/4 95
Краткий обзор литературы 95
Полученные результаты 99
3.1. Выделение протеиназы 99
3.2. Определение аминокислотного состава секре-тируемой протеиназы Bac.brevis штамм 5/4
3.3. Определение N -концевой последовательности секретируемой протеиназы Bac.brevis штамм 5/4 105
3.4. Определение молекулярного веса секретируемой протеиназы Bac.brevis штамм 5/4 109
3.5. Определение субстратной специфичности секретируемой цротеиназы Bac.brevis штамм 5/4 112
3.6. Ингибиторный анализ 114
3.7. Влияние температуры среды инкубации на дрожжелитическую и протеолитическую активности протеиназы 116
3.8. Влияние рН среды инкубации на дрожжелити-ческую и протеолитическую активности протеиназы 116
4. ЛИТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОТЕИНАЗЫ ВАС .BREVIS НА ЖИВЫЕ МЕТКИ ДРОЖЖЕЙ С .UTILIS 121
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 136
ВЫВОДЫ 144
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 145
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 146
- МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ
- Глюкан
- Глюканазы
- СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ
- Протеолитическая активность
Введение к работе
Проблема лизиса клеточных стенок дрожжей ферментами микробного происхождения широко освещается в отечественной и зарубежной литературе /20,41',164,191/. Связано это в первую очередь с тем, что ферментативный гидролиз является наиболее эффективным и экономичным способом разрушения ригидной и устойчивой ко всякого рода воздействиям клеточной стенки дрожжей. Подобная устойчивость является существенным препятствием на пути использования дрожжей в качестве питательных кормовых добавок, при производстве биологически-активных веществ, содержащихся в протоплазме, при проведении биохимических и генно-инженерных исследований и т.д. К настоящему моменту можно выделить два взаимосвязанных аспекта этой проблемы и, соответственно, два направлениягпо которым развиваются исследования в этой области.
Первое (так сказать "практическое" направление) - поиск наиболее активных продуцентов дрожжелитических ферментов и использование этих ферментов с целью достижения наиболее полного лизиса клеточной стенки дрожжей и получения конечных продуктов (кормовые белково-витаминные лизаты, протопласты и т.д. в зависимости от области применения). Работы, проводимые в этом направлении не связаны с необходимостью иметь вы-сокоочищенные индивидуальные гидролазы, лизирующие клеточную стенку дрожжей по известному механизму.
Второе направление заключается в использовании литичес-ких ферментов для изучения структуры и функций всей клеточной стенки дрожжей и отдельных ее компонентов. Это направление
7 неразрывно связано с первым и своим появлением обязано тому интересу, который проявляют исследователи к строению клеточной стенки дрожжей.
Клеточная стенка дрожжей играет важнейшую роль в функционировании клетки в целом. Основными структурными компонентами клеточной стенки дрожжей являются полисахариды - глгокан, ман-нан, хитин, находящиеся в тесной ассоциации с белком. Ригидная и прочная клеточная стенка составляет наружный скелет клетки, ответственный за поддержание ее формы. Помимо осуществления начальных стадий утилизации питательных веществ, клеточная стенка, как пограничная зона клетки, активно участвует в таких процессах, как транспорт различных соединений из внешней среды в цитоплазму и обратно, иммунологические реакции клеточной поверхности, клеточно-клеточные взаимодействия, осуществление контроля метаболических процессов факторами внешней среды и т.д. Все это делает клеточную стенку дрожжей интереснейшим объектом для исследователей, работающих в области физиологии и биохимии микроорганизмов. В этой связи высокоспецифические литические ферменты, с охарактеризованным механизмом действия (глюканазы, маннаназы, протеиназы, хитиназы) являются весьма удобным инструментом, с помощью которого можно изучать роль отдельных структурных элементов клеточной стенки во всех перечисленных процессах, а также их взаимосвязь и взаиморасположение - т.е. структуру самой клеточной стенки.
Таким образом обнаружение новых активных продуцентов дрожжелитических ферментов, а также выделение и характеристика механизма действия этих ферментов на клеточную стенку дрожжей находится в прямой связи с изучением строения самой клеточной
8 стенки и отдельных ее компонентов.
В настоящее время в указанных направлениях достигнуты определенные успехи. Существуют препараты ферментов, способных в той или иной степени деградировать клеточную стенку дрожжей /19,41,133,191/. Накоплен большой фактический материал о структуре отдельных элементов клеточной стенки дрожжей /151, 164,175,176/, существует ряд гипотез, касающихся строения этой органеллы /41,122,141,183/. Однако многое в этих вопросах еще нуждается в дальнейшем выяснении.
Так, например, до сих пор ощущается недостаток препаратов литических ферментов, позволяющих эффективно и в большом количестве лизировать дрожжи с целью получения кормовой биомассы. В лабораторной практике для получения протопластов и клеточных органелл в большинстве случаев до сих пор используется кишечно-желудочный сок виноградной улитки Helix pomatia В этой связи работы, направленные на обнаружение новых активных продуцентов дрожжелитических ферментов приобретают особую актуальность.
Аналогичная ситуация сложилась и в области исследований, посвященных изучению строения и функций клеточной стенки дрожжей. Знания, которыми мы располагаем в этой области весьма неполны и, зачастую, противоречивы. Сказанное в первую очередь относится к белковому компоненту этой структуры о котором в настоящее время неизвестно практически ничего. Одним из путей получения информации по этому вопросу, как мы уже указывали, является выяснение механизма действия протеиназ на клеточную стенку дрожжей.
В связи с изложенным, целью настоящей работы явилось выде-
9 ление и характеристика нового, высокоочищенного фермента, способного лизировать клеточные стенки дрожжей рода Candida (важных продуцентов кормового белка), а также изучение его ли-тического действия на живые клетки этих дрожжей. Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: выбрать активный продуцент дрожжелитического фермента, выделить этот фермент в гомогенном состоянии, охарактеризовать его свойства, а также изучить зависимость устойчивости клеток дрожжей Candida utiiis к действию выделенного фермента от стадии роста культуры и фазы почкования дрожжей.
В соответствии с поставленными задачами нами была выбрана бактерия Bacillus brevis штамм 5/4, культуральная жидкость которой обладала способностью активно лизировать клеточные стенки дрожжей (продуцент был выделен на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ). Показано, что литичес-кое действие культуральной жидкости обусловливается присутствием в ней сериновой протеиназы типа субтилизина. Методами аффинной хроматографии фермент был выделен и охарактеризован как новая сериновая протеиназа, относящаяся к группе субти-лизинов (Ш 3.4.21).
На следующем этапе работы было проведено изучение некоторых закономерностей процесса лизиса клеток дрожжей с.utiiis выделенной сериновой протеиназой. В частности показано, что в процессе роста культуры дрожжей происходит потеря клетками чувствительности к логическому действию протеиназы. Продемонстрировано, также, что наблюдаемые изменения в лизируемости клеток с.utiiis связаны не с фазой клеточного цикла (фазой почкования) дрожжей, а со стадией роста культуры. Анализ
10 количественных изменений в составе клеточной стенки дрожжей c.utiiis на разных стадиях роста культуры показал, что потеря клетками чувствительности к литическому действию изучаемой протеиназы сопровождается увеличением общей массы клеточной стенки и повышением содержания в ней углеводного компонента. По всей видимости отмеченные факты могут свидетельствовать от том, что биогенез клеточной стенки не зависит от фазы клеточного цикла дрожжей, а осуществляется под контролем факторов внешней среды.
На основании полученных результатов, а также сведений, опубликованных в литературе, предложена схема возможных изменений, происходящих в клеточной стенке дрожжей в процессе роста культуры.
Морфология клеточной стенки дрожей
Электронномикроскопическое изучение клеточной стенки дрожжей дало исследователям основные представления о ее морфологии. Согласно современным взглядам клеточная стенка дрожжей состоит из микрокристаллического структурного компонента, представленного в основном фибриллами в-глюкана и аморфного матрикса манно-протеиновой природы /42/; толщина ее колеблется в пределах 1000-2500 А0 /38,165/.
Клеточная стенка дрожжей имеет слоистое строение. В большинстве случаев число слоев равно трем, однако, в зависимости от стадии роста, условий выращивания и способа фиксации, вида и даже штамма дрожжей оно может колебаться в широких пределах /6,216/.
Подобная морфологическая гетерогенность клеточной стенки дрожжей, наблюдаемая при электронномикроскопических исследованиях, в первую очередь, обусловлена ее химической неоднородностью. На электронных микрофотографиях клеточной стенки дрожжей отчетливо видно наличие двух электронноплотных слоев, наружный из которых представлен маннопротеинами, а также менее плотного промежуточного слоя, который содержит глгокан. Внутренний слой, возможно, включает в себя белки-ферменты, его иногда отождествляют с периплазмой /64,190,231/. Непосредственно к этому слою примыкает плазмалемма.
Иногда на поверхности клеток обнаруживается еще один слой рыхлого, неструктурированного материала - полисахаридная капсула /223/.
Интересными структурами,, наблюдающимися в месте образо ІЗ вания дочерних клеток являются так называемые почечные рубцы. Они отличаются от остальной поверхности клеточной стенки главным образом высоким содержанием хитина. Этот полимер участвует в построении первичной перегородки (септы) между материнской и дочерней клетками /65,66/.
Таким образом основными компонентами клеточной стенки дрожжей являются глюкан и маннан, находящиеся в тесной ассоциации с белком (структурный маннопротеин). Судя по результатам электронномикроскопических исследований эти компоненты, располагаясь слоями, образуют плотную, ригидную оболочку дрожжевой клетки - ее наружный скелет. В состав клеточной стенки дрожжей входит, также, хитин.
Глюкан
Общепринятым в настоящее время является мнение о том, что в процессе ферментативного лизиса клеточной стенки дрожжей первостепенную роль играют ферменты, гидролизующие глюкан -В -1,3- и в-1,6-глюканазы /189,191/. Одними из первых сообщили об этом Танака и Фафф, которые исследовали литическое действие -1,3- и в-1,6-глюканаз Bac.circuians .
За последующие годы число работ, подтверждающих это мнение сильно возросло. Достоверно показано, что глюканазы, будучи очищенными до гомогенного состояния в некоторых случаях способны интенсивно лизировать клеточные стенки и клетки дрожжей различной таксономической принадлежности /79,115,132,135, 233,234,235/. При этом в среде инкубации могут накапливаться редуцирующие сахара, а также низкополимерные продукты гидролиза глгокана. Отмеченный факт безусловно свидетельствует о том, что именно глюкан является основным формоопределягощим компонентом клеточной стенки дрожжей. Однако механизм, по которому протекает лизис дрожжей глюканазами весьма далек от окончательного выяснения.
Глюканазы
После действия ферментов этого типа на разветвленный дрожжевой глюкан остаются длинные цепи -1,3-связэнных остатков глюкозы /186/. О существовании таких ферментов в литическом комплексе Bac.clrcuians предположили Ромбоутс и Фафф /198,199/. Ферменты с подобным механизмом действия были выделены, также, из культуральной жидкости Giberella /210/ и Rhizopus /233/ . Ферменты из этой группы неспособны гидролизовать линейные полисахариды глюкозы ламинарии и пахи-ман, но интенсивно воздействуют на дрожжевой глюкан, разрывая в -1,3-связи вокруг J3-1,6-связанных остатков глюкозы в точке ветвления этой молекулы экзоглюканазы, гидролизующие глюкан последовательным отщеплением глюкозних остатков.
Экзоферменты этого типа хорошо известны как внутриклеточные ферменты дрожжей /46,191/. Они обнаружены и у других микроорганизмов. Так, например, при действии такой глюканазы, выделенной из культуральной жидкости базидиомицета Я, 806 ряд дрожжей образовывали протопласты /58/. Фермент выделен в чистом виде /108/ и гидролитический механизм его изучен /178/. Это -1,3-глюканаза, последовательно расщепляющая глюкан со стороны его нередуциругащего конца с образованием глюкозы.
Структура и функции клеточной стенки дрожей
Несмотря на то, что изучение строения отдельных компонентов клеточной стенки дрожжей является предметом изучения в большом количестве работ как отечественных, так и зарубежных авторов, архитектоника этой структуры до настоящего времени остается не совсем ясной.
Предложенные в литературе схемы строения клеточной стенки носят формальный характер и демонстрируют возможную компоновку маннопротеинового и глюканового слоев без учета разнообразных функций, выполняемых этой органеллой.
На рисунках 6а и 66 представлены схемы строения по Лам-пену, а также по Кидби и Дэвису . Их отличиями является расположение ферментов и характер связей молекул маннана в наружном маннопротеиновом слое клеточной стенки. Б одном случае предполагается, что фермент (инвертаза) фиксирован химическими связями, а в другом случае находится в свободном состоянии и выход его в среду физически ограничен внешним слоем оболочки. Расхождение объясняется тем, что Лампен предлагал свой вариант модели (рис. 6а) основываясь на данных по воздействию на клеточную стенку дрожжей фермента - фосфоманнаназы. Авторы второй модели (рис. 66) пришли к выводу, что фермент не фиксирован химически,в результате экспериментов по высвобождению инвертазы из интактных клеточных стенок дрожжей после обработки тиоловыми реагентами. Эти же эксперименты позволили Кидби и Дэвису предположить, что молекулы маннана наружного слоя связаны между собой не только фосфодиэфирными связями, но и дисульфидными мости .
Протеолитическая активность
Протеолитическую активность определяли используя в качестве субстратов казеин, альбумин, а также хромогенные субстраты сериновых протеиназ субтшшзинового типа - п-нитроанили-дов бензилоксикарбонил-аланил-аланил-лейцина ( Z-Aia-Aia-Leu-NHC6H NO2 ), бензилоксикарбонил-аланил-глицил-лейцина ( z-Aia-Giy-Leu-NHC6H No2 ) и бензилоксикарбонил-глицил Казеинолитическую активность определяли фотометрическим методом /14/.
Среда инкубации содержала: 2 мл 1% раствора казеина (или бычьего сывороточного альбумина); I мл 0,05 М трис-HCI буфера рН 8,2, содержащего I мМ СаС12; I мл ферментного препарата. Общий объем пробы 4 мл.
Реакцию останавливали добавлением 4 мл Ъ% ТХУ после чего пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин на настольной центрифуге Janetzki и I мл супернатанта переносили в сухую пробирку. Затем добавляли 5 мл 0,5 М И"а2со3 и I мл реактива Фалина. Через 20 мин на спектрофотометре измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 670 нм.
