Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 20
1.1. Биология, экология и таксономия светящихся бактерий 20
1.2. Биолюминесцентная система бактерий - строение и функции 28
1.2.1. Реакции бактериальной люциферазы 28
1.2.2. Механизмы бактериальной люминесценции. 32
1.2.3. Генетическая организация люминесцентной системы 36
1.2.4. Регуляция свечения 37
1.2.5. Биосинтез и функционирование в биолюминесцентном процессе алифатических альдегидов 43
1.3. Биосенсоры 49
1.3.1. Микробные биосенсоры 49
1.3.2. Технология люминесцентного биомониторинга токсинов с использованием фотобактерий 59
1.3.3. Интегральная биодетекция токсинов 62
1.3.4. Биосенсоры на основе lux-маркированных и рекомбинантных штаммов микроорганизмов 65
1.3.5. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток фотобактерий 73
1.3.6. Непрерывный биомониторинг токсинов с использованием фотобактерий 82
1.3.7. Поливиниловый спирт как матрица для иммобилизации микроорганизмов 90
2. Материалы и методы 95
2.1. Бактериальный штамм 95
2.2. Условия выращивания. Среда культивирования 95
2.3. Получение биомассы 95
2.4. Технология иммобилизации фотобактерий в криогеле ПВС 96
2.5. Определение эмиссионной активности 96
2.6. Определение биомассы 97
2.7. Определение АТФ 99
2.8. Электронная микроскопия 99
2.9. Анализ токсинов 99
3. Результаты 101
3.1. Физиологические и биолюминесцентные характеристики психрофильных бактерий Photobacterium phosphoreum Белого моря 101
3.2. Иммобилизация фотобактерий в криогеле поливинилового спирта 111
3.2.1. Технология иммобилизация фотобактерий в криогеле ПВС 113
3.2.2. Факторы стабилизации биолюминесценции при иммобилизации фотобактерий в криогеле ПВС 117
3.2.3. Анализ температурной и рН зависимости свободных и иммобилизованных клеток фотобактерий 126
3.3. Выживаемость иммобилизованных в криогеле ПВС клеток фотобактерий 138
3.4. ATФ-пул и биолюминесцентная активность у свободных и иммобилизованных клеток бактерий Photobacterium phosphoreum 145
3.5. Иммобилизованные в криогели ПВС фотобактерии в биолюминесцентном мониторинг экотоксикантов 158
3.6. Анализ тяжелых металлов, хлорфенолов и пестицидов с использованием иммобилизованных препаратов 161
3.7. Иммобилизованные в криогеле ПВС фотобактерии в непрерывном биомониторинге токсинов 163
4. Заключение 166
5. Выводы 174
6. Список литературы 175
- Реакции бактериальной люциферазы
- Биосенсоры на основе lux-маркированных и рекомбинантных штаммов микроорганизмов
- Технология иммобилизации фотобактерий в криогеле ПВС
- Иммобилизованные в криогели ПВС фотобактерии в биолюминесцентном мониторинг экотоксикантов
Реакции бактериальной люциферазы
Трудами ученых Дж.Мак-Элроя, Дж.Гастингса, С.Шимамуры, Ф.Джонсона, С.Стреллера и М.Кормьера, Е.Мейгена и других к настоящему времени определены основные физиолого-биохимические и физико химические характеристики биолюминесцентного процесса, структурные и энергетические параметры биолюминесцентной системы. Установлена структура бактериальных люцифераз различных видов бактерий, получены кристаллические структуры бактериальных люцифераз, охарактеризованы субстраты и интермидиаты биолюминесцентного процесса. Изучена генетическая организация биолюминесцентной системы бактерий, механизм трансформации химической энергии в световую, регуляция свечения на биохимическом и молекулярно-генетическом уровне. Получен широкий круг lux-маркированных генно-инженерных штаммов многих видов бактерий. Разработаны биолюминесцентные тест-системы с использованием бактериальной люциферазы, природных фотобактерий и генно-инженерных штаммов для применения в детекции широкого спектра биологически активных веществ и экотоксикантов [2; 4; 16; 20; 25; 44]. Предложены разнообразные схемы преобразования энергии бактериальной люциферазы [38; 39; 41; 61; 62; 69; 121; 140]. Широкий круг исследований направлен на решение практических вопросов применения бактериальной люциферазы и светящихся бактерий для аналитических целей в различных задачах клинической медицины, ветеринарии, охране окружающей среды, фармакологии и других областях. Исследования последних лет направлены на решение молекулярно-генетических и биотехнологических задач.
Светящиеся бактерии широко использованы для выяснения механизмов клонирования генов и получения новых рекомбинантных штаммов [82]. Основную привлекательность светящимся бактериям в области молекулярно-генетических исследований создает простота контроля за тем или иным процессом – по эмиссионным параметрам люциферазной реакции.
К фундаментальным достижениям научных исследований в области бактериальной биолюминесценции могут быть отнесены следующие: установлены субстраты бактериальной люцифиразы и стехиометрия люциферазной реакции; идентифицировано , - субъединичное строение люциферазы; показана функциональная роль длинноцепочечных алифатических альдегидов (С8-С16) в биолюминесцентном процессе; проанализированы кинетические стадии и числа оборотов разных люцифераз; определены физические характеристики квантового выхода эмиссионного процесса; показано образование 4--гидроперикиси на первичных стадиях преобразования энергии и флавин-4--гидроксида на конечной стадии процесса. Установлено, что бактериальная люцифераза функционально является монооксигеназой. Исследованы пути биосинтеза алифатических альдегидов клетки и систем восстановления флавинового субстрата люциферазы (редуктаза жирных кислот и НАДН:ФМН-оксидоредуктаза).
Исследование бактериальной люминесценции наиболее интенсивно проводились в течение последних 40 лет. Условно эти исследования можно разбить на следующие этапы: 1. 60-80 годы – физиолого-биохимическая эра. Основные достижения: установлен статус фотобактерий, изучена физиология и морфология фотобактерий, строение люминесцентной системы, выделены и охарактеризованы бактериальные люциферазы из различных штаммов фотобактерий. Описан механизм преобразования энергии люциферазой. Результатом практического применения являлась разработка на основе бактериальной люциферазы разнообразных аналитических датчиков на биологически активные вещества для клинической медицины и биотехнологии. Два основных элемента успешной реализации биолюминесценции в аналитических задачах: высокая интенсивность излучения как in vivo, так и in vitro, позволяющая использовать простую фоторегистирующую аппаратуру и экспрессно детектировать метаболиты и ферменты на пикомолярном уровне. 2. 80-90 годы – значительные достижения по молекулярно генетической организации биолюминесценцентной системы бактерий.
Клонирование генов люминесцентной системы в различные объекты. Получение кристаллической формы люциферазы. Детализация механизма свечения. Идентификация альтернативных (вторичных) флуоресцентных BFP (blue fluorescent protein) и YFP (yellow fluorescent protein) эмиттеров. Выявление регуляторных механизмов свечения. Изучение кворума сенсинга и функциональной роли ацилгомолактонов в аутоиндукции биолюминесцентной реакции. Создание на основе фотобактерий и разнообразных рекомбинантных штаммов токсикологических биосенсоров на тяжелые металлы, пестициды, инсектициды и другие загрязнители среды. 3. 90-е годы по настоящее время – прогресс в научно-фундаментальных знаниях о биолюминесценции позволил создать ряд генрепортерных технологий и высокочувствительных люминесцентных систем, используемых в качестве маркеров для общей биологии, медицины и биотехнологии. Светящиеся бактерии в широких масштабах используются для молекулярно-генетических исследований. Получен набор разнообразных рекомбинантных организмов с lux CDAВE генами. Осуществлено конструирование новых типов биосенсоров на основе природных и рекомбинантных штаммов, как в свободном, так и в иммобилизованном виде. Технологии иммобилизации фотобактерий и lux – рекомбинантных клеток выполнена на различных природных и синтетических носителях, проведено конструирование специфических биосенсорв и технологических оперций для точечной и непрерывной детекции загрязнений окружающей среды. Разработанные технологии биомониторинга экотоксикантов широко использованы в комплексе мер защиты окружающей среды, основанных на применении люминесцентных бактериальных биосенсоров.
К настоящему времени значительный прогресс достигнут в создании различных типов биосенсоров на основе бактериальной люциферазы и интактных клеток фотобактерий для анализа биологически активных веществ (метаболитов, ферментов и других природных соединений), а также для анализа токсинов различной химической природы (тяжелые металлы, разнообразные ксенобиотики, пестициды, инсектициды и другие загрязнителей окружающей среды). Основой широкомасштабного аналитического применения люциферазы и фотобактерий является, прежде всего, высокая чувствительность (ряд веществ анализируется на микромолярном и пикомолярном уровне), быстродействие и экономичность процедуры анализа.
Вопросам экологического биомониторинга уделяется повышенное внимание в связи с существенным загрязнением окружающей среды промышленностью. В использовании фотобактерий для интегральной оценки загрязнения среды, контролем за токсичностью веществ, выбрасываемых промышленными предприятиями, анализом токсичности новых фармакологических и других препаратов, основано на ингибировании эмиссионной реакции. Значительная доля исследований связана с использованием рекомбинантных штаммов различных микроорганизмов с включенным lux-опероном. В данном случае проводится специфический анализ тех или иных факторов или химических агентов, вызывающих биологический стресс клетки
Биосенсоры на основе lux-маркированных и рекомбинантных штаммов микроорганизмов
Алифатические альдегиды с длиной цепи 6 и более атомов углерода является единственным классом химических соединений, способных эффективно функционировать в качестве субстратов бактериальной люциферазы. Длинноцепочечные алифатические спирты, кетоны, кислоты, а также ароматические альдегиды либо неактивны в биолюминесцентном процессе, либо функционируют в качестве ингибиторов, в большинстве своем конкурентных к альдегиду [25; 91]. Структура природного субстрата не идентифицирована, предполагается, что этим соединением in vivo может быть тетрадеканаль [83; 129], хотя это вытекает из очень косвенных данных. В ходе реакции биолюминесценции алифатический альдегид окисляется в соответствующую кислоту [80]. Фермент проявляет широкую субстратную специфичность к альдегидам. В качестве субстратов эффективны как предельные, так и непредельные, а также замещенные алифитические альдегиды [25]. Эффективность ненасыщенных и замещенных альдегидов в биолюминесцентной реакции зависит от положения кратной связи или заместителя относительно функциональной группы.
Функционирование длинноцепочечных алифатических альдегидов в качестве ко-субстратов бактериальной люциферазы установлено в работах [28; 81] и в дальнейшем подтверждено целым рядом исследователей. Основные работы, в частности аналитической направленности, выполнены с использованием предельных альдегидов (в большинстве случаев деканаль, тетрадеканаль). В более поздних исследованиях показано, что разнообразные моноеновые и диеновые цис-транс изомеры ненасыщенных алифатических альдегидов (являющиеся половыми феромонами насекомых – вредителей сельского хозяйства) также эффективны в биолюминесцентном процессе при этом эффективность С16 ненасыщенных соединений соизмерима с С14 насыщенных альдегидов (таблица 2).
По сродству люциферазы к альдегидам различной структуры данные носят противоречивый характер. Большинство экспериментальных данных свидетельствуют, что среди насыщенных альдегидов наиболее эффективным субстратом люциферазы из V. harveyi, P. phosphoreum и V. fischeri является тетрадеканаль. В некоторых случаях по неустановленным причинам наибольшая активность наблюдается с деканалем [25; 38; 42]. Целый ряд ненасыщенных альдегидов с длиной углеродного скелета С14С16 проявляют себя более эффективными субстратами, чем тетрадеканаль [25]. Таким образом, строгой закономерности между структурой альдегида и интенсивностью свечения не установлено.
Вопрос о природном альдегидном субстрате у светящихся бактерий до настоящего времени остается открытым. Обнаружение альдегидного субстрата люциферазы в реакции in vitro поставило вопрос об идентичности длинноцепочечных альдегидов как субстратов in vivo. Поскольку из различных химических соединений только алифатические альдегиды способны стимулировать люминесценцию, естественно было считать, что субстратами in vivo тоже должны быть альдегиды.
Соединения альдегидной природы были обнаружены в экстрактах P. phosphoreum [125] и у V. fischeri [32], хотя у последнего не показано связи с люминесцентной системой. В 1974 году были выделены эндогенные С12, С14 и С16альдегиды из P. phosphoreum и V. fischeri [122]. Необходимо отметить, что по расчетам авторов, выделенного альдегида (600 и 90 нмоль для P. phosphoreum и V. fischeri соответственно) хватит для поддержания свечения клеток всего на одну секунду. Соответственно необходимо предполагать наличие у фотобактерий достаточно мощной системы генерации алифатических альдегидов.
Исследование люминесцентной реакции различных мутантов позволило выяснить многие особенности биосинтеза альдегидного фактора in vivo. Сообщение о темновых мутантов, полученных ультрафиолетовым воздействием, нуждающиеся в экзогенном альдегиде для свечения, но не для роста [109], указывало на то, что в мутанте блокирован путь биосинтеза альдегидов (альдегид-зависимые мутанты).
В работах Е.Мейгена с соавторами [81; 83] подробно описывается участие специфических полипептидов в процессах образования и деградации алифатических альдегидов. В этот процесс вовлечены по крайней мере 7 полипептидов у V. harveyi, синтез которых индуцируется в процессе развития биолюминесценции. Два из них, очевидно, соответствовали - и субъединицами люциферазы. Основываясь на собственных данных, а также на результатах работы [24], где показано существование (по крайней мере) двух индуцибильных ферментов альдегидного синтеза, авторы предположили, что из оставшихся 5 полипептидов один окисляет альдегид, а два или больше участвуют в его синтезе.
В метаболизме алифатических альдегидов задействовано несколько ферментов редуктаза жирных кислот, люцифераза, альдегид-дегидрогеназа, НАД(Ф)H:ФМН-оксидоредуктаза. Основную роль в процессе синтеза алифатических альдегидов отводится редуктазной реакции.
Поиск системы, процуцирующей альдегиды in vivo привел [81] к результатам, ставшим основой в изучении механизма образования альдегидного субстрата. Инкубация экстракта из P. phosphoreum, содержащего люциферазу, в течение 10 мин. c НАД(Ф)H и ATФ стимулировала активность люциферазы в 1300 раз по стандартному анализу с ФМНH2. В присутствии миристиновой кислоты эффект стимуляции возрастал в 1500 раз. Было также показано, что экстракты P. phosphoreum, выдержанные при 4С в течение 20 часов, сохраняли 100%-ную люциферазную активность (с додеканалем), но только 15% этой активности способно было стимулироваться ATФ, НАД(Ф)H и миристиновой кислотой. Было сделано предположение, что НАД(Ф)H и ATФ необходимы для синтеза альдегидного фактора, причем он может образовываться из миристиновой кислоты при участии фермента редуктазы жирной кислоты. Такой же эффект ATФ и НАД(Ф)H позднее наблюдали в работе на грубых экстрактах из P.leiognethi [1]. Другие субстраты и кофакторы (СоА, НАДФ, Mg2+, ГTФ) были неэффективны в качестве стимуляторов люминесцентной реакции.
Анализ, выполненный с использованием (3Н)-миристиновой кислоты, подтвердил ранее предложенный механизм, по которому сначала происходит активация жирной кислоты с участием АТФ до ацильного интермедиата и затем его восстановление в соответствующей длинноцепочечный альдегид [81]. После продукции тетрадеканаля происходит его дальнейшее восстановление до спирта, что связывается с наличием альдегидредуктазы (алкогольдегидрогеназы) в экстрактах [81].
Прямым измерением активности редуктазы жирной кислоты показано, что синтез ее соиндуцирован с синтезом люциферазы [83]. Хотя активность редуктазы не выявлена в экстрактах V. harveyi [129], исследование in vivo позволяют предполагать, что этот фермент присутствует в клетках и также индуцибелен [129]. Отсутствие биолюминесцентной активности редуктазной реакции предположительно вызвано слабой «сопряженностью» ферментных систем у данного вида бактерий, хотя никакого фактического материала не представлено.
Таким образом, функционирование длинноцепочечных алифатических альдегидов в качестве ко-субстратов бактериальной люциферазы установлено в ряде работ [21; 24; 38; 81] и в дальнейшем подтверждено целым рядом исследователей.
Технология иммобилизации фотобактерий в криогеле ПВС
В работе [16] подробно описаны результаты исследования за десятилетний период по технологиям получения генно-инженерных штаммов, процедурам иммобилизации, способами хранения и применения природных и генно-инженерных штаммов в лабораторном и практическом использовании биосенсоров в токсикологическом биомониторинге. Принципиальным отличием указанных систем является создание комбинированного комплекса оптоволоконного детектора с биодетекторами. Результаты по усовершенствованию технологии получения комбинированных биосенсоров, на основе иммобилизованных на оптоволоконных нитях природных и рекомбинантных штаммов для цитотоксичного и генотоксичного анализа представлены в работах [58; 99; 100]. Разнообразные репортерные бактерии (в частности различные штаммы Pseudomonas, Salmonella) используются для специфического анализа конкретных веществ. В качестве примера можно привести работу, выполненную в целях разработки биосенсоров на основе генно-инженерных биолюминесцентных бактерий с репортерным элементом на катаболитную репрессию с целью непрерывного биомониторинга салицилата и нафталена в режиме реального времени [44]. Кроме того, биосенсоры использованы для анализа эффекта катаболитной репрессии промышленных отходов. В качестве репортерных бактерий выбран штамм Pseudomonas fluorescence HL44, который содержал транскипционную nahG-luxCDABE сшитую конструкцию. Экспозиция с нафталеном и салицилатом вызывала индукцию свечения указанного штамма. Репортерная культура была иммобилизована и закреплена на поверхности фотодетектора с помощью Sr-альгинатного геля.
Иммобилизованные биосенсоры использованы для анализа указанных веществ как в точечном, так и в проточном режиме. Оптимизированы условия и концентрационные диапазоны веществ, вызывающих индукцию света. Установлено, что как величина максимума эмиссии, так и скорость индукции зависят от времени инкубации и концентрации веществ (доза/время). Экспозиция биосенсора с другими соединениями: глюкозой, толуеном, а также комплексной питательной средой приводила к индукции свечения, но в минорном отношении к свечению с нафталеном и салицилатом. По результатам работы сделан вывод, что данная система применима для анализа реальных загрязнений среды и промышленных отходов, а также для оценки метаболического состояния тех или иных биообъектов. Непрерывное культивирование позволяет проводить детекцию в режиме реального времени. Для данного биотестирования эффективно функционируют иммобилизованные в Са-альгинате клетки. Отмечена линейная зависимость индуцированного биолюминисцентного ответа с концентрацией веществ как на свободных, так и на иммобилизованных бактериях. Авторы обращают внимание на высокую стабильность альгинат-глицерольной суспензии клеток при температуре -70С.
В заключении работы рассматривается возможность применения сконструированных биосенсоров для анализа широкого круга органических и неорганических загрязнений и процессов, связанных с их деградацией и детоксикацией.
Представленные в работе [94] данные получены на рекомбинантном штамме Salmonella typhimurium TA1535, сконструированный из плазмиды с индуцибильным SOS-промотером, сцепленного с luxCDABE опероном из Photobacterium leiognathi. Цель данной работы разработка биолюминесцентного сенсора для применения в мониторинге природных загрязнителей среды. Указанный рекомбинантный штамм был иммобилизован в агаровом носителе. Процедура иммобилизации в агаровом носителе достаточно проста и включает в себя использование 96-луночной матрицы (10 мкл смеси в лунке планшета) при 30-минутной инкубации для полимеризации и хранении при 4С. Принцип анализа аналогичен другим рекомбинантным биосенсорам индукция свечения. Модельные эксперименты по индукции свечении данного штамма выполнены с ДНК – повреждающим генотоксичным агентом митомицином С. Анализ проводился в микротитровых платах, которые сохраняли активность при хранении при 4С в течение 6 недель. Ответ четырехнедельной культуры на митомицин С не отличим от ответа свежей иммобилизованной культуры.
Биосенсоры, на основе суспензии клеток обладают некоторыми недостатками: комплексная процедура вспомогательных и основных операций анализа и длительность времени получения стандартных препаратов клеток отражаются на экономичности и экспрессности анализа. Иммобилизованные клетки более экономичны и стандартны. Основные затраты как правило касаются технологии получения рекомбинантных штаммов. Кроме того, следует отметить, что эмиссия света наблюдается после длительной (до 250 минут) лаг-фазы. Как величина максимального ответа, так и длительность лаг-фазы зависят от концентрации митомицина С. Максимальный активационный ответ - при приблизительно 1 мкг в мл митомицина С. Принципиально, что дальнейшее увеличение митомицина приводит к резкому тушению свечения. Очевидно, в данном случае проявляется цитотоксичное действие антибиотика, которое сходно с действием токсинов на рекомбинантные клетки других бактерий при высоких концентрациях.
Иммобилизованные в криогели ПВС фотобактерии в биолюминесцентном мониторинг экотоксикантов
В то же время ряд физиологических и эмиссионных параметров существенно отличают фотобактерии Белого моря от известных штаммов того же вида, выделенных из глубин океанов или Северного моря (шт. № 11040 ATCC, №2 167, DSM, 20393, 21184, JCM).
Совокупность накопленного материала по культивированию фотобактерий позволяет выделить в контроле роста и свечения доминирующие физиологические элементы. В первую очередь к ним относятся восстановительный потенциал клетки, сопряженность цепи переноса электронов на люциферазу, пул АТФ, тип эмиттеров, а также процесс формирования альдегидного субстрата люциферазы. Следствием комплексного контроля является люминесцентный цикл, параметры которого специфичны для каждого вида бактерий.
Проведен детальный анализ кинетики роста, свечения, изменения рН среды и пула АТФ при глубинном культивировании, а также спектральные параметры свечения, температурная, рН и солевая зависимость свечения беломорского штамма Photobacterium phosphoreum, (КМ МГУ № 331), энтеробактерий Mioxocephalus scorpius. Спектр биолюминесценции клеток выделенного штамма, снятый при 15оС, характеризуется относительно широким максимумом при 476-480 нм и плечами (сглаженные
Наблюдаемая спектральная картина логично соответствует доминирующему функционированию у бактерий в относительно низких температурных условиях люциферазного (lux) и люмазинового (LP) излучателей света. Плечо при 540 нм свидетельствует о наличии у данного штамма YFP- белкового эмиттера, обычно характерного только для бактерий Vibrio fischeri Y-1, При этом эффективность генерации фотонов люмазиновым (475нм) и флавин-люциферазным (495нм) излучателями у данного вида бактерий соизмерима, что определяет перекрывающуюся спектральную картину в области максимума, вклад YFP (530нм) в общую светосумму незначителен.
Исследуемый штамм отличается эффективным ростом при длительной эмиссии при 4оС, скорость роста на агаризованной среде как минимум в 3 раза выше, чем у известных штаммов того же вида (штамм 11040 ATCC), продолжительность свечения колоний до 1 месяца. При культивировании бактерий при 20оС логарифмическая фаза роста 20-24 ч., стационарная фаза свыше 100 часов, незначительные флуктуации плотности популяции наблюдается на 3 сутки культивирования. На рисунке 24 представлены данные по динамике роста и свечения Photobacterium phosphoreum (КМ МГУ № 331) в глубинной культуре. Удельная люминесцентная активность в глубинной культуре на порядок выше, чем у штаммов того же вида, выделенных из более теплых регионов, в частности, известного штамма АТСС 11040, и достигает в оптимальных условиях 105 квант/скл. Эмиссионная активность практически не изменяется в логарифмической фазе роста бактерий, что свидетельствует об отсутствии аутоиндукции в процессе синтеза люциферазы de novo. Установлена повышенная длительность и стабильность свечения при температуре не превышающей 25оС. За 120 часов культивирования эмиссионная активность снижается не более, чем на 1 порядок. У известных штаммов того же вида люминесцентный цикл полностью завершается максимум за 48 часов в идентичных условиях.
Известна критическая роль в стабильности и длительности свечения в процессе роста биомассы сдвига рН среды кислыми продуктами метаболизма. Автокаталитическое закисление среды подавляет эмиссионную активность. Величина сдвига варьируется у разных видов и штаммов фотобактерий от 0,5 до 1,5 ед. рН. При культивировании данного штамма в стандартной богатой среде с пептоном, дрожжевым экстрактом и глицерином в качестве источника энергии и углерода, при начальных значениях рН =7,5; сдвиг рН в кислую область за весь временной период роста незначителен, с 7,5 до 7,2 ед рН. Все изменения рН происходят в логарифмической фазе роста. Очевидно, что относительная стабильность рН среды служит важным элементом длительности свечения растущей культуры.
Специфичной особенностью является длительное и интенсивное свечение покоящихся клеток в микроаэрофильных условиях при 4С. В отсутствие аэрации наблюдается интенсивное брожение с сильным образованием газа. Эмиссионная активность при брожении сохранялась на стабильно высоком уровне (20% по сравнению со свечением в полностью насыщенном кислородом растворе), в течение 5 суток, общее снижение свечения за 20 суток не более 1,5 порядка. Наблюдаемая картина резко отличается от поведения известных штаммов того же вида, которые в тех же условиях полностью теряют эмиссионную активность за 1-2 суток.
Особое значение для эмиссионного процесса имеет пул АТФ, который служит нтегральным индикатором темновых и световых реакций. Даже если пул AТФ делает несколько оборотов в секунду, внутриклеточное содержание AТФ (0,2-2,010-18 моль/кл) может иметь критическое значение для биолюминесцентной реакции. Существенное потребление ATФ должно происходить и непосредственно в редуктазной реакции образования альдегидного субстрата люциферазы.
Интегральный анализ эмиссии растущими клетками показал, что общее количество высвеченных фотонов как минимум на порядок выше, чем содержание АТФ в клетке. Принципиально, что удельное содержание АТФ в клетке (1-210-18 моль/кл) не изменяется в течение всего (более 100 часов) культивирования. Характеристики температурной, рН и солевой зависимости являются важными диагностическими, физиологическими и экологическими признаками штамма. На рисунке 25 представлены профили температурной, рН и солевой зависимости изолированный клеток фотобактерий из поздней лагорифмической фазы роста.
