Введение к работе
Актуальность проблемы.
Большинство современных подходов к изучению таких сложных многокомпонентных систем, каким является организованный в хроматин генетический материал клетки, наряду с общеизвестными достоинствами имеет ряд недостатков. В результате важная информация о структуре и функционировании хроматтміа может сыпадать из поля зрения.
Во-первых, больщннство.экспернментальных методов требует нарушения целостности клетки и фракционирования биологического материала. Это может вызывать изменения в поведении макромолекул и их комплексов. Поэтому развитие методов, позволяющих максимально приблизить исследование к ситуации в целой или даже живой клетке, может дать важную дополнительную информацию.
Во-вторых, большинство современных молекулярных и биохимических методов, имея дело с массой клеток, неизбежно усредняют и фактически нивелируют особенности индивидуальных клеток и клеточных субпопуляций. С другой стороны, аналитические возможности современных цитогенетических и гистохимических методов ограничены из-за их трудоемкости и малой производительности. Поэтому полезно развивать высокопроизводительные методы количественного анализа различных параметров организации и функционирования индивидуальных клеток.
В-третъпх, основная часть современных методов изучения сложных
клеточных структур н систем статична, то есть не ;;ает информации о
j динамике клеточных процессов и о постоянно идущих перестройках
клеточных структур. Очевидно, что функционирование сложно-организованных клеточных структур возможно только при минимальном их разрушении в процессе анализа. Следовательно развитие подходов изучения таких структур п максимально питактных клетках может датн ранее недоступные сведения о динамическом аспекте их организации.
Все эти недостатки, по нашему мнению, может позволить частично преодолеть активно развивающаяся техника проточной цптометрпн, которая позволяет с высокой производительностью п чувствительностью
количественно регистрировать различные структурные и функциональные характеристики индивидуальных клеток при минимальном их разрушении либо прижизненно. Однако эффективное применение проточной цитометрни для изучения сложных многокомпонентных клеточных структур требует изобретения и развития специальных методических подходов.
Дели и задачи исаіедования.
Цель настоящей работы состояла в разработке новых подходов, позволяющих с помощью проточной цитометрни регистрировать изменения в высших порядках организации хроматина и применении этих методов для изучения функционирования и динамической организации хроматина в клетках млекопитающих.
В работе решались следующие задачи:
1.Изучить возможность применения методов проточной цитофлуорометрии для регистрации различий в структуре хроматина' в клетках млекопитающих.
-
Разработать методы фиксации клеток, позволяющие измерять степень экранированностн ДНК белками хроматина.
-
Описать явление изменения структуры хроматина при взаимодействии с однонитевой ДНК.
4. Изучить необычное поведение красителя Хест 33342, связанное с
удалением его из ДНК живых клеток, и охарактеризовать его зависимость от клеточного метаболизма, разрывов ДНК и активности топоизомераз.
Научная новизна.
В результате проведенной работы были предложены новые методы регистрации изменений в высших порядках упаковки хроматина.
Нами разработана процедура фиксации клеток, усиливающая экранирование ДНК белками хроматина от связывания с флуоресцентными красителями.
Впервые был предложен метод заключения отдельных клеток в полиакриламиднЫе частицы клеточного размера, позволяющий удалять '"ольшую часть клеточного белка, оставляя нативную ДНК заключенной в дискретные частицы клеточиого размера. Применение данного метода и
техники проточной цитофлуорометрии позволяет измерять сгеиень экранированности ДНК белками хроматина.
Считается, что необходимым условием для функционирования геномл является способность "раскрывать" в нужный момент те или иные его участки. Нами показано, что обработка клеточных ядер однонитевой ДНК, но не близкими по физико-химическим' свойствам двунитевой ДНК или РНК, приводит к значительному увеличению доступности ядерной ДНК. Высказано предположение, что появление участков' однонитевой ДНК может служить сигналом к локальному раскрытию хроматина.
Полученные результаты позволили высказать предположение, что в процессе активного удаления из клетки нековалентно связанных с ДНК агентов, наряду со специальными транспортными системами существует явление активной .энергозависимой диссоциации из клеточной ДНК веществ, нековалентно связывающихся по малой бороздке. Показано, что процесс удаления красителя Хест 33342 из ДНК зависит от топологии ДНК. и активности топоизомеразы2. Полученгые результаты могут дополнить представление о механизмах явления множественной лекарственной устойчивости.
Таким образом в работе были расширены возможности использования проточной цитофлуорометрии для изучения динамической организации генетического материала клетки.
Теоретическая и практическая ценность работы.
Поручены факты, указывающие на некоторые новые аспекты функционирования генетического материала клеток млекопитающих, такие как изменение структуры хроматина под воздействием однонитевой ДНК- и явление активного энергозависимого удаления из ДНК клеток нековалентно связывающихся веществ что может быть важно для понимания механизмов функционирования генетического'материала млекопитающих.
Предложен простой метод заключения отдельных клеток в полиакриламидиые частицы клеточного размера, позволяющий использовать таким образом фиксированные клетки для решения широкого спектра биологических задач.
Предложенный метод фиксации клеток-глутаровым альдегидом может быть использован в качестве экспресс-метода оценки соотношения форменных элементов крови (нейтрофилов и лимфоцитов) для диагностических целей.
Апробация работы.
Материалы работы представлялись на XVII Конгрессе
Международного общества аналитической цитологии (Лейк-Плэсид, США, 1994), были доложены на Всероссийских научных конференциях и научных семинарах Отдела молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации.
