Введение к работе
Актуальность проблемы. Некоторые клеточные белки, растворимые в норме, могут полимеризоваться, образуя комплексы, имеющие упорядоченную фибриллярную структуру. Такие полимеры называются амилоидами. Они обычно устойчивы к протеолизу, и потому накапливаются внутри и вне клеток в виде крупных агрегатов или бляшек, что может приводить к развитию заболеваний, называемых амилоидозами. У человека известно более 30 белков, способных образовывать патологические амилоиды. Амилоидозы обычно возникают в пожилом возрасте, широко распространены, и на данный момент все неизлечимы. К амилоидозам относятся, в частности, болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона, Крейтцфельдта-Якоба и сахарный диабет II типа. Амилоиды, образованные белком РгР, в отличие от амилоидов, образуемых другими белками млекопитающих, являются инфекционными и называются прионами.
Белки с прионными свойствами были также обнаружены у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Среди них наиболее изучены белки Sup35 и Rnql. Полимеризация этих белков приводит к появлению прионных фенотипов [РБҐ] и соответственно (отсутствие прионных полимеров и фенотипа обозначается ] и ]). Эти фенотипы наследуются за счет передачи полимеров белков Sup35 и Rnql дочерним клеткам при делении. Также прионный фенотип можно передать клеткам, путем их трансформации полимерами Sup35 и Rnql. Таким образом, прионные полимеры белков могут выступать в роли генетического материала.
Большинство прионных белков дрожжей имеют богатые глутамином и аспарагином домены, отвечающие за их прионные свойства. Этим они похожи на белки с полиглутаминовыми трактами, которые образуют амилоиды, наблюдаемые при так называемых полиглутаминовых заболеваниях у человека и животных. Одна из наиболее известных болезней этого класса - болезнь Гентингтона, связанная с переходом в амилоидное состояние белка гентингтина. Этот белок имеет аминоконцевой полиглутаминовый участок, длина которого может варьировать. Если этот участок имеет длину более 34 остатков, то белок становится склонен к
амилоидной агрегации. У человека и других млекопитающих амилоиды гентингтина приводят к нарушению работы мозга и гибели нейронов. У дрожжей полимеризация гентингтина приводит к нарушению роста клеток, что позволяет использовать их в качестве модели для исследования молекулярных основ болезни Гентингтона.
В отличие от амилоидов гентингтина, прионные полимеры дрожжей не нарушают жизнеспособность клеток. Дрожжевые прионы возникают с низкой частотой, однако поддерживаются в культуре клеток за счет наследования в ходе клеточных делений. Для стабильного наследования прионные полимеры должны размножаться. У дрожжей это происходит в результате фрагментации полимеров, осуществляемой шапероном Hspl04 с помощью некоторых других шаперонов (семейства Hsp40 и Hsp70). В отсутствие фрагментации постоянное деление клеток должно приводить к потере приона, поскольку фиксированное число полимеров распределяется между возрастающим числом клеток. Кроме того, из-за непрерывного роста, прионные полимеры были бы слишком крупными и не могли бы попадать в дочерние клетки.
В последние годы появляется все больше указаний на то, что процесс межклеточной и межтканевой передачи амилоидных полимеров может играть важную роль в патогенезе амилоидозов человека и других млекопитающих. Фрагментация должна играть важную роль в этом процессе, поскольку она увеличивает количество амилоидных частиц и их подвижность, за счет уменьшения размера. Поэтому изучение фрагментации амилоидных полимеров имеет не только биологическое, но и медицинское значение.
Прионные полимеры одного и того же белка могут существовать в разных структурных вариантах, отличающихся друг от друга по своим фенотипическим проявлениям. Показано, что различные варианты прионных полимеров дрожжей различаются по эффективности фрагментации, однако какие именно факторы определяют данные различия до сих пор неясно. На примере двух вариантов [РБҐ] было показано, что большая прочность полимеров коррелирует с меньшей эффективностью фрагментации. На основании этих данных в литературе часто
предполагают, что эффективность фрагментации полимеров определяется их прочностью, несмотря на отсутствие строгих доказательств. В то же время известно, что частота фрагментации зависит от эффективности работы ряда шаперонов. В нашей лаборатории было высказано предположение, что частота фрагментации должна зависеть от эффективности распознавания амилоидов шаперонами. Мы предположили, что шапероны узнают амилоиды, как белки с неправильной укладкой. Индикатором такой укладки могли бы служить экспонированные остатки гидрофобных аминокислот, которые при правильной укладке должны находиться внутри белковых глобул. Таким образом, изучение влияния аминокислотного состава и прочности полимеров представляется важным для понимания механизма фрагментации амилоидов.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение причин токсичности амилоидов полиглутаминовых белков и выявление факторов, определяющих частоту фрагментации таких амилоидов в клетках дрожжей.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать роль жизненно-важных белков Sup35 и Sup45 в токсичности
мутантного гентингтина человека для клеток дрожжей;
2) Изучить влияние различных аминокислотных остатков в составе
полиглутаминовых доменов модельного белка на способность этих белков к
полимеризации и на степень фрагментации полимеров этих белков;
3) Исследовать корреляцию между эффективностью фрагментации амилоидных
полимеров и их прочностью.
Научная новизна. В работе было впервые показано, что инактивация жизненно-важных белков Sup35 и Sup45 играет ключевую роль в токсичности полимеров гентингтина для клеток дрожжей. Проведен систематический анализ влияния различных аминокислотных остатков в составе полиглутаминовых доменов на возникновение и фрагментацию амилоидных полимеров. Показано, что размер полимеров не всегда коррелирует с их термостабильностью в присутствии SDS.
Это указывает на то, что эффективность фрагментации амилоидных полимеров не определяется их прочностью.
Практическое значение работы. Работа выявила основной механизм токсичности гентингтина для клеток дрожжей, что может быть использовано для поиска сходного механизма в клетках млекопитающих и разработки подходов к терапии болезни Гентингтона. Показано, что, эффективная фрагментация амилоидов в клетках дрожжей зависит от наличия в амилоидогенных доменах остатков ароматических и некоторых других аминокислот. Предположительно, эти остатки способствуют связыванию фрагментирующих шаперонов с амилоидами. Генетические конструкции, кодирующие изученные в работе белки, могут быть использованы для изучения механизма фрагментации амилоидов в клетках млекопитающих.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на межлабораторном семинаре ФГУП ГосНИИГенетики (2012), ФГБУН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН (2012), и межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» МЗСР РФ, (2011); а также представлены на Санкт-Петербургском научном форуме "Наука и общество. Физиология и медицина XXI века", 19-23 сентября, 2011 (Санкт-Петербург); 24-ой международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей, 19-24 июля 2009 (Манчестер, Великобритания); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-27 июня 2009 (Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 3 сообщения в сборниках материалов конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Приложения», «Благодарности» и «Список Литературы». Работа изложена на 105 страницах, содержит 32 рисунка, 7 таблиц и список литературы, состоящий из 138 ссылок.
