Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Структурная организация сократительного аппарата скелетных и гладких мышц 12
1.2. Сократительные белки 18
1.2.1. Актин 18
1.2.2. Миозин 22
1.3. Области связывания актина с миозином 27
1.4. Взаимодействие миозина и актина 28
1.5. Регуляция актин-миозинового взаимодействия 31
1.6. Структура и функции кальдесмона 34
1.6.1. Структура кальдесмона и его положение в тонком филаменте 34
1.6.2. Связывание с актином 39
1.6.3. Связывание с тропомиозином 42
1.6.4. Взаимодействие с комплексом актин-тропомиозин 43
1.6.5. Взаимодействие с миозином 45
ГЛАВА II. Материалы и методы 48
2.1. Получение глицеринизированных мышечных волокон 48
2.2. Приготовление "теневых" мышечных волокон 48
2.3. Модификация Ф-актина мышечных волокон флуоресцентным красителем ТРИТЦ-фаллоидином 49
2.4. Получение миозина 49
2.5. Получение S1 51
2.6. Получение кальдесмона и тропомиозина 52
2.7. Получение С-концевого 35 кДа фрагмента кальдесмона 53
2.8. Получение рекомбинантных фрагментов кальдесмона HI и Н2 54
2.9. Присоединение белков к Ф-актину мышечных волокон 54
2.10. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле 55
2.11. Измерение изометрического напряжения 57
2.12. Измерение параметров поляризованной флуоресценции 58
ГЛАВА III. Результат 62
3.1. Влияние кальдесмона и его С-концевого фрагмента с молекулярной массой 35 кДа на амплитуду напряжения, развиваемого глицеринизированным мышечным волокном 62
3.2. Влияние кальдесмона и его С-концевого фрагмента на параметры поляризованной флуоресценции модифицированного ТРИТЦ-фаллоидином актина глицеринизированного мышечного волокна в расслаблении и ригоре 65
3.3. Влияние С-концевых актин-связывающих рекомбинантных пептидов кальдесмона HI и Н2 на параметры поляризованной флуоресценции модифицированного ТРИТЦ-фаллоидином актина "теневого" мышечного волокна при присоединении головки миозина к комплексу Ф-актин-тропомиозин 70
ГЛАВА IV. Обсуждение 75
4.1. Влияние кальдесмона и его С-концевого фрагмента с молекулярной массой 35 кДа на взаимодействие миозина и актина 75
4.2. Влияние рекомбинантных пептидов кальдесмона HI и Н2 на взаимодействие миозина и актина 82
Выводы 87
Список работ, опубликованных
По теме диссертации 88
Список литературы
- Сократительные белки
- Модификация Ф-актина мышечных волокон флуоресцентным красителем ТРИТЦ-фаллоидином
- Влияние кальдесмона и его С-концевого фрагмента на параметры поляризованной флуоресценции модифицированного ТРИТЦ-фаллоидином актина глицеринизированного мышечного волокна в расслаблении и ригоре
- Влияние рекомбинантных пептидов кальдесмона HI и Н2 на взаимодействие миозина и актина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Хорошо известно, что в основе мышечного сокращения лежит взаимодействие двух сократительных белков - актина и миозина, - сопровождаемое гидролизом АТФ. В цикле гидролиза АТФ актомиозином различают две наиболее важные формы связывания миозина с актином - "сильную" и "слабую" (Lymn, Taylor, 1971; Stein et al., 1979). Считается, что поперечные миозиновые мостики развивают напряжение при переходе от "слабой" к "сильной" форме их связывания с актином (White, Taylor, 1976; Eisenberg, Hill, 1985; Chalovich, 1992).
Регуляция сокращения гладких мышц осуществляется Са2+/кальмодулин-зависимым фосфорилированием регуляторных легких цепей миозина. Существенным моментом в механизме этой регуляции является изменение в мышечном волокне соотношения двух популяций миозина: популяции, содержащей фосфорилированные регуляторные легкие цепи и обладающей в связи с этим высокой скоростью АТФазного цикла, и популяции миозина, содержащей дефосфорилированные регуляторные легкие цепи и имеющей низкую скорость гидролиза АТФ (Gorecka et al., 1976; Chacko et al., 1977; Sobieszek, Small, 1977; Barany et al., 1979; Dillon et al., 1981; Butler, Siegman, 1982; см. обзор: Kamm, Stull, 1985).
Есть основания для предположения о том, что сокращение гладких мышц может регулироваться также с помощью регуляторного белка тонких нитей
кальдесмона (см. обзоры: Гусев и др., 1991; Богачева, Гусев, 1997; Marston, Redwood, 1991; Marston, Huber, 1996; Marston et al., 1998; Chalovich et al., 1998). Так, было показано, что кальдесмон способен связываться с миозином, актином, тропомиозином и Са -связывающими белками (Sobue, Sellers, 1991; см. обзор: Marston et al., 1998). Этот белок подавляет актин-активируемую АТФазную активность миозина из скелетных и гладких мышц (Marston, Smith, 1985; Szpacenko, Dabrowska, 1986; Fujii et al., 1987), уменьшает скорость движения актиновых нитей относительно головок скелетного и гладкомышечного миозина при исследовании подвижности in vitro (Haeberle et al., 1992; Shirinsky et al., 1992; Horiuchi, Chacko, 1995) и уменьшает силу, развиваемую демембранизированными мышечными волокнами, полученными из скелетных (Kraft et al, 1995; Heubach et al., 1997) и гладких (Pfitzer et al., 1993) мышц. Регуляторные свойства кальдесмона сохраняет его актин-связывающий С-концевой фрагмент с молекулярной массой 35 кДа (Szpacenko, Dabrowska, 1986; Fujii et al., 1987). Молекулярные механизмы регуляции сокращения гладких мышц кальдесмоном изучены недостаточно.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных механизмов регуляции кальдесмоном взаимодействия миозина и актина. В задачи исследования входило:
1. Изучить влияние кальдесмона или его С-концевого фрагмента с молекулярной массой 35 кДа на амплитуду изометрического напряжения, развиваемого глицеринизированным мышечным волокном при сокращении.
Исследовать конформационные перестройки Ф-актина, модифицированного тетраметилродамин-изотиоцианат-фаллоидином (ТРИТЦ-фаллоидином), глицеринизированных мышечных волокон в расслаблении и ригоре, в присутствии кальдесмона или его С-концевого фрагмента с молекулярной массой 35 кДа.
Выявить влияние рекомбинантных фрагментов кальдесмона HI (аминокислотные остатки 506-793 кальдесмона человека) и Н2 (остатки 683-767) на структурные изменения Ф-актина, модифицированного ТРИТЦ-фаллоидином, происходящие при декорировании комплекса Ф-актин-тропомиозин субфрагментом 1 миозина.
Основные положения, выносимые на защиту. Кальдесмон и его С-концевой фрагмент с молекулярной массой 35 кДа уменьшают силу, развиваемую глицеринизированными мышечными волокнами при переходе из расслабленного состояния в ригор.
Кальдесмон и его С-концевой фрагмент с молекулярной массой 35 кДа ингибируют формирование необходимой для генерации силы "сильной" формы связывания в ригоре и активируют переход актиновых мономеров в "выключенное" состояние при расслаблении мышечного волокна.
Фрагмент кальдесмона HI (остатки 506-793) в присутствии тропомиозина увеличивает относительное количество мономеров актина, находящихся в "выключенном" состоянии, и ингибирует образование "сильной" формы связывание между головкой миозина и актином.
3. Фрагмент кальдесмона Н2 (остатки 683-767) в присутствии тропомиозина увеличивает относительное количество мономеров актина, находящихся во "включенном" состоянии, и активирует образование "сильной" формы связывания актомиозинового комплекса.
Научная новизна работы. Впервые методом поляризационной микрофлуориметрии установлено, что кальдесмон изменяет структуру тонкого филамента в мышечных волокнах и модифицирует характер взаимодействия миозиновых поперечных мостиков с Ф-актином. Показано, что в присутствии кальдесмона или его С-концевого фрагмента молекулярной массой 35 кДа происходит "выключение" мономеров актина и ингибирование формирования между миозином и актином "сильной" формы связывания.
Получены приоритетные данные, которые позволяют предполагать, что С-концевая область кальдесмона способна как увеличивать, так и уменьшать относительное количество субъединиц актина, находящихся во "включенном" состоянии, посредством альтернативного вовлечения в связывание с актином участка В (остатки 747-767) или участков С (остатки 663-683), В и В' (остатки 770-793).
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы показывают, что в основе механизма функционирования регуляторного белка тонких нитей гладких мышц кальдесмона лежит его способность контролировать относительное количество "включенных" мономеров актина, способных образовывать "сильное" связывание с миозином, и мономеров
актина находящихся в "выключенном" состоянии и не способных формировать "сильное" связывание с головкой миозина.
Результаты могут быть использованы при чтении курсов лекций по цитологии и другим дисциплинам.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Основные положения работы доложены и обсуждены на 33-ем Международном физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997), на 26-ой, 28-ой и 31-ой Европейских мышечных конференциях (Ганновер, Германия, 1997; Йорк, Англия, 1999 и Лунтерен, Нидерланды, 2002).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 199 публикаций. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста и иллюстрирована 13 рисунками и 3 таблицами.
Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований.
Сократительные белки
Гладкая мускулатура образует сократительный аппарат всех внутренних органов и кожи (рис. 3, А) (см. кн.: Шубникова и др., 2001; см. обзор: Groschel-Stewart, Drenckhahn, 1982). Ее клетки веретеновидные или отростчатые (рис. 3, А, В). Их длина колеблется от 20 до 200 мкм. Миоциты обычно собираются в пучки, являющимися функциональными единицами мышечной ткани.
Основная масса цитоплазмы миоцита занята актиновыми и миозиновыми белками. Филаменты, содержащие актин и миозин, здесь образуют пучки, ориентированные вдоль или косо по отношению к длинной оси клетки, образуя линейные структуры - "сократительные единицы" (рис. 3, В, С). Одна миозиновая нить взаимодействует с 10-15 актиновыми. Есть плотные тельца, аналоги Z-линий, и пластинки прикрепления, локализованные с внутренней стороны плазмолеммы (рис. 3, В, С). Актиновые филаменты связываются на концах сократительных единиц с плотными тельцами или с пластинками прикрепления, вследствие чего каждая сократительная единица закрепляется в двух точках поверхностного аппарата клетки (рис. 3, С). Предполагают, что примембранные пластинки расположены по спирали и поэтому сократительные единицы оказываются под некоторым углом к длинной оси клетки. При сокращении лейомиоцита вся поверхность клетки приобретает бугристый и спиральный вид благодаря образованию глубоких впячиваний в местах прикрепления сократительных единиц. Каждая сократительная единица представляет собой структуру, аналогичную миофибрилле поперечнополосатого волокна, но в ней нет правильного саркомерного А - поперечный срез кровеносного сосуда. В, С - Строение гладкомышечной клетки позвоночного. Актиновые филаменты закрепляются на пластинках прикрепления или плотных тельцах, создавая вместе с миозиновыми филаментами внутриклеточные линейные структуры. D - На тонких филаментах гладких мышц лежит вытянутая молекула тропомиозина и регуляторный белок тонких нитей кальдесмон. От толстых филаментов отходят головки миозина, так называемые, поперечные миозиновые мостики, взаимодействующие с тонкими филаментами (Guilford, Warshaw, 1998). распределения тонких и толстых филаментов. Протофибриллы лежат более или менее параллельно, однако, на поперечном срезе их расположение неупорядоченное. Сокращение клетки обеспечивается взаимодействием актиновых филаментов с филаментами миозина в соответствии с моделью скользящих нитей.
Сократительный аппарат всех типов мышц включает в себя миозин, актин, тропомиозин и ассоциированные с ними регуляторные белки -тропонин, в поперечнополосатых мышцах (рис. 2, В), или кальдесмон, в гладких мышцах (рис. 3, D). Такая актомиозиновая система, преобразующая химическую энергию АТФ в механическую энергию, является молекулярной основой мышечного сокращения.
Актин может находиться в двух состояниях: в виде мономера (глобулярный актин) и в виде полимера (фибриллярный, или Ф-актин). Молекула глобулярного актина представляет собой мономер с молекулярной массой 42 кДа, состоящий из 375 аминокислотных остатков (Elzinga, Collins, 1972).
В 1990 году была установлена трехмерная структура глобулярного актина (рис. 4) (Kabsch et al., 1990). В структуре актина различают, так называемые, большой и малый домены. Эти домены отделены друг от друга глубокой щелью, в которой располагаются центр связывания нуклеотида (обычно АТФ и АДФ), а также центр связывания двухвалентных ионов (обычно иона Mg или Са ). Каждый из доменов подразделяется, в свою очередь, на два субдомена, компактно уложенных и отделенных друг от друга участка полипептидной цепи. В состав субдомена 1 входят остатки 1-32, 70-144 и 338-375, при этом N- и С- концы молекулы актина сближены друг с другом, субдомена 2 - остатки 33-69, субдомена 3 - остатки 145-180 и 270-337. Наконец, субдомен 4 содержит остатки 181-269. Так называемые, субдомены 1 и 2 принадлежат малому домену, а субдомены 3 и 4 входят в состав большого домена.
Модификация Ф-актина мышечных волокон флуоресцентным красителем ТРИТЦ-фаллоидином
Миозин выделяли из поясничной мышцы (т. psoas) кролика по методу Иванова и Юрьева (Иванов, Юрьев, 1961). Спинные мышцы дважды пропускали через предварительно охлажденную мясорубку. Около 200 г фарша заливали 600 мл раствора Вебера, содержащего 0.6 М КС1, 0.01 М Na2C03, 0.04 М №НСОз. Экстракцию актомиозина проводили в течение 7 минут при постоянном помешивании. Осадок отделяли центрифугированием. Центрифугирование на этой и на всех последующих стадиях проводили при 2000 об./мин. в течение 15 минут.
Супернатант фильтровали через 2-4 слоя марли для удаления жира. Затем к супернатанту приливали деионизованную воду в объеме, превышающем объем супернатанта в 10 раз. В полученном растворе рН доводили до 6.8 добавлением 2 % раствора уксусной кислоты. В этих условиях в течение 3-20 часов большая часть актомиозина и миозина из раствора переходила в осадок, который затем отделяли центрифугированием и промывали деионизованной водой.
К осадку при тщательном перемешивании по каплям добавляли раствор, содержащий 0.02 М К2СОз и 0.01 % фенолфталеина, до тех пор, пока раствор не приобретал розовое неисчезающее окрашивание (возникающее при рН 8.3). Далее осадок растворяли добавлением КС1 до конечной концентрации 0.5 М. Раствор белка разводили в 10 раз деионизованной водой комнатной температуры, предварительно подщелоченной с помощью К2СО3 до слабого розового окрашивания по фенолфталеину. В этих условиях миозин остается в растворе, тогда как актомиозин образует рыхлый осадок.
Через 3-20 часов осадок отделяли центрифугированием. Опалесцирующую слабо-розовую надосадочную жидкость охлаждали до +4С и разводили в два раза холодной деионизованной водой. рН полученного раствора доводили до 7.0 добавлением 2 % раствора уксусной кислоты.
Миозин выпадал в осадок, который при стоянии раствора в течение 10-12 часов образовывал студенистый слой. После отделения верхней части надосадочной жидкости декантацией, а нижней ее части центрифугированием, полученный осадок миозина растворяли добавлением 3 М раствора КС1 до конечной концентрации 0.5 М.
Миозин хранили в растворе, содержащем 50 % глицерина, 0.5 М КС1, 5 мМ ДТТ, 1 мМ NaN3, при -20С в течение 1-6 месяцев.
Субфрагмент-1 миозина (S1), не содержащий регуляторных легких цепей, получали ограниченным протеолизом скелетного миозина сс-химотрипсином (Okamoto, Sekine, 1985) в буфере: 0.01 М Трис-HCl (рН 6.8), 0.12 М NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ NaN3 в весовом отношении миозин:химотрипсин равном 300:1 при 25С и постоянном перемешивании в течение 20 минут. Реакцию ингибировали добавлением PMSF до конечной концентрации 1 мМ и охлаждением на льду. Затем добавляли раствор Mg до концентрации 3 мМ и далее центрифугировали при 15 тыс. об./мин. в течение 15 минут. Супернатант смешивали с двумя объемами насыщенного раствора сульфата аммония (до 70 % насыщения). Центрифугировали при 15 тыс. об./мин. в течение 15 минут. Осадок S1 растворяли в 1мл буфера, содержащем 0.02 М Трис-гидрохлорида рН 7.5, 1 мМ MgCl2, 0.1 мМ ДТТ, 0.1 мМ NaN3, а затем диализовали в течение ночи против того же буфера.
Кальдесмон и тропомиозин были выделены из гладкой мускулатуры желудка цыпленка (Bretscher, 1984). 100 г. очищенных гладких мышц из свежих желудков цыплят помещают в холодную (+4С) воду, содержащую 0.25 мМ PMSF. Затем мышцы измельчают и гомогенизируют в буфере следующего состава: 0.3 М КС1, 1 мМ ЭГТА, 0.5 мМ MgCl2, 0.25 мМ PMSF, 50 мМ имидазол-HCl (рН 6.9). Гомогенат нагревают в стеклянной колбе приблизительно до 90 и выдерживают при такой температуре около 2 минут. Затем охлаждают на льду и центрифугируют при 47 тыс. g в течение 30 мин. Осадок отбрасывают, а в супернатант добавляют сульфат аммония до 30 % насыщения (16.4 г. сулфата аммония на 100 мл супернатанта). Осадок осаждают центрифугированием. Концентрацию сульфата аммония в супернатанте увеличивают до 50 % насыщения (11.7 г. сулфата аммония на 100 мл супернатанта). Осадок осаждают центрифугированием. Тропомиозин остается в супернатанте. Осадок, содержащий кальдесмон, осаждали центрифугированием и далее растворяли в 5 мл буфера А (0.1 мМ NaCl, 0.1 мМ ЭГТА, 0.1 мМ ДТТ и 50 мМ имидазол-HCl (рН 7.0)) и просветляли центрифугированием.
Влияние кальдесмона и его С-концевого фрагмента на параметры поляризованной флуоресценции модифицированного ТРИТЦ-фаллоидином актина глицеринизированного мышечного волокна в расслаблении и ригоре
Модификация Ф-актина глицеринизированных мышечных волокон ТРИТЦ-фаллоидином вызывает появление поляризованной флуоресценции волокна. Степень поляризации света флуоресценции при ориентации волокна параллельно и перпендикулярно плоскости поляризации света возбуждения -положительная и отрицательная величины, соответственно. Это указывает на то, что флуоресцентная метка жестко связана с Ф-актином и располагается в мышечных волокнах анизотропно (Yanagida, Oosawa, 1978; Prochniewicz-Nakayama et al., 1983; Kakol et al., 1987). Присоединение этой метки к Ф-актину не оказывает заметного влияния ни на актин-активируемую Mg-АТФазную активность миозина (Dancker et al., 1975), ни на напряжение, развиваемое глицеринизированным мышечным волокном (Prochniewicz-Nakayama et al.,1983).
В качестве показателя конформационных изменений актина в работе использовали изменение угла ориентации осциллятора излучения (ФЕ) или поглощения (Фд) красителя и среднюю величину угла отклонения оси актинового филамента от оси волокна (0ш).
Переход глицеринизированного мышечного волокна из расслабленного состояния в ригор сопровождается заметными изменениями параметров поляризованной флуоресценции. Величина ФЕ уменьшается на 1.3 ± 0.1, а значение 01/2 увеличивается на 2.1 ± 0.1 (табл. 1) (Вихорев и др., 20006). Согласно интерпретации, предложенной ранее (Borovikov et al., 1991), вышеописанные изменения поляризационных параметров отражают такие конформационные изменения актина, которые вызваны образованием "сильной" формы связывания между поперечными миозиновыми мостиками и актином. Такая форма связывания инициирует переход субъединиц актина из "выключенного" во "включенное" состояние. При этом гибкость тонких нитей увеличивается (Prochniewicz-Nakayama et al., 1983; Borovikov et al., 1991). Следовательно, при переходе мышечного волокна из расслабленного состояния в ригор происходит формирование "сильной" формы связывания миозиновых мостиков с актином.
Присоединение кальдесмона или его С-концевого фрагмента к актину существенно изменяет значения поляризационных параметров как при расслаблении волокна, так и в ригоре (табл. 1) (Borovikov et al., 1997; Borovikov et al., 1998; Вихорев и др., 20006). Следовательно, кальдесмон и его фрагмент, связываясь с актином, изменяют его конформацию в глицеринизированных мышечных волоках и модифицируют конформационные изменения актина, инициированные формированием как "сильной", так и "слабой" форм связывания поперечных миозиновых мостиков с актином.
Поскольку изменения углов ФЕ И 1/2 отражают изменения в ориентации флуорофоров в Ф-актине и изменения жесткости актиновых нитей
Влияние кальдесмона или его С-концевого фрагмента с молекулярной массой 35 кДа на параметры поляризованной флуоресценции ТРИТЦ-фаллоидина, связанного с Ф-актином, в ригоре и при расслаблении глицеринизированного мышечного волокна (Вихорев и др., 20006).
Приведены значения угла ФЕ между осью тонкой нити и осциллятором излучения красителя, а также значения угла i/2 между осью волокна и осью тонкой нити. Каждое значение представляет собой среднюю величину, вычисленную на основании 220 измерений, выполненных не менее чем на 22 волокнах. Молярное отношение кальдесмона и его С-концевого фрагмента к актину было 1:10 (±2). Для каждого параметра значения достоверно различаются на уровне значимости 0.05. соответственно и так как большему углу &у2 соответствует меньшая жесткость тонких нитей (Yanagida, Oosawa, 1978; Nowak et al., 1991), можно заключить, что кальдесмон изменяет пространственное расположение флуорофоров в тонких нитях их менее жесткими.
Как отмечалось выше, кальдесмон и его С-концевой фрагмент оказывают существенное влияние на величины ФЕ и 1/2 как при расслаблении волокна, так и в ригоре (табл. 1). Это указывает на то, что кальдесмон и его фрагмент модифицируют конформационные изменения актина, инициированные формированием как "сильной", так и "слабой" форм связывания поперечных миозиновых мостиков с актином.
При расслаблении волокна, в присутствии кальдесмона (молярное отношение регуляторного белка или его фрагмента к актину было 1:10 (±2) (Рис. 12)), величина угла ФЕ возрастала на 0.8 ± 0.1, а значение 01/2 уменьшалось на 1.6 ± 0.1 (табл. 1) (Вихорев и др., 20006). Согласно интерпретации, предложенной ранее, такие изменения поляризационных параметров указывают на то, что головки миозина формируют с актином "слабую" форму связывания (Borovikov et al., 1991; Borovikov et al., 1996a; 1996b). Следовательно, кальдесмон и его С-концевой фрагмент при расслаблении волокна не препятствуют формированию "слабой" формы связывания поперечных миозиновых мостиков с Ф-актином.
Влияние рекомбинантных пептидов кальдесмона HI и Н2 на взаимодействие миозина и актина
Известно, что в тропомиозин-зависимом ингибировании АТФазной активности актомиозина участвуют три области домена 4 кальдесмона: участок С (остатки 663-683), участок В (остатки 747-767) и участок В (остатки 770-793) (Fraser et al., 1997). Для того, чтобы выяснить роль этих участков в механизме регуляции актин-миозинового взаимодействия, в работе были использованы рекомбинантные фрагменты кальдесмона - HI (остатки 506-793) и Н2 (остатки 683-767) (Fraser et al., 1997). Оба эти фрагмента ингибируют актин-активируемую АТФазную активность миозина в отсутствие тропомиозина, но их эффекты на актин-тропомиозин-активируемую АТФазную активность миозина в присутствии тропомиозина противоположны: НІ ингибирует актин-активируемую АТФазную активность миозина, а Н2 увеличивает степень активации миозиновой АТФазы актин-тропомиозином (Fraser et al., 1997).
Чтобы изучить эффект, оказываемый связыванием рекомбинантных фрагментов кальдесмона HI или Н2 с комплексом Ф-актин-тропомиозин на взаимодействие миозина и актина, мы использовали "теневые" волокна, модифицированные флуоресцентным красителем ТРИТЦ-фаллоидином, в тонкие филаменты которых был реконструирован тропомиозин. Ф-актин "теневых" волокон декорировали субфрагментом 1 миозина.
Измерения параметров поляризованной флуоресценции меченного актина в мышечных волокнах позволяет определить конформационное состояние актина, т. е. соотнести его с одним из двух конформационных состояний, которые, как было ранее показано, соответствуют "включению" или "выключению" регулируемого тонкого филамента в волокне (Borovikov et al., 1991; Borovikov et al., 1996b; см. обзоры: Боровиков, 1998; Borovikov, 1999).
Результаты, полученные с помощью поляризационной флуориметрии, показывают (табл. 3), что HI и Н2 оказывают влияние на поляризационные параметры (Фд и Фщ) ТРИТЦ-фаллоидина, специфически связанного с актином комплекса Ф-актин-тропомиозин. В этих экспериментах при связывании HI с Ф-актином угол Фд возрастает на 0.9 % (табл. 2), а значение 1/2 увеличивается на 2.9 % (табл. 2) (Вихорев и др., 2000а; Borovikov et al., 2001). Следовательно, HI влияет на пространственную организацию мономеров актина в тонком филаменте и повышает его жесткость. Подобные эффекты описаны в литературе для аналогичных экспериментов с кальдесмоном (Galazkiewicz et al., 1987; Nowak et al., 1991) и его С-концевым фрагментом с молекулярной массой 35 кДа (Borovikov et al., 1996b).
Опираясь, на полученные данные, можно предположить, что HI вызывает конформационные перестройки Ф-актина, схожие с изменениями, происходящими в теневом волокне в присутствии кальдесмона или его С-концевого фрагмента, содержащего домены 3 и 4. В присутствии Н2, соответствующего центральной части домена 4, при том же самом молярном отношении связавшегося белка к актину, изменение показателя Фд было не выражено, а величина 01/2 возросла на 5.8 % (табл. 2) (Вихорев и др., 2000а; Borovikov et al., 2001).
Наши данные показывают, что в комплексах с тропомиозин-Н1 и с тропомиозин-Н2 Ф-актин находится в разных конформационных состояниях. Эта разница легко объясняется, если принять во внимание, что HI содержит 3 участка связывания актина - С, В и В (Fraser et al., 1997; Huber et al., 1998; Marston et al., 1998), тогда как H2 содержит лишь один участок, а именно В (Fraser et al., 1997). Следовательно, конформационное состояние актина зависит от того, какие из актин-связывающих участков С-концевой области кальдесмона участвуют во взаимодействии с актином.
Чтобы выяснить, изменяют ли С-концевые рекомбинантные фрагменты кальдесмона характер взаимодействия актина с миозином, мы использовали комплекс актин-тропомиозин-Sl, в отсутствие АТФ, в качестве модели состояния актомиозинового комплекса, производящего силу (Geeves, Lehrer, 1994), или состояния "сильного" связывания.
