Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Пути обмена эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в организме, биологическое значение, физиологическая роль, токсикологическое действие 12
1.2 Методы определения этилового спирта и ацетальдегида в крови 27
ГЛАВА 2. Собственные исследования 30
2.1 Материалы и методы исследований 30
2.2 Разработка методики количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови 35
2.2.1 Принцип метода 36
2.2.2 Средства измерения, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы 37
2.2.3 Подготовка к выполнению измерений 38
2.2.4 Выполнение измерений 40
2.2.5 Обработка результатов измерений 43
2.3 Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров... 47
2.3.1 Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях 47
2.3.2 Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при стандартном рационе и при включении в рацион пивной дробины 51
2.4 Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров 54
2.4.1 Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях 54
2.4.2 Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при стандартном рационе и при включении в рацион пивной дробины 59
2.5 Взаимосвязь эндогенного этанола крови коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (АлАТ, АсАТ, ГГТ), углеводного (глюкоза) и липидного (триацилглицериды, ЩФ) обменов 64
ГЛАВА 3. Обсуждение результатов 84
Выводы 97
Предложения 98
Библиографический список 99
Приложение 115
- Пути обмена эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в организме, биологическое значение, физиологическая роль, токсикологическое действие
- Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях
- Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях
- Взаимосвязь эндогенного этанола крови коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (АлАТ, АсАТ, ГГТ), углеводного (глюкоза) и липидного (триацилглицериды, ЩФ) обменов
Введение к работе
Актуальность исследования. Количественное определение этилового спирта и ацетальдегида в крови и тканях животных сопровождается рядом технических трудностей. Например, при использовании ферментных методов результаты в значительной степени зависят от техники предварительной обработки проб (характер дистилляции, способ депротеинизации и др.) [Ю.М. Островский, и др., 1986; В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина, 2004]. В литературе описаны методы количественного определения этилового спирта с применением цветных реакций [М.Д. Швайкова, 1975; Ю.В. Родионов, и др., 2002]. Широкое применении в 60-е годы получили так называемый «нитритный» метод и способ Видмарка [V. Klixgmuller et al., 1968]. «Нитритный» метод очень трудоемок, требует быстрой обработки исследуемого материала двойной перегонкой с водяным паром, большого количества исследуемого материала (около 200-300 г). Кроме того метод недостаточно специфичен. Способ Видмарка применяется с целью определения степени опьянения живых лиц. Для проведения исследования требуется незначительное количество исследуемого материала (около 0,6 мл крови), что, несомненно, является преимуществом этого метода, хотя работа с такими навесками существенно влияет на погрешность проводимого исследования.
С появлением газохроматографического оборудования в конце 60-х годов был разработан метод определения этилового алкоголя в крови и моче [Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32]. Метод позволяет получать точные и воспроизводимые результаты, но, все-таки не обладает достаточной специфичностью, так как при обнаружении в исследуемом материале наряду с этиловым спиртом пропилового и изопропилового алкоголя количественно определить этиловый алкоголь не представляется возможным.
В связи с вышеизложенным становиться понятным, что имеется необходимость в разработке новых методик количественного определения содержания ацетальдегида и этилового спирта в крови, основанных на использовании современного газохроматографического оборудования.
Применение биохимических тестов, позволяющих выявлять отклонения в метаболизме на ранних стадиях, способствует сохранению здоровья крупного рогатого скота и повышению его продуктивности [Б.В. Уша, и др., 2003]. В настоящее время возникла необходимость в разработке новых тестов, позволяющих зафиксировать отклонения в содержании эндогенных этанола и ацетальдегида крови, метаболизм которых непосредственно связан с углеводным и липидным обменом. Уровень этанола и ацетальдегида в крови и тканях млекопитающих животных зависит от множества факторов, в частности от различных фаз репродуктивного цикла, системы кормления, внешних воздействий окружающей среды и т.п. Эндогенный и экзогенный уровень этих веществ в крови и тканях некоторых млекопитающих хорошо изучен [М.Д. Швайкова, 1975; Ю.М. Островский, и др., 1986; С.М. Зиматкин, 2007], в то время как у крупного рогатого скота подобные исследования не проводились и информация о содержании этилового спирта и ацетальдегида в крови этих животных отсутствует.
Обеспечение животных полноценными кормами является одной из первостепенных задач современного скотоводства. Для решения этой задачи в рацион сельскохозяйственных животных в настоящее время широко применяют включение отходов пивоваренных (пивная дробина) [В.А. Блинов, И.А. Сазонова, 2005; Г.А. Пелевина, Н.И. Чернышев, 2007] и спиртовых (спиртовая барда) производств [А.С. Ушаков, 2007; М. Маликова, М. Сабитов, 2007]. В литературе имеются сведения о положительных эффектах применения этих концентратов – увеличивается интенсивность белкового и липидного обмена, молочная продуктивность, выход молочного белка и жира [П.А. Науменко, и др., 2004; Л.В. Романенко, 2007; Н.В. Воробьева, и др., 2008; Е.Ю. Герасимов, 2008]. Большое значение имеет также и экономический эффект за счет снижения себестоимости молока и получения дополнительной прибыли [М.П. Кирилов, и др., 2004]. Однако влияние этих добавок на содержание этилового спирта и ацетальдегида в крови животных не изучалось, хотя известно, что при превышении физиологических концентраций эти метаболиты, и особенно ацетальдегид, способны оказывать токсическое действие на организм [С.М. Зиматкин, 1989; С.М. Зиматкин, и др., 1993; M.V. Singer, S. Teyssen, 2001; Е.В. Васильева, и др., 2004; G.D. Castro et al., 2006; Ю.М. Пархоменко, и др., 2007; S.S.R. Bhupanapadu et al., 2008]. Поэтому информация о содержании эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови крупного рогатого скота представляет большой интерес.
Цель исследования. Разработка методики количественного определения этилового спирта и уксусного альдегида в крови коров и изучение содержания этих метаболитов в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях для разработки нового биохимического теста.
Задачи исследования:
1. Разработать методику количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии.
2. Изучить содержание эндогенного этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях.
3. Изучить содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при стандартном рационе и при включении в рацион пивной дробины.
4. Провести корреляционный анализ содержания эндогенных этилового спирта и ацетальдегида крови коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (активность ферментов аланинаминотрансферазы (АлАТ К.Ф. 2.6.1.2), аспартатаминотрансферазы (АсАТ К.Ф. 2.6.1.1), гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ К.Ф. 2.3.2.4)), углеводного (глюкоза) и липидного (триацилглицериды, активность щелочной фосфатазы (ЩФ К.Ф. 3.1.3.1)) обменов.
Научная новизна. Разработана методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии, позволяющая получать достоверные и воспроизводимые результаты. Подана заявка №2009148528 приоритет от 25.12.2009 г. на изобретение «Способ определения содержания этилового спирта и уксусного альдегида в крови».
Впервые получены данные о концентрации эндогенных этанола и ацетальдегида в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях: самое высокое содержание этилового спирта отмечается на начальной стадии сухостойного периода, самое низкое его содержание – на 2-ой и 3-ий месяц лактации. Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях статистически не отличается. Содержание эндогенного этанола на порядок выше концентрации ацетальдегида.
Впервые установлено, что введение в рацион изучаемых животных пивной дробины (15 % по массе от общего количества корма в течение 6-ти месяцев) вызывает увеличение концентрации этанола крови. При этом содержание ацетальдегида крови не изменяется.
Впервые выявлена высокая положительная корреляция между содержанием этанола и активностью ГГТ крови изучаемых животных при различных физиологических состояниях.
Практическая значимость. Разработанная методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров может быть рекомендована для использования при проведении научных исследований по биохимии крови полигастричных животных.
Данные физиолого-биохимических исследований о содержании эндогенных этанола и ацетальдегида в крови коров могут быть использованы в качестве стандартных параметров при осуществлении контроля над метаболическим статусом животных при различных физиологических состояниях и при смене рационов.
Полученный новый фактический материал о содержании эндогенных этилового спирта и ацетальдегида у крупного рогатого скота может быть использован при написании соответствующих разделов и справочных руководств по биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных.
Внедрение результатов. Результаты исследования используются в учебном процессе ФГОУ ВПО ОмГАУ (изданы методические указания «Биохимия крови: Содержание эндогенного этилового спирта и ацетальдегида у крупного рогатого скота» для студентов в рамках ООП ВПО 110401 – «Зоотехния», 111201 – «Ветеринария», 110501 – «Ветеринарная санитарная экспертиза» (утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области протокол № 6 от 24.09.09 г.)) и в практической деятельности ветеринарных врачей (изданы методические рекомендации для ветеринарных врачей «Определение содержания ацетальдегида и этилового спирта в крови методом капиллярной газовой хроматографии» (утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области протокол № 7 от 22.10.09 г.)).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана методика количественного определения эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии, позволяющая получать воспроизводимые и достоверные результаты.
2. Содержание эндогенного ацетальдегида в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях не отличается. В то же время наблюдается снижение эндогенного этилового спирта в крови коров от периода сухостоя к периоду раздоя: наибольшее значение концентрации этанола отмечается на начальной стадии сухостойного периода, с развитием лактационной доминанты отмечается тенденция к снижению уровня этилового спирта крови.
3. Введение в рацион коров отходов пивоваренного производства (сухая пивная дробина 15 % по массе от общего количества корма в течение 6-ти месяцев) вызывает увеличение содержания эндогенного этилового спирта крови. Для эндогенного ацетальдегида подобных отличий не установлено.
Апробация работы. Материалы исследований представлены на международном форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2008), региональной научно-практической конференции «Естественнонаучная составляющая высшего аграрного образования Сибирского федерального округа: современное состояние и перспективы развития; опыт совершенствования и инновации» (Омск, 2007) и внутривузовских научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава ОмГАУ (Омск, 2006 – 2009).
Объем и структура диссертации.
Пути обмена эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в организме, биологическое значение, физиологическая роль, токсикологическое действие
В организме человека и животных постоянно присутствует эндогенный этанол в концентрациях, сопоставимых с такими хорошо изученными естественными метаболитами как оксалацетат, ацетил-коэнзим А, трифосфороглицериновый альдегид и т. д. и многих регуляторных факторов, каковыми являются гормоны, нейромедиаторы, циклический аденозинмонофосфат, циклический гуанозинмонофосфат и др. [Ю.М. Островский, 1982; Б.М. Кершенгольц, 1991]. Эндогенный этиловый спирт образуется из ацетальдегида алкогольдегидрогеназой. Синтез ацетальдегида осуществляется из пирувата, треонина, дезоксирибозо-5-фосфата, фосфоэтаноламина, р-аланина и других субстратов [Ю.М. Островский, и др., 1986; П.С. Пронько, и др., 2002]. Уровень эндогенного этанола в крови и тканях меняется при различных функциональных состояниях организма (голодание, старение, стресс, охлаждение и др.) [СМ. Зиматкин, и др., 1989; Н. Akihito et al., 2001; I. Sillaber et al., 2002; А.Я. Гриненко, и др., 2002] и регулируется с помощью многих соединений (ферменты, гормоны, витамины, аминокислоты и их производные, соли лития, дисульфирам и др.), которые действуют по различным механизмам [C.S. Lieber, 2000; W. Kostowski, 2002]. Равновесие в системе эндогенный этиловый спирт - ацетальдегид обеспечивается алкогольдегидрогеназой и ферментами, нарабатывающими или потребляющими ацетальдегид [Ю.М. Островский, М.Н. Садовник, 1984]. Это равновесие, по-видимому, контролирует обмен двууглеродных и синтез морфиноподобных соединений, регулирует активность некоторых нейротрансмиттеров, пептидов и белков. Возможно, оба соединения являются энергоресурсом каких-то клеток или их образований. Изменения активности ферментов (алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, микросомальной этанолокисляющей системы), ответственных за превращения этанола и ацетальдегида соответствуют адаптивным сдвигам, обеспечивающим соответствующий метаболический и функциональный гомеостаз.
Данных о концентрации эндогенного ацетальдегида весьма немного, но, скорее всего, она ниже, чем эндогенного этанола на несколько порядков [Ю.М. Островский, и др., 1986]. Эндогенный этиловый спирт можно рассматривать как относительный индикатор уровня эндогенного ацетальдегида [Ю.М. Островский, 1982]. Такая точка зрения встречает серьезные возражения, так как ацетальдегид эффективно окисляется митохондриальной альдегиддегидрогеназой и образуется одновременно в большом числе реакций [К. Gill et al., 1992]. В то же время в печени животных и человека в громадном количестве присутствует алкогольдегидрогеназа, фермент, катализирующий обратимую реакцию превращения этанола, причем, по мнению Ю.М. Островского, равновесие этой реакции смещено в сторону образования этанола из ацетальдегида, что и позволяет активно регулировать уровень последнего. Система этанол - ацетальдегид контрольный пункт для двууглеродных соединений и самого ацетальдегида, обладающего широким спектром биологической активности [Ю.М. Островский, 1982]. Этот подход к оценке взаимоотношений этанол/ацетальдегид объясняет лабильность уровня эндогенного этанола при различных воздействиях на организм и широкий размах границ самого показателя у интактных животных.
Авторы работы [B.R. Smith et al., 1997] показали, что локально (в ходе ферментативного окисления этанола) в клетках могут возникать достаточно высокие концентрации ацетальдегида, вполне сопоставимые с создаваемыми искусственно. Следовательно, сравнительно низкие цифры, характеризующие усредненное на всю ткань содержание эндогенного этилового спирта и эндогенного уксусного альдегида, должны восприниматься критически, так как в определенных микроструктурах или в непосредственной близости от соответствующего фермента концентрации обоих соединений могут быть намного значительнее [R.E. Person et al., 2000; S. Hamitouche et al., 2006].
У жвачных животных [H.B. Курилов, и др., 1971] переваривание питательных веществ происходит в преджелудках (рубцово-сетковая полость). Гидролиз клетчатки, крахмала, белков, липидов осуществляется ферментами симбионтных микроорганизмов (бактерии, инфузории, грибы) в виде бродильных процессов - уксуснокислого, пропионовокислого, маслянокислого, молочнокислого, спиртового. В результате брожения образуются газы (углекислый газ, метан, сероводород, аммиак) и ЛЖК -уксусная, проипионовая, масляная. Вместе с тем образуется алкоголь и ацетальдегид. Этиловый спирт и ацетальдегид являются обязательными участниками обмена веществ и должны рассматриваться как незаменимые факторы, создающие при их физиологической концентрации состояние функционального комфорта. Функция и роль эндогенных этанола и ацетальдегида в организме животных пока окончательно не выяснена, хотя рядом авторов подробно изучены некоторые специфические эффекты этих соединений.
Для ацетальдегида существуют особые метаболические функции [CJ.P. Eriksson, Т. Fukunaga, 1993], делающие его естественным регулятором обмена веществ и некоторых физиологических реакций. Реакционная карбонильная группировка ацетальдегида легко участвует в различного рода не ферментативных процессах: образование полуацеталей, меркаптанополуацеталей, взаимодействие с аминогруппами, участие в реакциях дисмутации и альдольной конденсации.
Оценивая биохимическое значение ацетальдегида для организма животных и человека нельзя не остановиться на участии ацетальдегида в образовании алкалоидов. Рядом авторов [V.E. Davis et al., 1970] показано, что дофамин и норадреналин неферментативно очень легко взаимодействуют с низкомолекулярными альдегидами, образуя алкалоидоподобные соединения - тетрагидроизохинолины. Наибольший интерес представляют производные тетерагидроизохинолина типа салсолинола, образующиеся в нервной ткани из норадреналина, дофамина и диоксифенилаланина [В. Sjoquist et al., 1983; М. Jamal et al., 2003].
Тетрагидроизохинолины причастны к наркоманическим механизмам патогенеза алкоголизма. Они конкурируют с естественными нейромедиаторами и налоксоном, антагонистом морфина. В эффектах тетрагидроизохинолина, как и морфина, одним из ведущих механизмов является падение уровня кальция в мозге, в связи с чем допускается прямое участие тетрагидроизохинолина в развитии алкогольной зависимости и абстинентного синдрома [М.А. Collins et al., 1990; П. Д. Шабанов, 2001]. С помощью высокочувствительного газохроматографического метода в сочетании с масс-спектрометрией доказано наличие терагидроизохинолинов, производных ацетальдегида в моче и спинномозговой жидкости здоровых людей и алкоголиков в течение 1-2 недель после прекращения приема алкоголя. При алкоголизме в моче и мозге значительно больше терагидроизохинолинов, чем у контрольных здоровых лиц. Сходные данные получены для мозга при хронической алкоголизации крыс [Ю.М. Островский, и др., 1986].
Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях
Как показано в таблице 4 содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях изменяется в диапазоне от 0,42-10"3 % до 0,80-10"3 % (от 0,10 ммоль/л до 0,18 ммоль/л). Самое высокое содержание эндогенного этанола наблюдается на начальной стадии сухостойного периода, а самое низкое его содержание отмечается на 2-ой и 3-ий месяц лактации. Молочные коровы в течение репродуктивного цикла (сухостойного периода и лактации) испытывают большое напряжение в жирнокислотном и глюкозном метаболизме, в особенности на пике лактации [Е.В. Душкин, 2009]. Так как одним из основных источников эндогенного этилового спирта в организме животных является глюкоза, то становиться понятным низкое содержание этого метаболита на 3-ий и 4-ый месяц после отела, когда происходит активное поглощение глюкозы крови молочной железой для синтеза лактозы молока. В сухостойный период содержание глюкозы крови увеличивается, чем, по-видимому, и объясняется наиболее высокое содержание эндогенного этанола в крови коров на данной фазе репродуктивного цикла.
Для оценки достоверности различий содержания эндогенного этилового спирта в крови животных изучаемых групп рассчитывали значение критерия Ньюмена-Кейлса (q) и критерия Даннета (q). В результате проведенного исследования с вероятностью 95% достоверных отличий в содержании эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях не установлено.
Метаболические адаптации в липидно-углеводном обмене на разных стадиях репродуктивного цикла проявляются критическими изменениями процессов глюконеогенеза, липолиза и липогенеза, сдвигами соотношения в организме гормонов и изменениями реактивности тканей на эндокринные и другие модуляторы. Продолжительность и величина этих адаптации может зависеть от выделения энергии с молоком, потребления энергии с кормом, генотипа и эндокринного статуса самого животного. Степень напряженности липидно-углеводного обмена зависит от уровня энергетического и протеинового питания животных, особенно в критические периоды воспроизводительного цикла. Сохранение высокого генетического потенциала молочной продуктивности скота черно-пестрой породы в значительной мере зависит от полноценности кормления. В последние годы в кормовой базе России произошли существенные изменения, которые остро поставили вопрос о повышении качества травяных и концентрированных кормов по содержанию обменной энергии, сырого протеина, легкоусвояемых углеводов. Для решения этой проблемы многие хозяйства все более широко применяют введение в рацион сельскохозяйственных животных отходов пивоваренных и спиртовых производств [А.С. Ушаков, 2007; М. Маликова, М. Сабитов, 2007]. Применение этих концентратов способствует интенсификации обменных процессов, в частности липидного и белкового обмена [М. П. Кириллов, и др., 2004], которые могут влиять на уровень этанола в крови. Однако до настоящего времени не получены данные о влиянии пивной дробины на содержание этилового спирта у крупного рогатого скота. Поэтому, на третьем этапе изучалась кровь клинически здоровых коров черно-пестрой породы одинакового физиологического состояния (15 суток после отела), но имеющих разный рацион (группы 3 и 6). Коровам 3-ей группы готовили концентрированную смесь, в состав которой входили ячмень, отруби пшеничные, подсолнечный шрот, меласса, трикальцийфосфат, соль поваренная, мел кормовой. В концентрат для коров 6-ой группы вместо части отрубей (11 % по массе) и шрота (4 %) было включено 15 % сухой пивной дробины. Концентрированную смесь скармливали на фоне основного рациона, который был одинаков для обеих групп и состоял из кормов, имеющихся в расположении хозяйства (сенаж однолетних трав, сено кострецовое, силос кукурузный). Воду животные получали без ограничения. В результате проведенных исследований выявлены достоверные отличия в содержании этого метаболита в крови коров наблюдаемых групп, при этом установлено, что концентрация этанола в крови животных 6-ой группы примерно в 6 раз выше по сравнению с коровами 3-ей группы (табл. 5). Отмечается также значительная вариабельность этого показателя в 6-ой группе (рис. 8), что, вероятно, определяется особенностями рациона. Повышенное содержание этилового спирта согласуется с данными М.П. Кириллова и др., согласно которым применение пивной дробины усиливает биохимические процессы в рубце, что приводит к интенсификации липидного и углеводного обмена, и, следовательно, должно приводить к повышению концентрации этанола. Таблица 5. Содержание эндогенного этанола в крови коров одинакового физиологического состояния, но имеющих различный
Первый продукт окисления этилового спирта в организме -ацетальдегид, который, являясь высокоактивным соединением и обязательным участником обмена веществ, должен рассматриваться как незаменимый метаболит, ответственный за нормальное течение некоторых физиологических реакций. Так ацетальдегид участвует в образовании алкалоидов в результате неферментативного взаимодействия с дофамином и норадреналином [В. Sjoquist et al., 1983; М. Jamal et al., 2003]. Наибольший интерес в этом аспекте представляют тетрагидроизохинолины, естественные катаболиты дофамина и ацетальдегида. Ацетальдегид, конкурируя за фермент альдегиддегидрогеназу с биогенными альдегидами, нарушает метаболизм биогенных аминов. При конденсации биогенных аминов с ацетальдегидом образуются алкалоиды с морфиноподобным действием, действующие как ложные трансмиттеры. Представляет определенный интерес и участие ацетальдегида в процессе образования р-карболинов и их производных, которые считаются активными фармакологическими психотропными агентами [В.Н. Жуков, 1982].
Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях
Проблема сохранения здоровья высокопродуктивных коров является одной из важных проблем современного животноводства. Общее функциональное состояние организма отражается в параметрах динамического гомеостаза внутренней среды, компоненты которой могут оказывать существенное влияние на продуктивность животных. В современных условиях значительные стрессовые нагрузки на организм сельскохозяйственных животных, в частности крупного рогатого скота, также могут в значительной мере влиять на функциональное состояние организма [СП. Лифанов, 2004; В.И. Левахин, и др., 2007]. Поэтому для сохранения продуктивного здоровья животных необходим постоянный контроль над функционированием систем, обеспечивающих нормальное течение метаболических процессов и разработка новых биохимических тестов, характеризующих эти процессы. Своевременная диагностика метаболических нарушений у крупного рогатого скота позволяет повышать продуктивность, снижать заболеваемость и падеж. С этой точки зрения эндогенные этанол и ацетальдегид, как естественные метаболиты и участники физиологических процессов являются важными показателями гомеостаза животных.
В физиологических условиях существует равновесие между ферментативными реакциями, образующими этанол и ацетальдегид и реакциями, утилизирующими эти вещества [В.Ю. Островский, И.И. Степуро, 1986]. Результатом этих процессов является низкий уровень эндогенных этанола и ацетальдегида. Однако он может повышаться вследствие нарушения метаболизма, либо вследствие длительного экзогенного поступления этих соединений [Ю.М. Островский, М.Н. Садовник, 1984; Ю.М. Островский, и др., 1986]. В то же время и этанол, и ацетальдегид в концентрациях, превышающих физиологическую норму, способны оказывать токсическое действие. Так, этанол способен оказывать непосредственное воздействие на биологические мембраны, в результате которого изменяются процессы мембранного транспорта, системы трансмембранной передачи информации и активность мембранносвязанных ферментов [Ю.М. Островский, М.Н. Садовник, 1984; С.А. Сторожок, 2001; В.Д. Прокопьева, 2003; С. Tarba, F. Suarasan, 2004; К. Mashimo, Y. Ohno, 2006]. Ацетальдегид способен образовывать аддукты с белками и нуклеиновыми кислотами, вызывая образование антител, инактивацию ферментов, нарушение репарации ДНК [J.J. Steinberg et al., 1997; Н. Kim et al., 2006]. Кроме того, это соединение может снижать уровень восстановленного глутатиона, стимулировать продукцию цитокинов и цитомединов. В связи с тем, что в последние годы в рацион животных добавляются отходы пивоваренного производства, определение этанола и ацетальдегида крови крупного рогатого скота, несомненно, представляет определенный интерес.
Состояние обмена веществ у животных является начальным и основным фактором для всех дальнейших физиологических изменений в организме. В литературном обзоре была подробно освещена та, несомненно, важная роль, которую играют в общем обмене веществ эндогенный этиловый спирт и ацетальдегид. Кроме того, рядом автором была показана прямая зависимость уровня эндогенного этанола от стрессовых нагрузок на организм животного. В современных условиях значительные стрессовые нагрузки на организм крупного рогатого скота могут понижать устойчивость организма к влиянию токсикантов [СП. Лифанова, 2004; В.И. Левахин, и др., 2007]. Общеизвестно, что и этанол, и тем более ацетальдегид, в определенных концентрациях могут оказывать значительное токсическое воздействие на различные системы функционирования организма животного. В тоже время содержание этих метаболитов в организме крупного рогатого скота не определялось и в настоящее время в литературе практически отсутствуют данные о концентрации этих веществ у изучаемых нами животных.
Следует отметить и тот факт, что, несмотря на давно используемые в практической деятельности методы количественного определения этилового спирта в биологическом материале, все они имеют некоторые недостатки. Ферментативные методы определения этанола существенно зависят от характера предварительной подготовки проб и дают завышенные результаты ввиду неспецифичности алкогольдегидрогеназы. Метод цветных реакций также недостаточно специфичен, трудоемок и характеризуется низкой воспроизводимостью. С появлением газохроматографического оборудования в конце 60-х годов прошлого века была разработана методика количественного определения этилового алкоголя в крови и моче. Методика отличается высокой точностью и воспроизводимостью, но также недостаточно специфична. При одновременном присутствии в исследуемом материале пропилового, изопропилового и этилового спиртов количественное определение последнего не представляется возможным. Поэтому, целью первого этапа данной работы была разработка новой экономичной методики количественного определения содержания этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии, позволяющей получать точные и воспроизводимые результаты. Методика основана на использовании современного газохроматографического оборудования. Отличительной особенностью методики является ее высокая специфичность, что дает возможность определения в рамках одного исследования кроме этилового спирта и ацетальдегида, таких важных метаболитов как этилацетат, ацетон, пропиловые, бутиловые и амиловые спирты и другие соединения.
Взаимосвязь эндогенного этанола крови коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (АлАТ, АсАТ, ГГТ), углеводного (глюкоза) и липидного (триацилглицериды, ЩФ) обменов
Активность ГГТ сыворотки крови коров принимает наименьшее значение на начальном этапе сухостойного периода (1-я группа). К заключительному этапу сухостойного периода (2-я группа) отмечается достоверное увеличение активности фермента. В период новотельности (3-я группа) и в период лактации (4-я и 5-я группы) активность ГГТ сыворотки крови сохраняется примерно на одном уровне и статистически не отличается.
В результате проведенных исследований установлено повышение активности ЩФ сыворотки крови коров на начальном и заключительном этапах сухостойного периода (1-я и 2-я группы) и в период новотельности (3-я группа) относительно 4-ой группы животных. Следует отметить, что наибольшее значение активность фермента принимает в период новотельности. В период лактации наблюдается снижение активности ЩФ сыворотки крови изучаемых животных.
При изучении содержания глюкозы в сыворотке крови коров следует отметить, что концентрация этого метаболита на начальной и заключительной стадии сухостойного периода (1-я и 2-я группы), а также в период новотельности (3-я группа) и на 30-ые сутки после отела (4-я группа) находиться примерно на одном уровне и статистически не отличается. С развитием лактационной доминанты отмечается достоверное увеличение глюкозы крови. Согласно литературным данным, при сопоставлении глюкозной динамики с лактационной кривой коров можно предположить об отсутствии строгой зависимости между использованием молочной железой глюкозы и ее концентрацией в крови [Е.В. Душкин, 2009].
Содержание триацилглицеридов в сыворотке крови наибольшее на начальном этапе сухостойного периода (1-я группа). Затем происходит достоверное снижение концентрации триацилглицеридов крови. Наименьшее значение концентрации триацилгицеридов отмечается на пике лактации (5-я группа). Липиды молока, как известно, преимущественно состоят из триацилглицеролов, этим, по-видимому, и объясняется низкое содержание этого метаболита в период лактации.
Итак, в результате проведенных исследований установлено, что показатели липидно-углеводного обмена и активность ферментов сыворотки крови коров на разных стадиях репродуктивного цикла находится в пределах физиологической нормы.
В ходе проведения корреляционного анализа не установлено наличия сопряженности связи между активностью АлАТ, АсАТ, ЩФ сыворотки крови коров, концентрацией глюкозы, триацилгицеридов и содержанием эндогенного этилового спирта при различных физиологических состояниях. Выявлена высокая положительная взаимосвязь между эндогенным содержанием этилового спирта и активностью ГГТ сыворотки крови коров на разных стадиях репродуктивного цикла (кроме 1-ой группы изучаемых животных). Наличие высокой сопряженности связи между активностью ГГТ сыворотки крови и концентрацией эндогенного этанола крови не противоречит имеющимся литературным данным, согласно которым приём алкоголя достоверно повышает активность фермента. Кроме того, высокая активность фермента присутствует в крови людей, пристрастившихся к алкоголю. Таким образом, существование положительной взаимосвязи между эндогенным этанолом крови и концентрацией ГГТ сыворотки крови становиться очевидным.
В целом, полученный новый фактический материал о содержании эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях, несомненно, представляет определенный интерес в качестве справочного материала по биохимии крови. Уровень эндогенного этанола крови может служить характеристикой определенного метаболического и функционального гомеостаза организма животных и может быть рекомендован в качестве нового биохимического теста. Новая методика количественного определения этилового алкоголя и уксусного альдегида в крови коров может быть рекомендована для использования в научных исследованиях по биохимии крови для совершенствования методов оценки метаболического статуса сельскохозяйственных животных. 1. Разработана новая методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров, позволяющая получать воспроизводимые и достоверные результаты. 2. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях содержание эндогенного этилового спирта крови изменяется от 0,42-10"3 % до 0,80-10"3 % (от 0,10 ммоль/л до 0,18 ммоль/л). Наблюдается снижение эндогенного этанола в крови коров от периода сухостоя к периоду раздоя: наибольшее значение концентрации этанола отмечается на начальной стадии сухостойного периода, с развитием лактационной доминанты отмечается тенденция к снижению уровня этилового спирта крови. 3. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях содержание эндогенного уксусного альдегида крови изменяется от 0,05-10" % до 0,08-10" % (от 0,01 ммоль/л до 0,02 ммоль/л). Концентрация эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях статистически не отличается. 4. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы содержание эндогенного этанола крови зависит от рациона. Введение в рацион изучаемых животных отходов пивоваренного производства (сухая пивная дробина 15 % по массе от общего количества корма в течение 6-ти месяцев) вызывает достоверное увеличение содержания эндогенного этилового спирта в крови. Для эндогенного уксусного альдегида подобных отличий не установлено.
