Содержание к диссертации
Введение 4
Обзор литературы 5
Организация интерфазного хроматина 5
Уровни компактизации хроматина в интерфазе и в митозе 5
Компартмеитализация хромосом в интерфазном ядре 9
Подвижность хроматина 10
Репликация ДНК- процесс, организованный в пространстве и во времени 11
Дискретность репликации 12
Локальные изменения структуры хроматина при взаимодействии с
репликационным комплексом 14
Топология, структура и свойства репликационных сайтов 17
Ультраструктура репликационных сайтов 21
Преждевременно-конденсированные хромосомы - «моментальный снимок» активных
репликационных единиц 26
Задачи работы 30
Материалы и Методы 31
Используемые сокращения 31
Культура клеток 31
Маркирование сайтов репликации и новореплицированной ДНК 31
Индукция преждевременной конденсации хроматина , 32
Получение хромосомных препаратов 32
Стандартная фиксация 33
Пермеабилизация клеток 34
Получение препаратов стабилизированного ядерного матрикса 35
Иммуноцитохимическое выявление БрдУ 35
Изучение препаратов и регистрация результатов 36
Электронно-микроскопические исследования 37
Выявление реплицированной ДНК на ультратонких срезах 38
Изучение и обработка электронно-микроскопических данных 39
Результаты 40
Характеристика клеточных моделей 40
Динамика репликагдионных сайтов в клетках линии СПЭВ, фиксированных in situ 41
Импульсное и «отложенное» мечение 42
Длительное мечение 44
PC в условиях структурной модификации хроматина 48
Роль гистонов и негистоновых белков в организации PC 50
Репликационные сайты в клетках линии L929. Импульсное и «отложенное» мечение. ..56 Оптимизация метода выявления репликационных сайтов иа ультраструктуриом уровне.
Ультраструктурная организация реплицирующегося хроматина (факультативного
гетерохроматина и эухроматина) в клетках линии L929 73
Структурная организация реплицирующегося конститутивного гетерохроматина
(хромоцентров) в клетках линии L929 74
Световая микроскопия 74
Электронная микроскопия 76
Организация реплицирующейся ДНК в дифференциально деконденсированном
хроматине 82
Упаковка хроматина, закончившего репликацию 85
Зоны репликации в преждевременно конденсированных хромосомах 88
Обсуждение результатов 98
Методические подходы к изучению ультраструктуры реплицируемого хроматина 98
Организация тотального хроматина 100
Реакция репликационных сайтов и реплицированиого хроматина на изменения ионных
условий 101
Различные конфигурации зон репликации ДНК 104
Локализация и коиформация хроматина, закончившего репликацию 107
Репликация хромоцентров ПО
Модель организации репликационного сайта и структурной организации
реплицируемого хроматина 115
Выводы 118
Список литературы 120
Список работ, опубликованных но теме диссертации 139
Благодарности 140
Введение к работе
Растущий объем сведений о биохимических механизмах, осуществляющих внутриклеточные процессы, делает все более актуальным вопросы об их регуляции и координации. Очевидно, что пространственное разграничение внутриклеточного объема, проявляющее в разбиении его на структурные и функциональные компартменты, является важнейшим механизмом, обеспечивающим правильное функционирование клетки на всех уровнях ее организации.
Ядро клетки - яркий образец реализации принципа компартменталлюации. В настоящее время не вызывает сомнений утверждение о том, что ядро представляет собой высокоупорядоченную систему. Решающим аргументом в пользу этого утверждения стали данные, свидетельствующие о том, что большинство внутриядерных процессов, связанных с процессингом РНК-траискриптов и сортингом белков, происходит локально и достаточно строго приурочено к определенным внутриядерным образованиям (обзор Spector, 2003),
В то же время реакции, в которые напрямую вовлечен хроматин, до настоящего времени изучены в куда меньшей степени, что связано, в свою очередь, с отсутствием последовательной модели организации хроматина, описывающей связь конформации ДНП-комплексов с их функционированием. Основные затруднения при исследовании организации хроматина связаны с высокой плотностью упаковки ДНП-материала, лабильностью его структуры и отсутствием универсальных маркеров, позволяющих отслеживать динамику преобразований конкретных структур.
Репликация ДНК представляет особый интерес в связи с центральной ролью этого процесса в клетке. Механизмы и динамика репликации хорошо изучены на уровне целого ядра и на уровне белковых комплексов, осуществляющих синтез ДНК. Однако поведение нативного субстрата
репликационных комплексов - хроматина - в ходе репликации, изучено фрагментарно.
Особый интерес представляют ультраструктурная организация репликационных сайтов - зон непосредственной активности факторов репликации. Немаловажными являются так же вопросы о конформации ДНК в этих зонах и о влиянии репликационных событий на общую организацию хроматина.
В настоящей работе была исследована структура реплицируемого хроматина в модельных системах, позволяющих стабилизировать нативные структурные состояния ДНП-комплексов, и получены новые данные о топологии репликационного процесса и корепликационной реорганизации фибрилл хроматина в контексте высших уровней компактизации ДНК. На основе результатов работы предложена модель организации репликационных сайтов в эу- и гетерохроматиновых доменах ядра.
