Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес к закономерностям развития популяций клеток растений in vitro возник сравнительно недавно в связи с изучением физиологии, биохимии и генетики соматических клеток растений. Основными направлениями таких работ являются характеристика роста, оценка морфогенетического потенциала культур клеток и синтеза вторичных метаболитов, а также процессов старения организма. Эти направления находятся во взаимосвязи с исследованием кинетики клеточных популяций. Однако работ, проводящих параллели между всеми этими параметрами, к настоящему времени немного.
Анализ кинетики популяций в различных условиях выращивания, а также связь деления клеток с процессами первичного и вторичного метаболизма позволяет оценить влияние окружающей среды на пролифе-ративную активность клеток. Изучение факторов, регулирующих переход из одной фазы митотического цикла в другую, механизмов чередования периодов активной пролиферации и покоя, генетического контроля этих процессов дает представление о важнейших динамических состояниях на протяжении жизненного цикла клетки. В последние годы получили развитие работы, связанные с выявлением генов, ответственных за прохождение клеточного цикла.
Использование популяций, культивируемых на искусственных питательных средах, позволяет анализировать поведение отдельных клеток в стандартных условиях. Это определяется тем. что культуры клеток, выведенные из-под контроля интегрирующих систем целого растения, представляют собой относительно однородные по своим цито-физиологическим параметрам сообщества. Кроме того, переход к росту in vitro приводит к отбору популяций клеток, главными функциями которых являются активный рост и деление.
Длительное культивирование часто вызывает реорганизацию исходного кариотипа. При этом происходит изменение как числа хромосом, так и их структуры. Поэтому для использования культивируемых клеток в качестве моделей необходима полная информация как о цито-физиологических параметрах, так и о генетических модификациях, возникающих в таких популяциях. Кроме того, изучение вариабельности генома in vitro позволяет выявить основные механизмы эволюции и прогнозировать поведение как диплоидных, так и сложных полиплоидных геномов при длительном культивировании. Сравнение изменчивости генома in vivo и in vitro дает возможность выявить механизмы этого процесса и может служить основой для исследований цитоселекции.
Однако внимание исследователей часто привлекает какой-либо один из указанных выше аспектов. Так. анализ митотического цикла in vitro и факторов, участвующих в его регуляции, проводят без учета реорганизации генома культивируемых клеток. При изучении же изменений кариотипа подчас остаются вне поля зрения кинетика популяций клеток и ее взаимосвязь с модификацией генома.
Кроме того, большинство детально описанных к настоящему времени культур получено из тканей диплоидных двудольных растений. Число же однодольных видов, а также видов полиплоидной природы, используемых in vitro в качестве модельных систем, невелико.
Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования является установление взаимосвязи между кинетикой пролиферации клеток и структурой кариотипа суспензионной культуры Т. timopheevii. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
-
Охарактеризовать физиологические параметры активно растущей длительно пассируемой суспензионной культуры клеток Г. timopheevii и определить возможную взаимосвязь между временной организацией митотического цикла и ростовой активностью.
-
Изучить особенности физиологического ответа клеток на изменения условий культивирования.
-
Охарактеризовать цитогенетический статус адаптированной к условиям in vitro суспензионной культуры Т. timopheevii.
Научная новизна работы. Проведено сравнительное изучение физиологических особенностей, в частности, пролиферативной активности и кинетики митотического цикла при переходе клеток Т. timopheevii из состояния in vivo к существованию in vitro. Впервые применен метод дифференциального С-окрашивания для исследования генома в условиях in vitro, с помощью которого были обнаружены изменения в структуре хромосом и выявлены основные тенденции реорганизации генома данного вида при длительном культивировании.
Теоретическое значение работы. Выполнение указанных задач позволило установить, во-первых, каким образом изменились параметры митотического цикла по сравнению с интактным растением при адаптации клеток Т. timopheevii к росту in vitro; во-вторых, какие изменения произошли в геноме при длительном культивировании клеток.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: 1-й, 3-й и 4-й Планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1990, 1993, 1994), VII Между-
- 5 -народном конгрессе "Культура тканей и клеток растений" (Амстердам, 1990). V Международном симпозиуме молодых ученых "Регуляция метаболизма у растений" (Варна, 1991), II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии" (Пущине 1993), II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 32 таблицы, список литературы включает 294 наименования.
