Введение к работе
Актуальность проблемы
Способность к движению является одним из основных свойств животных клеток. Движение клеток и клеточных слоев лежит в основе таких процессов, как формирование различных органов в эмбриогенезе, заживление ран и развитие воспалительных процессов. Движение клеток бывает очень разнообразно, зависит от типа клеток и от условий, в которых осуществляется миграция. Например, клетки эпителиального происхождения обычно перемещаются группами или целыми слоями, сохраняя при движении межклеточные контакты. Такой тип миграции называется групповым движением клеток. Наоборот фибробласты двигаются в индивидуальном порядке и демонстрируют так называемый мезенхимальный тип клеточного движения.
При различных патологиях нарушается характер движения клеток. В частности в процессе развития злокачественных опухолей клетки приобретают способность проникать в соседние ткани и органы (инвазировать) или могут образовывать отдаленные очаги роста - метастазы. Способность клеток опухоли к инвазии и метастазированию является одной из основных причин смертности людей, страдающих от онкологических заболеваний. В процессе опухолевой прогрессии клетки претерпевают существенные морфологические изменения, что и приводит к приобретению ими несвойственных ранее способностей и изменению характера движения. В частности эпителиальные клетки при развитии опухоли претерпевают так называемый эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) при котором нарушаются межклеточные контакты, клетки приобретают фибробластоподобную форму, могут двигаться поодиночке. При этом существенно возрастает возможность их индивидуальной миграции и они могут инвазировать в близлежащие органы. В последнее время был так же описан так называемый мезенхимально - амебоидный переход (МАП), в результате которого клетки начинают двигаться на амебоидный манер, напоминающий движение лимфоцитов. При этом резко увеличивается скорость движения индивидуальных клеток в Зх-мерном матриксе и практически пропадает зависимость движения клеток от контактов с субстратом или активности ферментов, растворяющих матрикс - матриксных металл опротеаз (ММП). Картина усложняется тем, что при определенных условиях клетки могут возвращаться к прежнему способу миграции, что очень затрудняет попытки найти способы регуляции движения и ингибирования инвазии опухолевых клеток. Это свойство опухолевых клеток было описано несколько лет назад и называется пластичность опухолевых клеток (Wolf et al., 2003). Поэтому чрезвычайно важно знать, какие механизмы отвечают за тот или иной способ миграции и что регулирует движение клеток.
Давно показано, что в основе движения клеток лежат перестройки цитоскелета, в частности актинового цитоскелета. Выделяют несколько основных этапов движения - образование протрузий на ведущем краю клетки, закрепление этих протрузий с помощью адгезионных структур, подтягивание и перенос тела клетки за счет акто-миозинового сокращения. Известно, что основной механизм формирования актиновых филаментов - это полимеризация сети на краю клетки. Однако оставалось неясным, каким образом густая равномерная сеть актина перестраивается в пучки микрофиламентов, способные к сокращению. Так же был неизвестен вклад каждой из составляющих клеточного движения - образования протрузий и акто-миозинового сокращения в эффективность клеточной миграции.
В последнее время был сделан огромный методологический скачок, появились новые методы микроскопии - фазово-контрастная микроскопия с компьютерным усилением, конфокальная микроскопия, электронная томография, открывающие новые возможности в исследовании клеточных структур. С помощью трансфекции белков, меченных флуорохромами, появилась возможность наблюдать за динамикой и активацией индивидуальных белков при движении живых клеток. В связи с этим представляется актуальным с применением этих новых методов исследовать динамику формирования и реорганизации цитоскелета при движении нормальных клеток, чтобы понимать, какие механизмы лежат в основе клеточного движения.
Как уже отмечалось выше, при прогрессии опухолей резко меняется морфология и характер движения клеток. Различия в строении актинового цитоскелета у нормальных и трансформированных клеток были описаны ранее. Общепринят факт, что опухолевые клетки отличаются от нормальных отсутствием крупных пучков микрофиламентов - стресс-фибрилл и крупных зрелых фокальных контактов. Для трансформированных клеток характерно или полное отсутствие пучков микрофиламентов, или остаточные актиновые пучки и наличие мелких точечных фокальных комплексов. Но вопрос о том, как и почему указанные изменения приводят к возникновению у опухолевых клеток способностей к инвазии в соседние ткани, остается открытым.
Цели настоящей работы.
Исходя из сказанного выше, в настоящей работе были поставлены две основные цели: -
1. Исследовать перестройки актинового цитоскелета, лежащие в основе движения нормальных клеток, проанализировать вклад разных составляющих -полимеризации актиновой сети и акто-миозиновой сократимости - для обеспечения эффективного клеточного движения, выяснить роль образования адгезионных структур в реорганизации актинового цитоскелета.
2. Исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета, возникающие при опухолевой трансформации и приводящие к изменению характера клеточного движения и приобретению клетками инвазивного фенотипа.
Задачи исследования:
Используя в качестве активаторов клеточного движения скэттер-фактор (HGF/SF) (для эпителиальных клеток) и опухолевый промотор форболовый эфир РМА (для фибробластов) исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета при инициации движения, определить роль системы микротрубочек и транспорта внутриклеточных частиц в миграции клеток.
С помощью специфических ингибиторов, исследовать роль основных составляющих клеточного движения - формирования протрузий на ведущем крае и актин-миозинового сокращения для эффективного движения клеток.
С примененим современных микроскопических техник (видеомикроскопии живых клеток, метода компьютерно-усиленного фазового контраста, видеонаблюдения за меченными белками, инъецированными в клетку и т.д.) исследовать структуру и динамику ведущего края клетки при движении.
С помощью коррелятивной видео и электронной микроскопии и с применением электронной томографии исследовать ультраструктуру и динамику актинового цитоскелета и адгезионных структур на ведущем крае при движении клеток. Исследовать на белковом уровне динамику формирования адгезионных структур с субстратом и предложить модель реорганизации актинового цитоскелета при движении клеток.
Исследовать роль второй составляющей - акто-миозинового сокращения для движения клеток с помощью высокоспецифичных ингибиторов акто-миозинового сокращения. Для этого исследовать динамику движения клеток, регуляцию направленности движения и формирование клеточного монослоя в условиях ингибирования сократительной активности.
Исследовать изменения характера движения клеток, вызванного неопластической трансформацией с помощью нескольких альтернативных методов и проанализировать, какие именно морфологические изменения существенны для приобретения клетками инвазивного поведения.
Исследовать ультраструктуру актинового цитоскелета фибробластов с разной степенью трансформации и выявить нарушения строения цитоскелета определяющие проявление инвазивного фенотипа.
Для выяснения механизмов изменения клеточной морфологии при трансформации проанализировать влияние экспрессии онкогенов (N-Ras) на
морфологию фибробластов. Исследовать изменения морфологии и цитоскелета фибробластов под влиянием активных кислородных радикалов (ROS).
Научная новизна и практическая ценность.
Исследованию подвижности клеток и механизмам, определяющим эту подвижность, уделяется огромный интерес в мире. Благодаря бурному техническому развитию микроскопии в последнее время появилось много новых методов и подходов, позволяющих изучать движение индивидуальных клеток. В настоящей работе было использовано уникальное сочетание современных методов - видеомикроскопию, метод компьютерно-усиленного фазового контраста, TIRF (тотальную интерференционно-отражательную микроскопию), конфокальную микроскопию. Для осуществления коррелятивной электронной и видеомикроскопии был разработан метод, позволяющий, сочетать видеосъемки живых клеток с последующим изучением на электронномикроскопическом уровне клеточных структур с известной жизненной историей. Впервые в сочетании с корреляционной электронной микроскопией был применен метод электронной томографии, позволяющей с высоким разрешением исследовать Зх-мерное строение адгезионных структур построить модели реорганизации цитоскелета на разных стадиях формирования ФА. Полученные модели прояснили механизмы формирования адгезионных структур и перестройки цитоскелета при движении клеток. Проведенные исследования продемонстрировали важнейшую роль формирования новых адгезионных структур в процессе реорганизации актинового цитоскелета во время клеточного движения.
Исследование динамики трансфицированных в клетку белков - компонентов фокальных адгезии позволило внести существенный вклад в современное представление о строении и динамике адгезионных структур. Впервые в мире была выделена стадия инициальных фокальных адгезии, как начальная стадия формирования адгезионных структур. Ранее эта стадия не была описана исследователями из-за методических трудностей, и только использование такого широкого набора белков-маркеров и последующее исследование структуры с помощью коррелятивной электронной микроскопии позволило выделить этот этап формирования ФА. Впервые была показана роль белка VASP, как организатора сборки фокальных адгезии. Трансфекция клеток белками, меченными флуорохромами, позволила наблюдать перестройки актинового цитоскелета при движении клеток, дало возможность выяснить механизмы, регулирующие динамику цитоскелета. Были исследованы две зоны, образующиеся на активном ведущем краю - ламеллиподия и ламелла. Впервые в мире было показано, что основным процессом, определяющим быстрый ретроградный ток в ламеллиподии,
является полимеризация актина, тогда как медленный ретроградный ток в ламеллиподии обеспечивается акто-миозиновым сокращением. Впервые в мире было показано, что формирование адгезионных структур de novo происходит в зоне ламеллиподии и при дальнейших перестройках именно позиция этих структур определяет положение границы между ламеллиподией и ламеллой. Эти исследования вносят весомый вклад в понимание процессов перестройки цитоскелета, лежащие в основе клеточного движения.
Изменение характера клеточного движения приводит к проявлению таких свойств опухолевых клеток, как способность к инвазии. Важность исследования механизмов, приводящих к подобным изменениям, сомнению не подлежит. В работе была сделана комплексная оценка изменений, вызываемых неопластической трансформацией, с применением большого набора различных методов (иммуноморфологии, электронной микроскопии, видеомикроскопии живых клеток, разнообразных тестов на эффективность миграции, биохимических исследований регуляции подвижности) на нескольких клеточных системах, включающих в себя контрольные (нетрансформированные) фибробласты и те же клетки с разной степенью трансформации, полученные в результате трансформации разными агентами.
Впервые проведен сравнительный компьютерный анализ динамики активного края нормальных и трансформированных клеток и в результате показано, что характерным признаком трансформации фибробластов является значительное перераспределение псевдоподиальной активности. У трансформированных клеток существенно возрастает доля активного клеточного края и соответственно уменьшается стабильный край. При трансформации клеток изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети в ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом. С помощью метода платиновых реплик (электронная микроскопия) выявлена ультраструктурная основа такого перераспределения: нарушение регулярности актиновой сети, появление большого количества «дыр» в подмембранном слое актина на ведущем краю клетки и разрушение краевого актинового пучка, в норме стабилизирующего боковые края клеток. В результате исследования клеточных линий, находящихся на разных стадия опухолевой трансформации, показано, что по мере нарастания таких признаков трансформации, как изменение ультраструктуры цитоскелета и перераспределения активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется
и/или усиливается способность к трехмерной миграции через поры камеры Бойдена и способность к инвазии. Проведенная работа дает основание предположить, что именно перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого, трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии.
Впервые показано, что, по крайней мере одним из механизмов, лежащих в основе изменения морфологии и подвижности клеток является накопление активных кислородных радикалов (ROS) под действием гиперэкспрессии онкогена N-Ras, и одним из путей возвращения нормального фенотипа может быть обработка клеток антиоксидантами (в нашем случае N-ацетил цистеином).
Полученные результаты имеют не только теоретическое, но и важное научно-практическое значение, так как показывают новые подходы к нормализации морфологии и движения опухолевых клеток и открывают новые направления исследований в области клеточной биологии и антиопухолевой терапии.
Наиболее важным этапом, определяющим движение клеток, является формирование активного ведущего края. Акто-миозиновая сократимость существенна для упорядочивания движения и правильного формирования клеточных слоев.
Две зоны ведущего клеточного края - ламеллиподия и ламелла- отличаются по структуре, динамическим характеристикам и по механизмам, обеспечивающим динамику актиновой сети. Положение границы ламеллиподия-ламелла и дальнейшая реорганизация актинового цитоскелета при движении клеток определяется образованием ФА.
Образование ФА начинается в ламеллиподии с формирования инициальной фокальной адгезии. Белком-организатором сборки ФА является VASP, который первым появляется в точке ФА. Инициальные ФА являются необходимой стадией формирования ФА, хотя еще не сопряжены с выраженной структурной организацией актиновой сети.
Характерным признаком неопластической трансформации фибробластов является перераспределение краевой активности. При этом существенно увеличивается доля активного и, соответственно, сокращается доля стабильного края, а также изменяется характер псевдоподиальной активности на ведущем крае клетки. Эти признаки нарастают по мере нарастания степени трансформации клеток.
Изменение характера и распределения краевой активности у трансформированных клеток связано с нарушениями структуры
цитоскелета, видимыми при электронно-микроскопических исследованиях. Это приводит к изменению характера клеточной миграции и появлению у опухолевых клеток способностей к инвазии. 6. По крайней мере одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (ROS) в результате оверэкспрессии онкогена N-Ras. Обработка таких клеток антиоксидантом NAC (N-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток.
Конкретное участие автора заключалось в планировании исследования, разработке методологии, выборе моделей, составлении программы. Проведение экспериментов, получение научных результатов, анализ этих результатов, формулировка научных положений и выводов проводились диссертантом самостоятельно.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме „Биологическая подвижность,, Пущино, 1994; The Cytoskeletal and Cell Function Meeting, Cold Spring Harbor, NY, 1995; International Congress"Cyto-skeleton and Cancer", Les Embiez(Var), France, 1995; конференции «Цитокелет и клето чная регуляция». Пущино, 11-12 мая, 2000 года; 17 European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland ,2002; FEBS special Meeting on Cytoskeletal Dynamics: From Cell Biology to Development and Disease, 2004, Helsinki, Finland ; Adhesion meeting 2005. Podosomes-invalopodia-focal adhesions. Munich, Germany; Advanced workshop on Integrated approaches in Cytoskeleton Research, 2005, Luxembourg ; 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2008», С.-Петербург, 2008; XII Российском онкологическом конгрессе, Москва, 2008 г.; на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток», С-Петербург, 2008 г.; The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting, San Diego, CA,2009 and 50th Annual Meeting, Philadelphia, PA, 2010; 13 международной пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", 2009; of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010.
Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, иммунохимии опухолей, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и лаборатории математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова в НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 12 мая 2011 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ: 13 журнальных статей (из которых 8 в зарубежных журналах), одна статья в специализированном сборнике, а так же тезисы докладов в материалах Российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание Материалов и Методов исследования, Результатов исследования, состоящих из двух частей: «Исследование реорганизации цитоскелета, лежащей в основе движения нормальных клеток» и «Исследование изменений, возникающих в результате трансформации», Обсуждения полученных результатов, Выводов и Списка литературы. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 29 таблицами. Библиография включает 393 публикаций.
Работа выполнена в отделе математических методов в биологии, Научно-исследовательском институте им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова; в лаборатории механизмов канцерогенеза, Института канцерогенеза Российского Онкологического научного Центра им. Н.Н. Блохина; ряд экспериментов проводили в Политехнической школе г. Лозанны, Швейцария, совместно с А.В. Верховским, и в институте молекулярной биотехнологии г. Вена, Австрия, совместно с группой проф. Д.В. Смолла.
