Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение внутриклеточных механизмов адаптации растений к неблагоприятным факторам среда является важным направлением физиологии растений. Действительно, температура определяет рост и развитие растений и их географическое распространение. Неблагоприятные температурные условия часто сдерживают применение в практике ценішх в хозяйственном отношении сортов и гибридов сельскохозяйственных растений (Коровин, 1984; Родченко, 1988; Кравец, 1996; Криддл и др., 1996; Хансен и др., 1996). Это обстоятельство обусловливает актуальность исследований, направленных на познание механизмов, определяющих толерантность растений к жестким температурным условиям.
Валшыми этапами в понимании природы устойчивости растений к неблагоприятным температурам явились исследования физиологических и биохимических процессов, способствующих выживанию растений в стрессовых температурных условиях (Красавцев, 1972; Туманов, 1979; Браун, 1983; Касперска-Палач, 1983; Кравец, 1996; Levitt, 1966). Было установлено, что реакция растений на температурный стресс сопроводдается изменениями структуры клеточных мембран (Kulper, 1974; Smolenska, Kuiper, 1977; Rivera, Penner, 1978; Horvath et al., 1980), активности ферментов (Войников, Тимина, 1983; Войников и др., 1986), функционирования клеточных органелд (Войников, 1987), экспрессии генов и синтеза белков (Войников, Боровский, 1994; Кузнецов, Рощупкин, 1994; Vierling, 1990, 1991).
Вызванные температурным стрессом изменения в метаболизме клеток требуют соответствующего энергетического обеспечения. Поэтому вполне понятно, что митохондрии и их реакция на изменение температуры находятся в поле зрения исследователей (Семихатова, 1974, 1990; Кравец, 1983; Войников, 1987; Хохлова, 1993; Кислюк и др., 1996; Lin, Markhart, 1990; Madden, Burris, 1995). Митохондрии функционируют в системе целостной клетки и поэтому при изучении регуляции их активности при температурных стрессах на первый план выходят вопросы их интеграции с другими клеточными компарт-ментами и внутриклеточные механизмы регуляции активности этих ор-ганелл.
Открытие стрессовых белков, белков теплового (БТШ) и холодового (ВХШ) шока, привело к некоторому прогрессу в понимании ядерно-митохондриаль ной интеграции. Установлено, что среди БТШ, обнаруженных как в цитоплазме, так и в митохондриях, имеется ряд бел-
ков, функции которых связаны с митохондриями (Moore et al., 1994; Schatz, 1993, 1995, 1996). Эти белки-шейпероны осуществляют перенос функционально значимых для органелл белков через митохондри-альные мембраны. Вполне понятно, что через синтез стрессовых белков может осуществляться контроль ядерного генома за энергетической активностью митохондрий при температурных стрессах, хотя полностью механизм такого контроля пока неясен.
Кроме синтеза стрессовых белков, видимо, существуют и другие механизмы, с помощью которых осуществляется контроль клетки за энергетической активностью митохондрий при температурных стрессах. Изучение этих механизмов представляется важным. Кроме того, остается неизученным такой важный вопрос, как функциональная автономность растительных митохондрий при температурных стрессах.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение молекулярных механизмов реакций растительных митохондрий на температурные стрессы.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) выявить реакцию митохондрий на действие гипо- и гипертермии; 2) определить полиморфизм по этому признаку; 3) изучить генетический контроль за энергетической активностью митохондрий в условиях изменяющейся температуры; 4) определить степень функциональной автономности митохондрий; 5) определить тер-моусгойчивость отдельных комплексов дыхательной цепи; 6) изучить функциональную стабильность этих комплексов в условиях in vitro;
-
изучить причины функциональной нестабильности этих комплексов;
-
определить механизмы, стабилизирующие функционирование отдельных комплексов дыхательной цепи; 9) выяснить роль стрессовых белков в такой стабилизации.
При решении поставленных задач использовали два экспериментальных подхода. Изучение реакции митохондрий на изменение температуры in vivo и анализ энергетической активности митохондрий и отдельных комплексов дыхательной цепи при действии температуры in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Реакция растительных митохондрий на изменение температуры генетически детерминирована и протекает с участием стрессовых белков.
-
При гипотермии посредником в ядерно-митохондриальных! от-
ношениях является стрессовый белок 310 кД.
-
Растительные митохондрии в функциональном отношении не являются автономными органеллами.
-
Комплексы дыхательной цепи растительных митохондрий различаются по термоустойчивости и функциональной стабильности.
-
Комплекс I дыхательной цепи и дегидрогеназы, с ним связанные, термочувствительны и функционально нестабильны.
-
Реконструкция энергетической активности инактивированных in vitro митохондрий осуществляется внутриклеточными белками.
Научная новизна. В настоящей работе на большом экспериментальном материале проведено детальное изучение характера изменений окислительной активности митохондрий злаков после действия высокой и низкой температуры.
Получены генетические доказательства существования контроля со стороны ядерного геиома за энергетической активностьп митохондрий при гипо- и гипертермии. В частности, при использовании линий озимой пшеницы Безостая 1 с межсортовым замещением хромосом от морозоустойчивой пшеницы Альбидум 114 было установлено, что гены, контролирующе функциональную активность митохондрий при гипотермии локализованы a ID и 6D хромосомах пшеницы Альбидум 114.
При выяснении вопроса о механизмах генетической регуляции активности растительных митохондрий при гипо- и гипертермии установлено, что контроль осуществляется через синтез цитоплазмати-ческих белков. Впервые показано, что при гипотермии посредником в осуществлении тагаго контроля за функциями митохондрий и термоге-незом является стрессовый белок 310 кД. Этот белок обнаружен в митохондриях и при кратковременной гипотермии вызывает переход органелл в низкоэнергетическое состояние. Количество этого белка при гипотермии в проростках морозоустойчивых озимых злаков резко увеличивается, а в 1 и б хромосомах D-генома пшеницы Альбидум 114 локализованы гены, контролирующие синтез стрессового белка 310 кД.
На примере сукцинатдегидрогеназы изолированных митохондрий озимой ржи показано, что регуляция митохондриальной активности в меняющихся температурных условиях может осуществляться через изменения кинетических параметров фермента.
Впервые для растительных митохондрий определена степень их функциональной автономности в меняющихся температурных условиях и
изучена термоустойчивость и функциональная стабильность отдельных комплексов дыхательной цепи. Установлено, что комплексы III и IV дыхательной цепи и "внешняя" NADH-дегидрогеназа являются наиболее термоустойчивыми и функционально стабильными. Комплекс I является нестабильным комплексом дыхательной цепи. Впервые изучены причины функциональной нестабильности комплекса І в условиях in vitro и показано, что нестабильность этого комплекса связана с инактивацией а-кетоглутаратдегидрогеназы и с инактивацией самого комплекса I. Инактивация о-кетоглутаратдегидрогеназы, как установлено, объясняется истощением тиаминпирофосфата в изолированных митохондриях в условиях in vitro в результате активации фосфатазы, дефосфорилирующей этот кофермент. Инактивация комплекса I связана с дефицитом в изолированных митохондриях внутриклеточных белков, в том числе и стрессовых, синтезирующихся в клетке и затем транспортируемых в митохондрии. Впервые установлено, что внутриклеточные белки, стабилизирующие активность митохондрий в условиях in vitro, имеют несколько компонентов. Небольшие пептиды, возможно, связанные с тиаминпирофосфатом (для предотвращения инактивации а-кетоглутаратдегидрогеназы), и белки с массами до 30 кД (для поддержания комплекса 1 в функциональном состоянии). Причем, в клетках растений разных видов имеются сходные белковые компоненты (с мол. массой 14-30 кД), которые необходимы для нормального функционирования митохондрий.
Показана возможность транспорта электронов при окислении ма-лата через ротенон-нечувствительную NADH-дегидрогеназу. Эти результаты подтверждают ранее выдвинутое предположение о разделении компартментов ротенон-нечувствительной NADH-дегидрогеназы и комплекса 3.
Теоретическая и практическая ценность. Выполненная работа лежит в рамках такой важной проблемы физиологии растений как изучение внутриклеточных механизмов адаптации растений к неблагоприятным факторам среды. Впервые проведенные в работе исследования показали существование значительного полиморфизма по признаку активности митохондрий высших растений в условиях температурного стресса и доказали генетическую детерминацию этого признака. Изучение степени функциональной автономности растительных митохондрий в меняющихся температурных условиях и проведенный анализ термоустойчивости и функциональной стабильности отдельных комплексов
дыхательной цепи позволили получить важную в теоретическом отношении информацию об особенностях функционирования митохондрий высших растений при температурных стрессах. Полученные в работе сведения о механизмах регуляции растительных митохондрий при ги-по- и гипертермии расширяют понимание этого вопроса и доказывают реальность существования информационной связи между ядерным геномом и митохондриями в условиях меняющейся температуры.
Разработанные в лаборатории при участии автора модификации методов выделения и изучения растительных митохондрий широко применяются и могут быть использованы в ряде научно-исследовательских учреждений.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 1984), на V республиканской конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Целиноград, 1984), на конференции "Физиолого-биохимические основы продуктивности кукурузы" (Днепропетровск, 1984), на Всесоюзной конференции "Рекомби-ногенез: его значение в эволюции и селекции" (Кишинев, 1985), на Всесоюзной конференции "Онтогенетика высших растений" (Кишинев, 1989), на конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), на Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к стрессам" (Иркутск, 1991), на Третьем съезде ВОФР (Санкт-Петербург, 1993), на 9-ом конгрессе FESPP (Брно, 1994), на конференции "Физико-химические основы растительной физиологии" (Пуцино, 1996), на 9-ой Европейской биоэнергетической конференции (Бельгия, 1996), на научных сессиях СИФЙБР СО РАН (Иркутск, 1994, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 401 странице машинописного текста, содержит 58 рисунков, 26 таблиц; состоит из введения, обзора литературы (5 глав), методической части, экспериментальной части (3 главы), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 453 наименования, из них 170 - на русском языке.
