Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Регуляторные механизмы клеточного цикла 11
2.2. Митотическое деление клеток животных и растений 14
2.3. Ядрышко - основной структурный домен клеточного ядра 16
2.3.1. Ультраструктура ядрышка 16
2.3.2. Биогенез рибосом 18
2.3.3. Основные белки клеток животных и растений, участвующие в созревании рРНК 21
2.3.4.. Аргеношильные белки ядрышка 26
2.4. Ядрышко во время митоза 26
2.4.1. Распад ядрышка в профазе/прометафазе 26
2.4.2. Сборка ядрышка в конце митоза 27
2.4.3. Регуляторные механизмы реорганизации ядрышка в митозе 28
2.5. Процесс формирования активного ядрышка в конце митоза 29
2.5.1. Восстановление транскрипции рДНК в поздней анафазе/ранней телофазе 29
2.5.2. Периферический хромосомный материал (ПХМ) 31
2.5.3. Проядрышки (prenucleolar bodies, PNBs) 33
2.5.3.1. Ранние исследования 33
2.5.3.2. Состав проядрышек 33
2.5.3.3. Динамика проядрышек в конце митоза 34
2.5.4. Цитоплазматические ядрышковые дериваты, ЦЯД (nucleolus derived foci, NDF) 36
2.5.4.1. Состав ЦЯД 36
2.5.4.2 Частично-процессированная пре-рРНК в ЦЯД 37
2.5.4.3. Динамика ЦЯД и проядрышек 38
2.5.5. Модель постмитотической сборки ядрышка (нуклеологенеза) у высших эукариот 39
3. Материалы и методы 42
3.1. Объекты исследования 42
3.2. Антитела и сыворотки 42
3.2.1. Первые антитела 42
3.2.2. Вторые антитела 43
3.2.3. ДНК-конструкты 43
3.3. Иммунофлуоресцентный анализ 44
3.4. Обработка клеток 46
3.5. Синхронизация клеток животных и растений в митозе 46
3.6. Обратимое воздействие гипотонического шока 47
3.7. Обработка клеток РНКазой А 48
3.8. Окрашивание ядрышек растительных клеток нитратом серебра (модифицированный метод, Fernandez-Gomez et al., 1969) 48
3.9. Флуоресцентная РНК-РНК гибридизация in situ
3.9.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК
3.9.2. Выделение плазмидной ДНК 50
3.9.3. Мечение проб методом транскрипции in vitro 50
3.9.4. Проверка эффективности мечения проб с помощью дот-блота 50
3.9.5. Проведение флуоресцентной РНК-РНК гибридизации in situ 51
3.10. Проточная цитометрия 52
3.11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 53
3.12. Иммуноблотинг 53
3.13. Приложение к Материалам и методам 54
4. Результаты 55
4.1. Динамика и свойства ЦЯД в нормальных митотических клетках животных и растений 55
4.1.1. Закономерности образования, размер, число/клетку, расположение ЦЯД в цитоплазме 55
4.1.2. Ко-локализация ЦЯД с астральньши микротрубочками веретена деления в клетках животных 57
4.1.3. Состав индивидуальных ЦЯД: белки и частично-процессированная пре-рРНК 58
4.1.4. Влияние актиномицина Д и ДРБ на формирование ЦЯД в митотических клетках 60
4.2. Индукция преждевременной сборки ЦЯД в метафазных клетках животных и растений 62
4.2.1. Индукция образования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих под действием обратимого гипотонического воздействия 62
4.2.2. Индукция формирования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих и растений под действием ингибиторов киназы Cdkl росковитина или стауроспорина 65
4.2.3. Влияние ингибиторов киназы Cdkl на электрофоретическую подвижность белков В23/нуклеофозмина, С23/нуклеолина и фибрилларина 67
4.3. Преждевременное вхождение в анафазу клеток, обработанных росковитином. 68
5. Обсуждение 71
5.1. ЦЯД — универсальные структуры, формирующиеся в клетках животных и растений 71
5.2. Роль рРНК в образовании ЦЯД 75
53. Возможные способы преждевременной индукции ЦЯД и механизмы образования ЦЯД в митозе 76
6. Выводы 83
7. Список работ, опубликованных по теме диссертации 84
8. Список литературы 85
- Основные белки клеток животных и растений, участвующие в созревании рРНК
- Модель постмитотической сборки ядрышка (нуклеологенеза) у высших эукариот
- Окрашивание ядрышек растительных клеток нитратом серебра (модифицированный метод, Fernandez-Gomez et al., 1969)
- Индукция образования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих под действием обратимого гипотонического воздействия
Введение к работе
Хорошо известно, что основные функции наиболее крупного структурного домена клеточного ядра - ядрышка - такие, как транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг 47-45 S транскриптов рРНК и сборка рибосомных частиц, осуществляются, главным образом, на стадии интерфазы, когда ядрышко сохраняет структурную целостность (Olson et al., 2002). При вступлении растительных и животных клеток в митоз транскрипция рДНК постепенно прекращается, а значительная часть ядрьппковых белков и РНК мигрируют в цитоплазму и (или) ассоциируют с поверхностью хромосом, образуя так называемый периферический хромосомный материал (ПХМ) (Ченцов, 2000; DiMario, 2004; Leung et al., 2004). В результате этих изменений ядрышко постепенно деструктурируется и к метафазе митоза, как правило, полностью распадается. Из основных молекулярных компонентов ядрышка в связи с ядрышкообразующими районами хромосом (ЯОР) сохраняются лишь компоненты транскрипционного комплекса РНК полимеразы I, включая ее специфический ко-фактор белок UBF (Zatsepina et al., 1993, 1996; Roussel et al., 1996; Chen et al., 2005). Восстановление ядрышка начинается в поздней анафазе или ранней телофазе с реактивации транскрипции рДНК (МогсШо et al., 1976; Roussel et al., 1996; Frompoix et al., 1998; Dousset et al., 2000; Мухарьямова, Зацепина, 2001; Hernandez-Verdun et al., 2002; Leung et al., 2004) и появления многочисленных дискретных структур, материал которых может использоваться для построения дочерних ядрышек. На сегодняшний день известны два типа таких структур, которые получили название митотических производных ядрышка: цитоплазматические ядрышковые дериваты, ЦЯД (nucleolus derived foci, NDF), которые образуются в цитоплазме анафазных клеток (Beven et al., 1996; Zatsepina et al., 1997a; Dundr et al., 1997; Olson, Dundr, 2005), и проядрышки (prenucleolar bodies, PNBs), формирующиеся в дочерних ядрах в телофазе (Olson et al., 2002; Hernandez-Verdun et al., 2002; Dimario, 2004; Olson, Dundr, 2005; Hernandez-Verdun, 2006). Однако, несмотря на принципиальные различия в локализации и времени формирования, ЦЯД и проядрышки содержат практически одни и те же ядрышковые белки, мякРНК, пре-рРНК, а также имеют сходную фибро-гранулярную ультраструктуру (Dundr et al., 1997, 2000; Dundr, Olson, 1998). Эти данные свидетельствуют в пользу определенного «родства» между ЦЯД и проядрышками.
В последние годы на основании анализа поведения белков в живых клетках установлено, что митотические производные ядрышка являются высоко динамичными структурами. Так, показано, что проядрышки способны сливаться друг с другом и с новоформирующимися ядрышками (Dundr et al., 2000, Savino et al., 1999, 2001; Angelier et al., 2005), а материал ЦЯД мигрирует в дочерние ядра (Dundr et al., 2000). На основании полученных данных, авторами предложена гипотеза постмитотической сборки ядрышка в клетках эукариот, согласно которой материал ЦЯД и проядрышек используется для построения формирующегося ядрышка, а порядок миграции индивидуальных белков в ядрышки отражает этап биогенеза рибосом, в котором этот белок участвует.
Однако имеющийся на сегодняшний день экспериментальный материал не дает возможности однозначно раскрыть проблему формирования ядрышка в конце митоза. В частности, остаются неизвестными механизмы регуляции сборки производных ядрышка в митозе, а также функции, выполняемые этими митотическими образованиями. До конца не выяснена роль различных составляющих производных ядрышка в поддержании их структурной и функциональной целостности. Практически ничего не известно о механизмах, обеспечивающих транспорт материала ядрышковых дериватов в дочерние ядра и ядрышки.
Одним из подходов к изучению механизмов формирования производных ядрышка в митозе является разработка условий для индукции их сборки на тех стадиях митоза, когда в нормальном митозе они отсутствуют. Ранее показано, что эффективным индуктором образования проядрышек в ядрах интерфазных клеток различных культур млекопитающих является обратимое воздействие растворов низкой ионной силы на живые клетки (Zatsepina et al., 1997b,c). Однако вопрос о том, происходит ли в этих условиях формирование ЦЯД, до начала выполнения настоящей работы оставался открытым.
Известно, что важную роль в реорганизации ядрышка в митозе играет уровень фосфорилирования его белков, таких как транскрипционные факторы рДНК (Klein, Grummt, 1999; Sirri et al., 2002) и белки ядрышка В23/нуклеофозмин и С23/нуклеолин, участвующие в созревании транскриптов пре-рРНК (Belenguer et al., 1990; Peter et al., 1990; Jiang et al., 1999, 2000; Okuwaki et al., 2002). Киназой, осуществляющей дополнительное фосфорилирование этих белков в митозе у высших эукариот, является основная митотическая киназа Cdkl, которая проявляет активность в комплексе с циклинами А и В (Епифанова, 2003). По мере завершения митоза происходит деградация циклинов А и В под действием убиквитин-зависимых протеолитических ферментов сложного белкового комплекса АРС/С (anaphase-promoting complex/cyclosome ubiquitin Hgase), стимулирующего анафазу. Каскад этих реакций приводит к инактивации комплексов Cdkl-циклин. В то же время в анафазе происходит образование ЦЯД. Можно предположить, что два этих процесса взаимосвязаны и инактивация Cdkl является индуктором сборки ЦЯД. Известно, что в метафазе белки В23/нуклеофозмин, С23/нуклеолин и фибрилларин образуют растворимые макромолекулярные комплексы, в стабилизации которых, по-видимому, принимает участие (р)РНК (Pifiol-Roma, 1999). Есть основания полагать, что в метафазе эти комплексы находятся в растворимом состоянии, поскольку экстракция метафазных клеток буфером, содержащим детергент, препятствует иммуномечению цитоплазмы на В23 и другие белки. Напротив, телофазные ЦЯД оказываются устойчивыми к экстракции (Zatsepina и др., 1997а). Однако практически не решенным остается вопрос о том, какую роль играет митотическое фосфорилирование/дефосфорилирование и, следовательно, изменение свойств ядрышковых белков в сборке цитоплазматических производных ядрышка. Основная цель работы - исследование динамики, состава и возможных механизмов формирования цитоплазматических производных ядрышка в разных типах культур клеток млекопитающих, а также в клетках корневой меристемы лука Allium сера
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ закономерностей формирования и состава индивидуальных ЦЯД (рРНК, белки зрелого ядрышка фибрилларин, С23/нуклеолин, В23/нуклеофозмин, Nop52, UBF) на завершающих стадиях нормального митоза.
2. Исследовать влияние ингибирования синтеза и процессинга рРНК на сборку ЦЯД в митотических клетках млекопитающих.
3. Исследовать возможность индукции преждевременной сборки цитоплазматических дериватов ядрышка в митозе в клетках млекопитающих в условиях обратимого воздействия растворов низкой ионной силы (гипотонического шока), который
Ji- индуцирует появление проядрышек в ядрах интерфазных клеток (Zatsepina et ah, 1997б,с).
4. Изучить возможность индукции преждевременной сборки ЦЯД в митозе в клетках млекопитающих и растений под действием специфического (росковитин) и менее специфического (стауроспорин) ингибиторов активности митотической циклин В-зависимой киназы Cdkl.
5. Изучить влияние ингибиторов митотической Cdkl на электрофоретическую подвижность основных белков ядрышка - фибрилларина, С23/нуклеолина, В23/нуклеофозмина.
Основные белки клеток животных и растений, участвующие в созревании рРНК
Деление клетки играет ключевую роль в росте и развитии организмов. В настоящее время клеточный цикл обозначается как интервал между завершением митоза в исходной клетке и завершением митоза в ее дочерней клетке (Епифанова, 2003). Время, необходимое для прохождения одного клеточного цикла получило название времени генерации. Временные параметры этого процесса впервые были изучены в 50-е годы п.с, Говард и Пелком (1953). Они предложили разбить митотический цикл на четыре периода, или фазы: собственно деление клетки (митоз), пресинтетический период Gi (от англ, gap интервал), период синтеза ДНК (S) и премитотический период G2. Клеточный цикл представляет собой однонаправленный процесс, где клетка последовательно проходит разные его периоды, без их пропуска или возврата к предыдущим стадиям. Позднее было установлено, что по окончании митоза клетка может выйти в состояние «вне цикла», из которого при необходимости она вновь может вступить в клеточный цикл. Это состояние было обозначено Квастлером и Лайтой (1963) как период, или фаза Go. Соматические клеточные циклы в многоклеточном организме характеризуются наличием хорошо выраженных периодов Gi и G2, более продолжительного периода S, а также зависимостью прохождения клеточного цикла от митогенных стимуляторов (факторов роста). Однако только в начале 90-х годов п.с. произошел подлинный прорыв знаний в изучении регуляторных механизмов размножения клеток. Генетические, биохимические и молекулярные исследования клеток дрожжей и животных привели к заключению, что нормальные условия деления клетки зависят от правильной координации клеточного цикла, обусловленной регуляцией трех переходов, названных «checkpoints» (Murray А., 1994): вступления в митоз, выхода из митоза и прохождения через пункт ограничения (R пункт, restriction point) в периоде Gi. Было показано, что каждый из этих переходов протекает с участием одного и того же белка — протеинкиназы р34 (фосфолипида с молекулярной массой 34 кДа) или его близких гомологов. Этот белок был первоначально идентифицирован как продукт активности гена cdc2 у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces ротЪе. Гены cdc (cell division cycle genes) были открыты и изучены еще в 70-х годах п.с. Позднее было показано, что при вступлении клетки в митоз происходит взаимодействие р34й/й2и митотических циклинов (Hunt, 1991). Протеинкиназа р34" одновременно представляет собой каталитическую субъединицу MPF (maturation promoting factor или mitosis promoting factor), в присутствии которого клетки переходят из периода синтеза ДНК в митоз. Другая субъединица MPF, получившая название «циклин» представляет собой группу регуляторных белков с молекулярной массой около 60 кДа, аккумулирующихся в клетке на протяжении интерфазы и деградирующих в митозе. Молекула р34сЛ2 инертна на всем протяжении клеточного цикла, в начале цикла она мономерна и нефосфолирирована. Но постепенно фосфорилируется в периодах S и G Перед началом митоза происходит физическое взаимодействие p34cdc2 с циклинами А и В, которое вызывает конформационное изменение молекулы и способствует ее дальнейшему фосфорилированию, главным образом по остаткам тирозина и треонина. Такой комплекс представляет собой неактивную (латентную) форму MPF (npe-MPF), для активации которой и вступления клетки в митоз требуется дефосфорилирование р34с&2 по 15-му остатку тирозина и 14-му остатку треонина. Для завершения митоза необходима деградация циклинов А и В под влиянием сложного белкового комплекса АРС/С (anaphase-promoting complex/cyclosome ubiquitin Hgase), стимулирующего анафазу (Castro et al., 2005). Гомологи белка. p34cdc2 у высших эукариот стали обозначать символом Cdk (cyclin dependent kinase) или циклин-зависимая киназа (Pines, 1995; Morgan, 1997; Vermeulen et al., 2003). Оказалось, что комплексы Cdkl-митотическиЙ циклин - это только конечный этап регуляции клеточного цикла, которая осуществляется путем формирования, активации и последующей инактивации последовательно сменяющих друг друга комплексов циклин-зависимых киназ с циклинами. На сегодняшний день известно несколько типов циклинов (А-Е), взаимодействующих с несколькими циклин-зависимыми киназами (Табл. 1).
В активной форме комплексы Cdk-циклин фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие протекание данной фазы. Было показано, что ключевые регуляторы прохождения клеточного цикла высоко консервативны в клетках животных и растений (Dewitte, Murray J.A.H., 2003; De Veylder et al., 2003; Inze, 2005). Регуляция активности Cdk осуществляется активаторами (циклины, комплекс Cdk7-qHKJiHH Н, Cdc25 фосфатазы, САК (Cdk-activating kinase)) и ингибиторами (CKIs, Cdk inhibitors). Помимо естественных ингибиторов Cdk-киназ были описаны химические ингибиторы (Knockaert et al, 2002; Fischer et al., 2003), к которым относятся стауроспорин (O Brian, Ward, 1990; Gouillex et al., 1994) и росковитин (Meijer et al., 1997; Meijer, Raymond, 2003).
Митоз - универсальный и наиболее распространенный способ репродукции животных и растительных клеток. Его особенность заключается в сочетании двух процессов - редупликации генетического материала и его равномерного распределения между дочерними клетками. Деление всех эукариотических клеток связано с конденсацией удвоенных хромосом и образованием специального аппарата клеточного деления, состоящего из хромосом с их кинетохорами, полярных телец (центросомы) и волокон веретена (Чепцов, 2004). У клеток, вступивших в цикл деления, фаза собственно митоза занимает относительно короткое время, всего около 0.1 времени клеточного цикла. Так, у делящихся клеток меристемы корней интерфаза может составлять 16-30 ч, а митоз занимать всего 1-3 ч. Цикл эпителиальных клеток кишечника мыши длится около 20-22 ч, на митоз же приходится всего 1 ч. Процесс митотического деления клеток принято подразделять на несколько основных фаз: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, телофаза, однако границы между этими фазами установить достаточно трудно. Профаза сопровождается конденсацией реплицированных хромосом, причем к концу профазы связь между сестринскими хроматидами остается только в зоне кинетохоров - структур, связывающих впоследствии микротрубочки веретена деления с хромосомой. Деструктурируется ядрышко, ядерная оболочка фрагментируется на мелкие вакуоли, а поровые комплексы исчезают, также происходит распад на мелкие вакуоли эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. В профазе клеток животных происходит разборка микротрубочек в цитоплазме и активирование цетросом, содержащих центриоли: каждая пара центриолей становится центром формирования радиально направленных астральных микротрубочек. Пары центриолей расходятся, образуя два полюса деления клетки. Веретено, образующееся в клетках животных, принадлежит к так называемому астральному типу.
Модель постмитотической сборки ядрышка (нуклеологенеза) у высших эукариот
Периферический хромосомный материал (ПХМ), ранее называемый «матриксом» митотических хромосом, был впервые описан в 70-е годы п.с. методами электронной микроскопии (Ченцов, 2000, 2004). Изучение ультраструктуры митотических хромосом в клетках растений и животных показало, что на поверхности хромосом часто присутствует нехроматиновый компонент, который состоит из рыхло расположенных фибрилл (4-8 нм) и гранул (15-20 нм), имеющих рибонуклеопротеидную природу. Морфологически этот материал соответствует компонентам, входящим в состав интерфазных ядрышек (Поляков, Ченцов, 1968; Ченцов, Поляков, 1969, 1974; Моупе, Garrido, 1976; Gautier et al., 1992b,c; Бураков и др., 1994). На основании этих наблюдений был сделан вывод о том, что «матрикс» хромосом (перихромосомный материал) содержит компоненты материнского ядрышка, которые транспортируются хромосомами в дочерние клетки. Позднее скопления белков и рРНК на поверхности ПХМ были выявлены с помощью реакции серебрения, использования специфических антител к белкам ядрышка или меченых проб к нуклеиновым кислотам, а также путем анализа поведения белков в живых клетках (Stokert et al., 1970; Paweletz, Risueno, 1982; Hernandez-Verdun, Gautier, 1994; Лазарева и др., 1997a; DiMario, 2004; Табл. 2). В совокупности, эти работы подтвердили, что на поверхности хромосом присутствуют белки, связанные с процессиигом пре-рРНК, пре-рРНП и малые ядрышковые РНП. Кроме того, в состав ПХМ могут входить некоторые иегистоновые белки из состава ядерного матрикса и неядрышковые белки, такие как перихромонуклеолип (perichromonucleolin, PCN), фосфорилироваїшая форма нуклеоплазмина, белки ядерной оболочки и другие.
Известны попытки выяснить состав перихромосомного материала методами биохимического анализа РНК в выделенных хромосомах (Abramova, Neyfakh, 1973; Fan, Penman, 1971). Авторы этих работ одними из первых указали на то, что метафазные хромосомы (вероятно, перихромосомный материал) связаны с непроцессированной 45 S и 32 S рРНК. Интересно, что выход клеток из митотического блока сопровождался резким истощением пула 45 S и 32 S рРНК, что свидельствует о начале активного процессинга или деградации незрелой рРНК в пост-метафазе (Fan, Penman, 1971).
Вопрос о том, что направляет и удерживает белки ядрышка па поверхности хромосом, остается открытым. Есть основания полагать, однако, что взаимодействия, поддерживающие ядрышковые антигены в ПХМ иные, чем взаимодействия, связывающие те же антигены в интерфазном ядрышке. Так, ПХМ оказывается устойчивым к обработке изолированных хромосом гипотоническими растворами в условиях, разрушающих интерфазные ядрышки (Gautier et al., 1992b).
Закономерности появления на поверхности хромосом ПХМ, содержащего ферменты и факторы ядрышковой транскрипции и сборки рибосом, говорят о том, что переносимые хромосомами белки и РНК не являются их случайными «пассажирами». Это позволяет сделать вывод о том, что митотические хромосомы переносят в дочерние ядра не только генетическую информацию ДНК, но и необходимые компоненты синтетического аппарата, готового к активации транскрипции в новом клеточном цикле. ПХМ может, кроме того, участвовать в поддержании структурной целостности хромосом и служить для эквивалентного разделения ядрышковых и других компонентов клеток в митозе (Eamshaw, Bemat, 1991; Hernandez-Verdun, Gautier, 1994; Medina et al., 1995; Чепцов, 2000,2004). доклад о ранних исследованиях пренуклеопярного материала (проядрышек) в митозе. Согласно ему, прснуклеолярные тельца в телофазных клетках были впервые описаны исследователем Ван Кампом (Van Camp) в 1924 году п.с. Позднее ультраструктурные исследования пренуклеолярных телец выполнены на Allium сера L. (лук) и Viciafaba L. (бобы) (Lafontaine, 1958; Lafontaine, Chouinard, 1963). Стивене обнаружил эти структуры в нейробластах эмбрионов Chortopphaga viridifasciala (саранча) и одним из первых попытался показать приемственпость между проядрышками и перихромосомным материалом (Stevens, 1965). Согласно его данным, формирование проядрышек начинается с появления на поверхности анафазных хромосом сначала мелких (0.2-0.3 мкм в диаметре), а потом крупных телец (0.3-0.7 мкм в диаметре), которые по морфологии соответствовали «свободным» проядрышкам в ядрах телофазных клеток. Разными авторами показано, что проядрышки состоят из плотно упакованных гранул и фибрилл РНП, которые по своим размерам соответствуют гранулам и фибриллам интерфазного ядрышка и перихромосомного материала (Stevens, 1965; Ченцов, Поляков, 1969, 1974; Morcillo, De la Torre, 1980). Состав проядрышек. В Табл. 2 приведены основные молекулярные компоненты, выявленные в проядрышках современными методами клеточной и молекулярной биологии. Например, в проядрышках клеток человека HeLa (Jimenez-Garcia et al., 1994), китайского хомячка СНО (Azum-Gelade et al., 1994) и клеток растений (Beven et al., 1996) присутствует U3, US и U14 мякРНП, частично-процессированная пре-рРНКи белки зрелого ядрышка, участвующие в процессинге рРНК, включая фибрилларин, В23, нуклеолин и Nop52. Для того, чтобы установить роль каждого из компонентов проядрышек в их формировании, Белл с соавторами добавляли лишенные мембраны ядра спермиев Xenopus laevis к активным цитоплазматическим яйцевым экстрактам ооцитов шпорцевой лягушки (Bell ct al., 1997). Полученные наблюдения показали, что существенную роль в формировании проядрышек in vitro, по-видиому, играет фибрилларип, поскольку истощение экстрактов антителами именно к этому белку уменьшало число сформировавшихся проядрышек.
Неоднократно поднимался вопрос о соответствии проядрышек тельцам Кахала (coiled bodies, CBs). Тельца Кахала были впервые описаны Рамон и Кахалем (1903) как дополнительные тельца к ядрышкам. Помимо коилина, они содержат Ag-белки, ядрышковые белки фибрилларип, В23 и Noppl40, а также U3 и U8 мякРНК. Состав телец Кахала свидетельствует в пользу их участия в процессинге пре-рРНК (Gall, 2003). Однако присутствие в тельцах Кахала РНК полимеразы I и ДНК топоизомеразы I, которые никогда не выявляются в проядрышках, а также различия в ультраструктуре между проядрышками и тельцами Кахала (Bell, Scheer, 1996), говорят против существования прямой аналогии между этими структурами.
Окрашивание ядрышек растительных клеток нитратом серебра (модифицированный метод, Fernandez-Gomez et al., 1969)
Состав ЦЯД. Дундр с соавторами впервые предложили термин nucleolus derived foci (NDF) для описания цитоплазматических телец, возникающих в митотических клетках мартышки СМТЗ, стабильно трансфицированных плазмидой, экспрессирующей белок HIV Rev (Dundr et al., 1996), Помимо HIV Rev, в ЦЯД авторы обнаружили также белки зрелого ядрышка фибрилларин, В23, нуклеолин и Nop52. В клетках СМТЗ ЦЯД довольно многочисленны в течение анафазы (обычно 25-50 телец на клетку, некоторые клетки могут содержать более 100 телец). ЦЯД распространяются в цитоплазме, но отсутствуют в зоне веретена деления. ЦЯД не являются следствием экспрессии конструкции, кодирующей Rev, поскольку они выявлялись также в нетрансфицированных клетках COS-7 и HeLa (см. дальше). Исследователи предположили, что ЦЯД могут представлять собой аналоги описанных раннее цитоплазматических «остатков ядрышка» (nucleolar remnants, NPs), которые впервые упоминаются в работах Hsu et al., 1965 и Noel et al., 1971. Более поздними исследованиями установлено, что такие ядрышковые остатки содержат белки интефазного ядрышка фибрилларин, нуклеолин, В23 и U3 мякРНК (Azum-Gelade et al., 1994; Gautier et al., 1994; Zatsepina et al. 1997a). В этих работах образование цитоплазматических ядрышковых остатков наблюдали на клетках культур китайского хомячка СНО или свиньи СПЭВ - активно пролиферирующих клетках с большими интерфазными ядрышками. Митотические ядрышковые остатки выявляются в этих клетках в небольшом количестве, но имеют большой размер (до 2 мкм). В клетках растений ядрышковые остатки, содержащие аргентофильные белки, были обнаружены в цитоплазме анафазных и телофазпых клеток корневой меристемы лука Allium сера L. (Fernandez-Gomez et al., 1983). Короткоживущие цитоплазматические анафазные тельца, содержащие фибрилларин, частично-процессированную пре-рРНК, U3 и Ш4 мякРНК были описаны в клетках корневой меристемы гороха Pisum sativum L. (Beven et al., 1996). Следует помнить, что некоторые авторы называли термином «nucleolar remnants» ядрышковый материал, оставшийся после разборки ядрышка в профазе и выявляемый в начале метафазы (Morcillo et al., 1976; Medina et al., 1995).
В целом, на сегодняшний момент установлено, что ЦЯД состоят из частиц РНП, которые содержат некоторые нерибосомальные компоненты ядрышка (Табл. 2). Показано, что в состав ЦЯД входят белки раннего и позднего процессинга рРНК фибрилларин, С23/нуклеолин, В23/нуклеофозмин и р52 (Nop52) (Ochs, Busch, 1984; Ochs et al., 1985a,b; Beven et al, 1996; Zatsepina et al., 1997a; Dundr et al., 1996, 1997, 2000; Dundr, Olson, 1998; Мухарьямова и др., 1998). U3 и U8 мякРНК также представлены в В23-содержащих ЦЯД (Beven et al., 1996; Dundr et al., 1997; Dundr, Olson, 1998). Таким образом, молекуляный состав ПХМ, проядрышек и ЦЯД оказывается практически одинаковым.
Частично-процессированная пре-рРНК в ЦЯД. Дундр и Ольсон с помощью метода флуоресцентной РНК-РНК гибридизации in situ и Nothern blot-анализа показали наличие частично-процессированной пре-рРНК в ЦЯД (Dundr, Olson, 1998). Специфические биотип-меченые РНК-пробы к коровой части 5 -внешнего транскрибируемого спейсера пре-рРНК (5 ETS core part), 18 S pPHK, последовательностям первого внутреннего транскрибируемого спейсера пре-рРНК (ITSI), концу 28S рРНК и 3 внешнему транскрибируемому спейсеру пре-рРНК (3 ETS) метили ЦЯД в анафазных клетках СМТЗ. Ни одна из рибопроб не окрашивает ЯОР хромосом вплоть до начала реактивации транскрипции рДНК в телофазе, демонстрируя тем самым, что первичные транскрипты рРНК отщепляются от матрицы «молчащей» рДНК в начале митоза. Динамика ЦЯД и проядрышек. В работе по исследованию динамики мутантных белков GFP-B23, GFP-фибрилларина и GFP-нуклеолина в трансфицированных клетках СМТЗ с использованием цейтраферной микроскопии Дундр с соавторами описали беспорядочные перемещения ЦЯД в цитоплазме (1.8-15 мкм/мип) в течение телофазы и в редких случаях слияния между ними (Dundr et al., 2000). Поскольку число ЦЯД в клетках с течением телофазы уменьшается, а интенсивность флуоресценции маркерных белков с внутренней стороны ядерной облочки при этом возрастает, был сделан вывод о том, что материал проядрышек может мигрировать внутрь ядра. На основании этих наблюдений была предложена следующая схема поведения ЦЯД в митозе: при разборке ЦЯД их компоненты входят в ядро, затем мигрируют в проядрышки, которые, в свою очередь, переносят материал ЦЯД в зону формирующихся ядрышек. В пользу этой схемы свидетельствуют сходство молекулярного состава и ультраструктурной организации ЦЯД и проядрышек. ЦЯД и проядрышки содержат одни и те же ядрышковые компоненты (белки, мякРНК, пре-рРНК, Табл. 2) и образованы фибриллярно-гранулярным материалом (Dundr et al., 1997, 2000; Dundr, Olson, 1998). Однако между цитоплазматическими и ядерными производными ядрышка существуют некоторые различия. Во-первых, ЦЯД более лабильны, чем проядрышки и могут совершать свободные движения на большие расстояния. Во-вторых, проядрышки более мелкие и однородные по размерам образования (0.3-0.7 мкм), в то время как размеры ЦЯД варьируют в диаметре от 0.3 до 2-3 мкм. В-третьих, проядрышки отличаются от ЦЯД по содержанию некоторых типов рРНК. Так, в телофазе В23-содержащие проядрышки выявляются пробами к 28 S рРНК, но не метятся пробами к 5 ВшТС-коровой части пре-рРНК и 18 S рРНК. В-четвертых, время существования маркерного белка раннего процессинга - фибрилларина - в ЦЯД оказывается более продолжительным, чем в проядрышках. Это приводит к тому, что в клетках раннего Gi-периода, содержащих ЦЯД, фибрилларии-положительные проядрышки не выявляются (Dundr at al., 2000; Olson, Dundr, 2005). Модель постмитотической сборки ядрышка (нуклеологенсза) у высших эукариот. Имеющийся на сегодняшний день экспериментальный материал не дает возможности полностью раскрыть проблему реорганизации ядрышка в митозе. Наиболее полная модель динамических изменений ядрышка при делении клеток предложена Дупдром с соавторами (2000). Согласно этой модели, транскрипция рДНК останавливается в профазе. Транскрипты пре-рРНК, которые были синтезированы в начале митоза и (или) в предыдущей интерфазе, но не успели завершить процесс созревания, при разрушения ядрышка мигрируют в нуклеоплазму. При этом частично процессированные пре-рРНК сохраняют связь с процессинговыми компонентами ядрышка (белками и мякРНК) и формируют периферический хромосомный материал (ПХМ) в метафазе. В анафазе некоторое количество этого материала остается в ПХМ, в то время как другая часть формирует ЦЯД. Когда в телофазе хромосомы начинают деконденсироваться, а вокруг них формируется ядерная оболочка, материал перемещается от ЦЯД в нуклеоплазму, где их материал включается в состав проядрышек.
Индукция образования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих под действием обратимого гипотонического воздействия
Трансформация клеток Е. coti плазмидпой ДНК. Для трансформации брали компетентные клетки Е, coli штамма JM 109, хранящиеся при минус 70 "С, оттаивали при комнатной температуре, переносили на лед и смешивали с 5 мкл плазмидной ДНК (плазмиды предварительно разводили в бидистиллированной воде до конечной концентрации 1 иг/мл). Полученную смесь инкубировали на льду в течение 30 мин, затем 1 мин при 42 С на водяной бане и снова на льду в течение 2 мин. Стерильно добавляли 800 мкл среды LB (10 г бакто-триптона (Difco), 5 г дрожжевого экстракта (Difco) и 10 г NaCl на 1 л бидистиллированной воды, рН 7,0) и доращивали клетки 30 мин при 37 С на качалке (150 об/мин). Затем разводили бактериальную культуру в 100 раз и растирали шпателем 200 мкл трансформированного клона по дну предварительно нагретой до 37 С чашки Петри (диаметром 10 см) с 20 мл 3 %-го агара (Merk) на среде LB с антибиотиком ампициллином в конечной концентрации 50 мг/мл, оставляли на ночь при 37 С. На следующий день одиночную колонию бактерий снимали стерильной петлей, переносили в пробирку в 5 мл среды LB и инкубировали при 37 С и на качалке 250 об/мин в течение ночи. Ночную культуру переливали в чистые пластиковые пробирки (Falcon 2070) и собирали клетки центрифугированием при 3000 об/мин и 4 С в течение 10 мин. Для очистки ллазмидной ДНК использовали наборы реактивов Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System. Выделение проводили по стандартной методике, рекомендованной производителем. После выделения концентрацию плазмид измеряли на спектрофотометре.
Пробы метили биотипом (Biotin-16-UTP, Roche) методом транскрипции in vitro с использованием РНК-полимераз фагов Е. coli Sp6 и Т7 (SP6/T7 transcription Kit, Roche), по стандартной методике, рекомендованной производителем.
На смоченную в двухкратном буфере 2xSSC (стандартный солевой раствор, 0.3 М NaCl, 0.03 М цитрат натрия, рН 7.3) нейлоновую мембрану наносили пробы (разведенные в бидистиллированной воде в 10 и 50 раз), фиксировали пробы на мембране 1 час при 80 С, блокировали в буфере ТСБ (Трис-солевой буфер, 0.15 М NaCl, 0.05 М Трис-НСІ, рН 7.5 с 0.05 %-ным сухим обезжиренным молоком) на качалке 30 минут при комнатной температуре. Отмывали мембраны в ТСБ (3x10 мин), инкубировали с 5 мкл стрептавидина, конъюгированного со щелочной фосфатазой (Roche) в 10 мл буфера ТСБ, в течение 45 мин на качалке при комнатной температуре. Затем мембраны отмывали ТСБ (3x10 мин) при комнатной температуре на качалке и инкубировали в растворе для детекции, содержащем 200 мкл NBT/BCIP Stock Solution (Roche) на 10 мл буфера БЗ (0.1 М Трис-НС1, 0.1 М NaCl, 0.05 М MgCb, рН 9.5) в темноте на качалке до появления сигнала черного цвета. Отмывали мембрану дистиллированной водой, фиксировали 70 этанолом и высушивали. 3.9.5. Проведение флуоресцентной РНК-РНК гибридизации in situ.
РНК-пробы гибридюировали in situ с препаратами клеток CVI по методике, предложенной Дундром н Ольсопом (Dundr, Olson, 1998). При необходимости до фиксации клеток в культуральную среду добавляли росковитин или стауроспорин на 15-30 мин. Поскольку росковитин вызывает цитотомию, перед его добавлением клетки инкубировали с 50 нг/мл нокодазола в течение 1.5-3.5 ч. Клетки промвывали в ФСБ и фиксировали 4 %-ным параформальдегидом на ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. После фиксации препараты клеток промывали в ФСБ (3x5 мин) и пермеабилизировали 0.5 %-ным Тритоном Х-100 на ФСБ в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого препараты отмывали от детергента (3x5 мин) и обрабатывали 0.01 %-ным пепсином (Sigma) в течение 5 мин при комнатной температуре.
Пробы, денатурированные в присутствии деионизированного формамида (Sigma) 10 мин при 70 С, смешивали с 50 %-ным декстрансульфатом (Sigma) и lOxSSC, а затем гибридизовали полученную смесь с отмытыми в ФСБ после пепсина (3x5 мин) препаратами клеток в течение -16 ч при 42 С во влажной камере. Камеру создавали в чашках Петри диаметром 10 мл, используя фильтровальную бумагу, смоченную 4xSSC.
На следующий день препараты последовательно промывали 50 %-ным формамидом на буфере 2xSSC (3x10 мин) при 37 С, буфером 2xSSC (1x10 мий) при 37 С и при комнатной температуре. Гибридизациониый сигнал выявляли с помощью каскада антител к биотину, конъюгированных с родамином (Roche). Все отмывки проводили в буфере 4xSSC, содержащем 0.05 % Твина-20, 3 раза по 10 мин. Перед выявлением сигнала препараты инкубировали в блокирующем растворе на 4xSSC (Blocking Solution, Roche) (или в смеси 4xSSC, 0.05 % Твина-20 и 0.05 % сухого обезжиренного молока) в течение 30 мин при комнатной температуре и затем инкубировали с авидин-родамином (в концентрации 1:200 на блокирующем растворе), в течение 30 мин при комнатной температуре. После отмывки препараты инкубировали с антителами к авидину (1:200) в течение 30 мин при комнатной температуре, промывали и инкубировали второй раз с авидип-родами ном (1:200) в течение 30 мин при комнатной температуре. Препараты промывали и докрашивали мышиными моноклональными антителами к белку В23 (1:100) в течение 30 мин при 37 С, промывали и инкубировали с антителами к иммуноглобулинам мыши, меченными ФИТЦом.
Препараты промывали буфером ФСБ (3x10 мин) и окрашивали хроматин ядер и митотических хромосом красителем ДАПИ. После окраски стекла с клетками заключали в Мовиол. Препараты анализировали во флуоресцентный микроскоп Аксиоверт 200, как описано выше (раздел 3.3).
