Введение к работе
Актуальность темы исследования
При производстве и хранении вин, пива, осуществлении контроля
биотехнологических процессов возникает необходимость экспресс-анализа
содержания спиртов в спиртосодержащих жидкостях и ферментационных
средах. Традиционно этанол в пищевой и водочной продукции определяют
ареометрическим, пикнометрическим и рефрактометрическим методами. Эти
методы имеют ограничения в применении к спиртосодержащим жидкостям, в
состав которых входят другие вещества. Для определения микроколичеств
спирта применяют методы газо-жидкостной и газовой хроматографии с
капиллярными или насадочными колонками с использованием пламенно-
ионизационного детектора или катарометра. Однако, несмотря на низкие
пределы обнаружения спиртов, общими недостатками хроматографических
методов являются сложность применяемого оборудования, в некоторых
случаях - пробоподготовки, а также длительность анализа. Следует отметить,
что метод газовой хроматографии применяют для определения содержания
примесей в этиловом спирте. Для определения спиртов успешно
разрабатываются ферментативные методы, имеющие высокую
чувствительность (пределы обнаружения спиртов 1 х Ю"6 - 1 х Ю"4 М) и
селективность. При разработке экспрессных методов биоанализа
перспективным направлением является применение биосенсоров, которые
характеризуются доступностью, простотой аппаратурного и методического
оформления, удовлетворительными уровнями чувствительности и
избирательности, экспрессностью и экономичностью, а также возможностью миниатюризации подобных биоаналитических устройств.
В биосенсорах для экспресс-определения содержания спиртов наиболее часто используют фермент алкогольоксидазу (АО) (КФ 1.1.3.13). В последние годы разработке и применению биосенсоров на основе АО посвящено значительное число публикаций, что свидетельствует об актуальности данного направления биоаналитической химии. Среди всех сенсоров на основе иммобилизованной АО для определения этанола наибольшее развитие получили электрохимические биосенсоры, в которых определение проводится по изменению содержания кислорода в приэлектродном пространстве или по образованию пероксида водорода. Проводимые исследования направлены на разработку портативных и удобных для потребителя биоаналитических устройств, совершенствование аналитических параметров биосенсоров, которые часто определяются свойствами гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных алкогольоксидаз.
Основным источником алкогольоксидазы являются метилотрофные дрожжи. Метилотрофные дрожжи могут содержать до 30-40 % АО от общего содержания белков в клетке, поэтому наряду с использованием АО в качестве биорецепторных элементов биосенсоров можно использовать целые клетки микроорганизмов. Их применение имеет ряд преимуществ, к которым относятся технологически простая процедура изготовления этих элементов и
существенное сокращение стоимости анализа. В некоторых случаях важно определять суммарное содержание легко утилизируемых соединений. Так, одной из важных проблем является мониторинг сточных вод спиртовых производств, которые характеризуются высоким содержанием органических загрязнений, что приводит к гибели естественных экосистем вокруг таких предприятий. Поэтому для экспресс-анализа в некоторых случаях целесообразно использовать биосенсоры, биораспознающие элементы которых содержат целые клетки микроорганизмов. Следует отметить, что биосенсоры, предназначенные для экологического контроля стоков спиртовых заводов, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Создание биосенсорного анализатора со сменными биораспознающими элементами является актуальной задачей.
Таким образом, несмотря на интенсивно проводящиеся исследования по
разработке биосенсоров для спиртовых производств существуют научные и
научно-технические проблемы, которые необходимо решать, чтобы упростить
и удешевить процедуру определения спиртов без потери точности и
специфичности, а также обеспечить возможность их постоянного мониторинга.
Актуальными задачами при разработке биосенсоров для анализа низших
спиртов, в частности, этилового, являются увеличение времени
функционирования иммобилизованного биокатализатора в
распознающих/рецепторных элементах биосенсора, вопросы чувствительности и повышение стабильности работы биосенсора, которые в конечном счете определяются стабильностью биорецепторного элемента. Решение описанных проблем может осуществляться, с одной стороны, выбором наиболее эффективных биокатализаторов - штаммов микроорганизмов или выделенных из них белков - алкогольоксидаз, с другой стороны разработкой новых методик иммобилизации биоматериала, обеспечивающих длительное время функционирование биосенсора при сохранении высокой активности биокатализатора.
Цель работы:
Разработка биотехнологических и химико-аналитических основ создания электрохимических биосенсоров на основе целых клеток метилотрофных дрожжей и выделенной из них алкогольоксидазы для определения содержания низших спиртов.
В рамках указанной цели решались следующие задачи:
На основе содержания белка и удельной активности алкогольоксидазы в биомассе метилотрофных дрожжей различных штаммов провести выбор наиболее эффективного источника для получения целевого фермента.
Получить биочувствительные элементы для модификации электрода электрохимических биосенсоров на основе иммобилизованных дрожжевой алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей.
Провести сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз.
Сравнить эксплуатационные и аналитические характеристики биосенсоров для определения содержания этанола в кюветном и проточно-инжекционном форматах анализа
Апробировать разработанные макеты электрохимических биосенсоров на спиртосодержащих образцах в сравнении с референтными методами.
Научная новизна
Разработаны способы получения чувствительных биораспознающих элементов сенсоров для определения содержания спиртов путем иммобилизации фермента алкогольоксидазы на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной бензохиноном или бензохиноном с ДЭАЭ-декстраном. Взаимодействие фермента с поверхностью обусловлено, в первом случае, образованием ковалентных связей между функциональными группами на поверхности белка, и, во втором случае, электростатическим взаимодействием отрицательно заряженной белковой молекулы фермента с положительно заряженной поверхностью мембраны
Впервые установлено, что возможно взаимодействие между положительно заряженной мембраной, модифицированной ДЭАЭ-декстраном, и поверхностью клеток метилотрофных дрожжей. Время функционирования полученных на основе такого взаимодействия гетерогенных биокатализаторов составляет 14 суток.
Впервые выполнен сравнительный анализ метрологических и аналитических характеристик биосенсоров на основе выделенных в работе и коммерчески доступных алкогольоксидаз. Выделенная из Н. polymorpha NCYC 495 In алкогольоксидаза характеризуется наибольшей удельной активностью (50 Е/мг), а биосенсор на ее основе характеризуется лучшими аналитическими параметрами. Выявлено, что чувствительность биораспознающих элементов, полученных иммобилизацией фермента на положительно заряженной мембране, в первую очередь, зависит от активности используемой алкогольоксидазы.
Сравнительный анализ эксплуатационных и аналитических характеристик биосенсорного определения содержания этанола двумя способами с применением кюветного и проточно-инжекционного макетов биосенсора показал, что проточно-инжекционный формат анализа позволяет повысить селективность, расширить линейный диапазон определения и снизить время единичного анализа.
Практическая значимость
Отработанная методика лабораторного выделения дрожжевой алкогольоксидазы с использованием полуавтоматической хроматографической установки может использоваться как основа при производстве дрожжевой алкогольоксидазы Н. polymorpha NCYC 495 In.
Разработанная методика иммобилизации биокатализатора (фермента алкогольоксидазы и целых клеток метилотрофных дрожжей) на нитроцеллюлозной мембране, модифицированной ДЭАЭ-декстраном, позволяет получать стабильные биочувствительные поверхности, которые можно использовать для тиражирования стандартных биораспознающих элементов сенсоров.
Разработаны и апробированы макеты биосенсора кюветного и проточно-инжекционного типа для определения содержания низших спиртов - метанола и этанола в водных средах. Методика анализа с использованием разработанных макетов биосенсора характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, низкой стоимостью и позволяет проводить мониторинг содержания спирта в процессе брожения, его остатков в барде, и выполнять анализы не только в специализированных лабораториях, что особенно важно при очистке сточных вод ферментационных производств.
Работа вносит практический вклад в разработку быстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяет в перспективе производить недорогие и эффективные анализаторы. Макеты биосенсоров могут быть использованы в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототипы опытных образцов приборов для серийного выпуска на базе гальванопотенциостатов, внесенных в Государственный реестр средств измерений.
Апробация работы и публикации
Результаты работы докладывались на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) (медаль конкурса); Всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2010, 2011 и 2012 гг. (диплом победителя конкурса)); 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». (Пущино, 19-23 апреля 2010 года); Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 1-5 октября, 2012 г), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г.). Московская международная научно-практическая конференция «БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов» (Москва 15-17 марта 2010 г.) (диплом, медаль конкурса). По теме диссертации опубликовано 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 10 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнялась на кафедре Химии ЕНФ «ТулГУ», а так же в лаборатории биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) в рамках проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК № 16.740.11.0766, и ГК № 14.В37.21.0561). Автор работы является победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм
предприятий в научно-технической сфере в 2012 г. (г. Тула), госконтракт № 11419р/17125.
Благодарности. Автор благодарен коллективам кафедр химии и биотехнологии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и интерпретации полученных результатов. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям -к.х.н., проф. Алферову В.А., к.х.н., доц. Понаморевой О.Н. и д.х.н., проф. Решетилову А.Н.
Структура и объем работы
Работа состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 122 страницах, содержит 4J_ рисунок и 27 таблиц. Список литературы включает 134 источника.
