Введение к работе
Актуальность темы. Белки актин и миозин присутствуют во всех эукариотических клетках и составляют одну из систем, ответственных за преобразование химической энергии аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в механическую энергию направленного движения. В частности, взаимодействие актина и миозина лежит в основе мышечного сокращения.
В мышечных клетках актомиозиновая система активируется в ответ на повышение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме. Сокращение гладкой мышцы запускается обратимым фосфорилированием ре-гуляторных легких цепей миозина (ЛІДм), которое катализируется Са2+-кальмодулин-зависимой специфической киназой. Предполагается, что взаимодействие актина и миозина в гладких мышцах дополнительно модулируется белками, ассоциированными с актиновыми фи-ламентами, в частности, кальпонином (Winder, Walsh, 1993). Этот специфичный для гладких мышц белок способен ингибировать АТФазную активность актомиозина, причем взаимодействие с Са2+-связывающими белками или фосфорилирование кальпонина устраняют его ингибирующий эффект (Abe et al., 1990; Winder, Walsh, 1990).
Молекулярный механизм регуляторного действия кальпонина изучен недостаточно. Остается неизвестным, какой эффект оказывает кальпонин в сочетании с фосфорилированием Л1_Ьо на изменения кон-формации миозина из гладких мышц и актина, сопряженные с генерацией силы.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании молекулярных механизмов регуляции кальпонином взаимодействия Ф-актина с миозином из гладких мышц методом поляризационной микрофлуориметрии. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Выявить конформационные изменения Ф-актина, вызываемые связыванием с кальпонином в отсутствие и в присутствии тропомиозина;
-
Изучить конформационные изменения Ф-актина, происходящие при его связывании в отсутствие АТФ с головками миозина из гладких мышц, содержащими фосфорилированные и дефосфорили-рованные ЛІДда, в присутствии и в отсутствие ионов Са2+;
-
Исследовать влияние кальпонина на вышеуказанные структурные перестройки Ф-актина в отсутствие и в присутствии тропомиозина;
4. Изучить влияние кальпонина на ориентацию и подвижность головки миозина из скелетных мышц, связанной с Ф-актином в отсутствие АТФ и Са2+.
Научная новизна полученных результатов. В работе впервые показано, что при взаимодействии миозина из гладких мышц и актина в отсутствие АТФ фосфорилирование ЛЦго обусловливает "включение" мономеров актина, то есть конформационные изменения, сопровождающие выход продуктов гидролиза нуклеотида из активного центра, формирование сильного связывания между актином и миозином и генерацию силы. Дефосфорилирование ЛЦго определяет "выключение" мономеров актина, то есть конформационные изменения, сопровождающие гидролиз нуклеотида и соответствующие слабому связыванию актина с миозином, непосредственно не сопряженному с генерацией силы.
Получены приоритетные данные о том, что ионы Са2+ модулируют взаимодействие актина и миозина из гладких мышц, усиливая эффект фосфорилирования и ослабляя эффект дефосфорилирования ЛЦго на конформационные изменения Ф-актина.
Впервые установлено, что капьпонин, связываясь с актином, кооперативно изменяет конформацию последнего и тем самым блокирует формирование сильного связывания между актином и головками миозина с фосфорилированными ЛЦго.
Теоретическое значение работы. Впервые исследован структурный аспект модуляции кальпонином взаимодействия актина и миозина, а именно влияние кальпонина на изменения конформации Ф-актина, сопровождающие его взаимодействие с миозином из гладких мышц. Полученные данные свидетельствуют о том, что модуляция кальпонином взаимодействия актина и миозина сводится к ингиби-рованию "включения" мономеров актина и - в результате - к блокированию перехода актомиозинового комплекса к сильной форме связывания. Таким образом вскрыт молекулярный механизм, лежащий в основе описанных в литературе физиологических эффектов кальпонина. Результаты, представленные в работе, следует учитывать при изучении особенностей регуляции взаимодействия актина и миозина, обеспечивающих характерные функциональные свойства гладкой мускулатуры.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994), ХХШ Европейской мышечной конференции (Бохум, 1994), XL биофизическом конгрессе (Балтимор, 1996) и на межлабораторных научных семинарах в Институте цитологии РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 162 ссылки на научные публикации. Диссертация изложена на 125 страницах, включая 17 рисунков и 7 таблиц.
