Введение к работе
Актуальность темы: Хромосомы эукариотических клеток представляют собой сложную систему многоуровневой упаковки ДНК. Специфическая упаковка хроматина необходима для правильной сегрегации геномов в митозе и мейозе, а также для регуляции генной экспрессии в клеточном цикле. Принципы структурной организации высших уровней компактизации хроматина и молекулярные механизмы, лежащие в основе их формирования, на сегодняшний день изучены недостаточно.
В течение последних лет были описаны и частично охарактеризованы белки, которым приписывается решающая роль в специфической компактизации хроматина в митотических хромосомах. К таким белкам относят так называемые SMC белки (Stractural Maintenance of Chromosomes) (Strunnikov et al., 1993; Hirano and Mitchison, 1994). Показано, что они участвуют в митотической конденсации хромосом, когезии сестринских хроматид, рекомбинационной репарации ДНК, а также в процессах, связанных с компенсацией дозы гена (Hirano et al., 1994; Saka et al., 1994; Michaelis et al., 1997; Guacci et al., 1997; Jessberger et al., 1996, Chuang et al., 1994; Chuang et al., 1996).
В экстракте яиц Xenopus laevis были идентифицированы белки ХСАР-С и ХСАР-Е, принадлежащие к семейству SMC. Вместе с дополнительными субъединицами, белками ХСАР-Н, XCAP-G и pEg7 они образуют мультикомплексы - конденсины, выполняющие важную роль в митотической конденсации хромосом (Hirano et al., 1997; Kimura and Hirano, 1997, Cubizolles et al., 1998). Были выделены два комплекса конденсинов с коэффициентами седиментации 8S и 13S (Hirano et al., 1997; Kimura and Hirano, 1997; Losada et al., 1998). О возможном участии 13S конденсинового комплекса в компактизации митотических хромосом косвенно свидетельствует тот факт, что его связывание специфическими антителами вызывает нарушение конденсации хромосом в системе in vitro, а добавление приводит к восстановлению нормальной структуры хромосом (Hirano, 1998; Cubizolles et al., 1998). В других экспериментах показано, что отдельные компоненты 13S комплекса гиперфосфорилируются cdc2 киназой в начале митоза, и, следовательно, могут играть регуляторную роль в процессе конденсации хромосом (Hirano, 1998). Функциональное значение комплекса 8S остается неясным.
В настоящее время существует несколько гипотез о механизме действия конденсинов. Одна из них связана с формированием своеобразных структурных "скрепок", которые обеспечивают митотическую конденсацию хромосом и поддерживают специфическую организацию макромолекулярных комплексов хроматина в митозе (Strunnikov et al., 1993).
С.Петербург r-rty
оэ mp**4)Jf \
Недавно представители комплекса конденсинов были обнаружены в ядрышках интерфазных клеток HeLa (Cabello et al., 2001). Кроме того, субпопуляции конденсинового комплекса человека описаны в виде мелких точек в ядрах клеток HeLa (Schmiesing et al., 2000). По предположению Cabello et al (2001) в ядрышках конденсины связаны с околоядрышковым хроматином и участвуют в перестройках рибосомной ДНК. Эта гипотеза согласуется с данными, полученными методом иммунопреципитации, по которым у Saccharomyces cerevisiae конденсины ассоциированы с рибосомальной ДНК (Freeman et al., 2000).
В связи с вышеизложенным, цепью настоящей работы было исследовать локализацию двух субъедишщ 13S конденсинового комплекса, белков ХСАР-Е и pEg7, на разных стадиях клеточного цикла, изучить характер их взаимодействия с хромосомами при искусственном изменении степени компактизации митотических хромосом, а также исследовать связь конденсинов с ядрышком в зависимости от функционального состояния последнего.
В работе были поставлены следующие задачи:
Выяснить, как меняется экспрессия белков ХСАР-Е и pEg7 в клеточном цикле.
Исследовать локализацию ХСАР-Е и pEg7 в митотических хромосомах в норме и при искусственном изменении структурного состояния хромосом в живой клетке.
Изучить локализацию белков ХСАР-Е и pEg7 в интерфазе на светооптическом и ультраструктурном уровнях.
Изучить локализацию белка ХСАР-Е в ядрышке при ингибировании синтеза и процессинга рРНК.
Исследовать связь ХСАР-Е с ядерным матриксом.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: основные результаты были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2000), Всероссийском совещании "Клеточная биология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 2001), на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2002), а также на семинарах в НИИФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ и на кафедре цитологии, гистологии, клеточной биологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Научная новизна и практическое значение работы: Впервые детально проанализирована субдоменная локализация белка ХСАР-Е в ядрышке на светооптическом и ультраструктурном уровнях. Показано, что этот белок связан с гранулярным и плотным фибриллярным компонентами ядрышка. Ассоциация ХСАР-Е с гранулярным компонентом
не зависит от уровня транскрипционной активности и процессинга рРНК. Показано, что белок ХСАР-Е связан с остаточным ядрышком в препаратах ядерного матрикса и эта связь прямо или косвенно опосредована взаимодействием с РНК. Впервые показано, что при искусственном изменении структурного состояния хромосом в живых клетках восстановление структуры хромосом происходит без участия конденсинов. Показано, что блокирование хромосом в конденсированном состоянии in vivo под действием цитостатических агентов приводит к диссоциации конденсинов без нарушения структуры хромосом. Таким образом, впервые получены экспериментальные данные, позволяющие по-новому взглянуть на функции конденсинов в клеточном цикле.
