Введение к работе
Актуальность проблемы. В основе механизма мышечного сокращештя лежит взапмодейстние миозина с актином, сопровождаемое гидролизом ЛТФ. В скелетной мускулатуре позвоночных регуляция этого взаимодействия осуществляется тропонин-троиомиозиновым комплексом, " ассоцнировшишм с Ф-актшюм. Однако, наряду с основной системой в регуляции принимают участие так называемые регуляторнно легкие цени (ЛЦ-2), связанные с головкой миозина.
В мышцах позвоночных ЛЦ-2 миозина подвергается зависящему от Са2* и кальмодулнна обратимому фосфорилированию, катализируемому специфическим Вермонтом -киназой легких цепей.- В гладких мышцах такое фосфорилирование играет ключевую роль . п регуляции взаимодействия миозина с актином и в запуске мышечного сокращения. Напротив, в скелетной мускулатура оно играет лишь модулирующую рель в регуляции сокращения. однако молекулярные механизмы этой модуляции не ясны, и новые шаги в этом направлении являются актуальными.
Для выяснения механизмов такой модуляции необходима знать, как влияет фосфорилирование ЛЦ-2 на структурное состояние актина и миозина в процессе генерации силы мышечным волокном. Адекватным методом для получения такой информации является метод поляризационной микрофлуорпметрпн, позволяг!:;нй исследовать характер нрисседнпеяил миознновыг головок к зктиновым нитям (ориентации и ; in ;ч; !!:;п """?> присоединенных головок), а такке структурные изменения Ф-актина, приводящие к изменению 0740011:^4^4^ количества "включенных" мономеров актина г Боровиков I?'j5). Необходимо отметать, что иод "включенным" понимается такое состояние актиновой нити, ігри котором происходит прочно списывание с мнозиновой головкой и активация ЛТФазы миозина, Напротив, "выключенное" состояние характеризуется слабим связыванием с головкой и неспособностью активировать АТ;г\азу яі 1001; пі пі 1987). Цель настоящей работы состояла в исследовании влияния фосіїюрилировакйя ЛІрЗ миозина на характер взаимодействия актина и миозина в скелетном мышечном волокне методом поляризационной микрофлуориметрии. Поэтому в работе были поставлены следующие задачи: Разработать метод получения глицеринизировашшх мышечных волокон кролика, содержащих фосфорилировашше и дефосфорилировашше ЛЦ-2 миозіша. Разработать способ определения степени- фосфорилирования Щ-2 в мышечных волокнах. Исследовать влияние фосфорилирования ЛЦ-2 и Са*1" на структурное состояние Ф-актина ц условиях изометрического сокращения, ригора и расслаблении мышечного волокна. Изучить влияние фосфорилирования ЛЦ-2 и Оа** на амплитуду изометрического напряжения, развиваемого мышечным волокном при сокращении. Исследовать влияние фосфорилирования ЛЦ-2 и Са2'' на подвижность головки миозина при ригорном взаимодействии с Ф-актином глицеринизировашюго мышечного волокна. Научная новизна и практическая значимость работы. Был предложен метод' получения глицеринизированных мышечных волокон, содержаниях- фосфорилировашше и дефосфорилировашше . ЛЦ-2 миозина. Предлежена модификация метода электрофореза в 8М мочевине. Она позволила точно определять степень фосфорилирования ЛЦ-2 в мышечном волокне, используя для этого более быстрый и менее трудоемкий метод. Методом поляризационной микрофлуориметрии и тензометрии впервые показано, что увеличение амплитуды . изометрического сокращении, вызванное фодфоршшрованием ЛЦ-2 миозина, коррелирует о увеличением относительного количества "включенных" мономеров актина. Впервые показано, что фосфорилированив 'ЛЦ-2 уменьшает число "включенных" мономеров в Ф-актине при расслаблении мышечного волокна. ' В исследованиях, проведенных на моделях мышечных волокон, впервые было показано, что фосфорилирование ЛЦ-2 оказывает влияние на конфзрмациго молекулы миозина. Материалы работы доказывают, что фосфорилирование ЛЦ-2 миозина играет модулирующую роль в процессе взаимодействия актина и миозина, влияя на конформвцию как одного, так и другого белка. Таким образом, проведенные исследования расширяют обпдае представления о механизмах регуляции . актин-мнозинового взаимодействия. Апробация работы. Результаты работы были представлены: на конференции "Молекулярные механизмы и энергетика подвижности" стран-участниц СЭВ по II направлению, г.Братислава,ЧССР, 1985г.; на 15 Европейском симпозиуме "Мышца и подвижность", г.Монцелье, Франция, 1986 г; на 7, Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности", г.Пущино, 1987г. vr Всесоюзной конференции по биохимии мышц г.Тбилиси, 1989 г. Работа отмечена премией АН СССР и Польской MI 1989-1990 г. Публикации. По материалам диссертации опубліковано 12 печатных работТ Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит"из 1'в1>д1?іїіїяТ—обзора" литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключен»г? выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, включая рисунков и I таблицу.
Похожие диссертации на Изучения влияния фосфорилирования ЛЦ-2 миозина на характер взаимодействия актина и миозина в скелетной мускулатуре позвоночных методом поляризационной микрофлуориметрии
