Содержание к диссертации
Введение
1. Роль рн в функционировании клеток 8
1.1.Влияние рН на внутриклеточные процессы 8
1.2. Анализ.методов измерения внутриклеточных рН. 13
1.2.1.Измерение рН выделенной из клеток цитоплазмы простыми электродами 14
1.2.2.Микроэлектродный метод определения внут риклеточного рН 14
1.2.3.Определение рН клеток по распределению жирорастворимых слабых кислот или осно ваний 16
1.2.4.Определение рН клеток с помощью колори метрии или фдуориметрии 21
1.2.5.Метод определения рН клеток с помощью ядерно-магнитного резонанса 26
2. Разработка метода прижзненного опрщеленш внутриклеточного рн. точность метода 31
2.1. Выбор красителя. З1
2.2. Материал и методы 39
2.З. Обоснование метода 46
2.3.1. Результаты спектрального анализа растворов нейтрального красного. Выбор длин волн 46
2.З.2. Построение калибровочных кривых. 54
2.4. Анализ погрешностей метода. 57
2.4.1. Правомочность экстраполяции зависимости K=f(pH) в областьной концентрации нейтрального красного 61
2.4.2. Точность определения рН структур с различной концентрацией нейтрального красного. 62
2.4.3. влияние накопления нейтрального красно го на рН самой структуры 69
2.4.4. Связь нейтрального красного с белками 71
2.4.5. Связь нейтрального красного с мембранами 75
2.4.6. Изменение ионной силы среды 76
2.4.7. Спектральная ширина щели монохроматора 79
2.4.8. Точность записи спектра 80
2. 4.9. -Рассеянный свет; эффект Шварцшильда-Виллигера 82
2.4.10. Свет люминесценции нейтрального красного 84
2.4.11. Положение измерительного зонда и фокуси ровка объекта 87
2.4.12. Суммарная ошибка измерения рН. Проверка разработанного метода 87
3. Использование разработашого метода. для при жизненного исследования рн лизосом и цито плазмы в норме и при различных воздействиях. 95
3.1. Краткая характеристика лизосомального аппара та клеток 95
3.2. Нейтральный красный и гранулообразование в клетках. 99
3.З. Материал и методы 100
3.4. Определение и характеристика рН лизосом клеток культуры ткани 108
3.5. Оценка возможного влияния температуры инкубации на состояние клеток и величину внутрилизосомального рН 111
3.5.1. Обоснование проведения экспериментов при 20С 111
3.5.2.'Сравнение включения 3Н-тимидина в ДНК кле ток при 37 и 20С 125
3.5.3. Сохранение клетками способности к делению и к синхронизации митозов после длительного воздействия комнатной температуры 127
3.5.4. Сравнение рН лизосом клеток при 37 и 20С. 130
3.6. Длияние различных агентов на рН внутриклеточных структур 132
3.6.1. Длияние концентрации нейтрального красного в среде на рН внутриклеточных структур. 132
3.6.2. Влияние рН среды на величину рН лизосом и цитоплазмы 137
3.6.3. Действие протонофоров на величину рН ли зосом и цитоплазмы клеток 141
3.6.4. Действие моноиодацетата 143
3.6.5. Действие амитала 144
Заключение 149
- Анализ.методов измерения внутриклеточных рН.
- Анализ погрешностей метода.
- Нейтральный красный и гранулообразование в клетках.
- Длияние различных агентов на рН внутриклеточных структур
Введение к работе
В настоящее время внимание исследователей все больше привлекает изучение рН в живых клетках и их отдельных компартментах.
Активность ферментов (разные ферменты клетки имеют различные рН-оптимумы в диапазоне от 2.5 до 9.0 ед), распределение и накопление слабых кислот и оснований, транспорт субстратов через мембраны, направление ферментативных реакций, биосинтезы и пролиферация - все эти процессы в большой степени зависят от величины рН в клетке и среде.
По мнению некоторых авторов величина рН в клетке может иметь важное функционально-регуляторное значение /Полевой,1975; Gerson, 1978/. Это ставит перед исследователями вопрос о пространственно-временной организации клетки по величине рН» По-видимому, у клетки может быть две возможности: либо поддерживать рН на постоянном уровне, либо изменять величину рН внутриклеточных структур в процессе метаболизма. В первом случае многие ферменты никогда не будут работать в оптимальном режиме и не смогут проявить максимальную активность. Во втором - каждый фермент в какой-то период времени сможет работать при оптимальном или близком к нему значении рН.
Второй путь, по-видимому, более целесообразен, и доказательством тому служит разделение клетки на компартменты, имеющие различные рН.
Многочисленными исследователями показано, что рН однотипных компонентов в клетках различного происхождения очень сходны: в цитоплазме растительных и животных клеток - нейтральная или слабощелочная среда с рН 7.0-7.2 ед; в лизосомах, пищеварительных вакуолях простейших, центральных вакуолях клеток растений - кислая среда с рН порядка 3.5-5.5 ед; кислая среда также в хромаффинных гранулах и освещенных тилакоидах; в митохондриях и матриксе хлоропластов рН выше, чем в цитоплазме (7,6-8.5) / Полевой, Саламатова 1980; Lynn,I968; De Duve et al.,I974j Gerson,I978; Tager et al., 1982 /.
Однако, эти данные не дают ответа на вопрос о динамике рН в различных компартментах, т.е. о временной организации рН в клетке. Этот вопрос представляет собой интерес в отношении таких гетерогенных органоидов как лизосомы, которые являясь органоидом внутриклеточного пищеварения, содержат большее количество кислых гидролаз, с рН-оптимумами от 2.5 до 7.6 ед. В связи с этим можно предположить, что лизосомы должны быть ге-терогенны по величине рН.
К сожалению, большая часть измерений рН сделана на популяциях клеток или в суспензиях органоидов и дает средне статистические значения рН в них. При этом теряется информация о размахе индивидуальных изменений изучаемого параметра. Кроме того, особенности функционирования интактных клеток и органоидов могут быть иными, чем при выделении их в суспензии / MegO et al., 1972; Schneider, 1977 /.
Исследование изменений рН отдельных компартментов может иметь большое значение и при изучении механизма действия на клетки различных агентов.
Из всего сказанного следует, что для выявления пространственно-временной организации клеток по величине рН и выяснению роли рН в процессах клеточного метаболизма, необходимо иметь метод, позволяющий изучать динамику этого параметра в индивидуальных клетках и органоидах. Однако, до сих пор такого метода не существовало.
В связи с этим перед нами была поставлена задача разработки метода определения рН в отдельных лизосомах и участках цитоплазмы живой клетки в течение длительного времени, анализа погрешностей метода и применения метода для исследования клеток культур ткани в норме и при некоторых воздействиях.
Анализ.методов измерения внутриклеточных рН.
Древне определения кислотности внутриклеточной среды были сделаны в конце прошлого века И.И.Мечниковым при изучении пищеварения у простейших / см. п.5 настоящей главы /. В дальнейшем все возрастающий интерес исследователей к изучению величины рН и характера изменения рН живых клеток привел к возникновению и развитию разнообразных и многочисленных методов для решения этой задачи. Рассмотрим их подробнее. 1.2.1.Измерение „выделенной вз клеток цитошгазмы_пр_остыш электродами. Это самый старый количественный метод определения pHg, простой и быстрый, который использовали для измерения кислотности клеточного сока растений и лизатов ( или гомогенатов) клеток животных. Первые достаточно точные измерения внутриклеточных рН были проведены в 1927 году Фуроеавой и Керриджем на гомогенатах СКелеТНЫХ МЫШЦ И СердеЧНОЙ МЫШЦЫ КОШеК / Purusawa, Кег- ridge, І927/.ДЛЯ скелетных мышц величина рН оказалась равной 6.89 ед, а для сердечной мышцы - 6.92 ед. Эти результаты хорошо согласуются с современными : рН сердечной мышцы крысы -6.80 Такое же совпадение характерно и для значений рН эритроцитов человека: измерение рН их лизатов простыми электродами дали величину - 7.20, а рН интактных эритроцитов, измеренный С ПОМОЩЬЮ ДРУГИХ методов - 7.22 / Fitz3imons,Sendroiy, 1961/. Однако, при измерении рН гомогенатов высококомпарментали-зированных клеток возможны существенные ошибки из-за влияния примеси органоидов и клеточных мембран, которые обладают системами быстрого транспорта протонов и могут значительно изменить рН гомогената. Например, рН яиц морских ежей, измеренный в их гомогенатах, составлял 6.48 ед для неоплодотворенных яиц и 6.76 - для оплодотворенных, и отличался от соответствующих значений, полученных с помощью микроэлектродов - 6.84 и 7.26 /johnson et al., 1976; Shen,Steinhardt.s 1978/. Описываемый метод имеет следующие существенные недостатки: ограниченность применения (преимущественно для клеток с невысоким уровнем компартментализации); опасность изменения исходной величины рН гомогената вследствие загрязнения его большим количеством органоидов, обломками клеточных мембран, буферами наружной среды, гликокаликсом и т.п.; получение среднестатистического значения рН для большого числа клеток( т.е. нивелирование индивидуальных различий рН клеток); возможность только одного измерения величины рН для каждой популяции клеток. 1 2.2._%коэлектрсдный метс- определения внтриклеточного_рН. Естественным развитием электродного метода определения рН в гомогенатах стала разработка микроэлектродного метода для измерения рН в единичной клетке. Метод основан на исполь-зовании двух микроэлектродов, один из которых Н - чувствительный, другой - индифферентный, используемый для коррекции вклада мембранного потенциала. Оба электрода вводят в одну клетку как можно ближе друг к другу, чтобы не возникало разности потенциалов между ними.
Если клетка мала для введения обоих электродов, то второй электрод вводят в соседнюю клетку. В этом случае измерения будут менее точны. Бремя регистрации рН зависит от диаметра кончика электрода и увеличивается с уменьшением диаметра: для электрода, диаметром 20 мкм время измерения рН составляет I сек, диаметром 4-8 мкм - 1-3 минуты, а диаметром 2 мкм - 5-35 минут /ROOS, Boron, 1981/. Диапазон измеряемых значений рН - от 4 до 8 ед. Для разных целей и объектов разными авторами разработано несколько видов микроэлектродов. самые первые электроды были металлическими, например, из черной платины. Затем появились стеклянные микроэлектроды с сурьмяным покрытием и стеклянные микроэлектроды из Н4"- чувствительного стекла. Существует несколько разновидностей таких электродов. / Thomas ;Е974; Hes, 1981; Roos, Boron, 1981 /. Результаты измерения pl с помощью микроэлектродов хорошо совпадают с результатами, полученными другими методами. Так, при измерении с помощью микроэлектродов рН мышц кошки, краба и лягушки получены значения 6.78, 7.15, 7.12 соответственно; рН сердечной мышцы крысы и морской свинки - 7.2, нейронов ВИНОГрадНОЙ УЛИТКИ - 7.41 ЄД /Bittar, 1964; Thomas, 1974; Ellis, Thomas, 1976/. Измерения pRg с помощью других методов дали близкие результаты: рН сердечной мышцы крысы, человека и собаки составляют соответственно 7.14, 6.94, и 7.04; мозга крЫСЫ - 7.07 ЄД /Bittar, І964;ЕИІЗ, Thomas, 1976; Kogure et al.,I975/. Микроэлектродный метод используется и как самостоятельный, и в сочетании с другими методами для сравнения и контроля результатов при разработке новых методик определения рН в клетках/ Ger son, виг ton, 1977/. Точность микроэлектродного метода 0.02-0.05 ед рН. Основное достоинство метода - измерение рН в единичной клетке. Однако метод имеет ряд недостатков: трудно избежать контакт микроэлектродов с экстраклеточной жидкостью; введение микроэлектродов травмирует клетку, что может привести к изменению ее рН /Насонов, 1963 /; очень мелкие клетки и органоиды не могут быть измерены, т.е. существует ограничение применимости метода из-за размеров объекта; при использовании очень тонких электродов время одного измерения достигает нескольких десятков минут. Однако, техника изготовления микроэлектродов продолжает совершенствоваться, и в последнее время сконструированы быстро работающие сдвоенные ионно-обменные жидкие электроды, толщина кончика которых менее I мкм, а время измерения всего НеСКОЛЬКО Секунд / Roos,Boron, 1981 /. І«2«3._С ре еление Н клеток_по аспЄеленш жи0аствоИмых Р й нХ-Кислот шш оснований. Метод основан на представлении, что через цитоплазмати-ческую мембрану живых клеток слабые электролиты проходят только в нейтральной, незаряженной форме. Впервые Овертон / Overton,1897/ наблюдал концентрирование в живых клетках слабых электролитов /Ш3 и различных аминов / в зависимости от pHQ и pHg. Он обнаружил, что при уменьшении количества незаряженной формы агента в среде, которое достигалось добавлением в среду минеральных кислот, в клетках не наблюдалось образования преципитатов исследуемого амина. Овер-тон сделал вывод, что только незаряженные молекулы могут проникать в живые клетки. Это наблвдение проверено и конкретизировано многими исследователями / Эпштейн, 1957; war burg, 1910; Waddel, Butler, I959;De Duve et al,I9?4 J Butler et al., 1967; Giese, 1968; Davson, Danielli, 1970; Roos, Boron, 1981/.
Анализ погрешностей метода.
Точность предложенного метода, зависит как от ошибок, присущих самому методу, так и от величины ошибки измерений оптической плотности каждой структуры, т.е.от аппаратурных ошибок. Ошибки самого метода зависят от: правомочности экстраполяции зависимости К= f (рН) в область 10%-ной концентрации НК: степени неточности определения рН структур с различной концентрацией НК; зависимости величины рН от накопления НК в структуре; влияния связи НК с белками и мембранами измеряв- мой структуры, изменения ионной силы среды и селективного светорассеяния в объекте на величину определяемого рН. Ошибки измерения оптических плотностей определяются : неточностью записи спектра поглощения, спектральной шириной щели монохроматора, вкладом рассеянного света в системе прибора и в объекте и света люминисценции ВК, возможным изменением положения измерительного зонда и фокусировки объекта в процессе записи спектра. Рассмотрим влияние обеих групп погрешностей на точность определения рН в живых клетках. Р гДЛ.. Правомочность экстраполяции зависимости K=JripH) JB область ІО -ной конренграции н йтраяьного красного Рассматриваемый метод прижизненного определения рН различных внутриклеточных структур разработан на основе анализа спектральных характеристик растворов НК. Однако, во внутриклеточных структурах спектральные характеристики БК могут отличаться от таковых в растворах из-за значительного накопления НК и селективного светорассеяния, характерного для живых клеток /Карнаухов, 1973/. Для подтверждения правомочности экстраполяции значений К в область 10$ концентрации НК были составлены три группы спектров для различных рН: спектры участков цитоплазмы и индивидуальных лизосом; спектры 1% растворов НК;и реконструированные спектры для IOfo НК, полученные путем экстраполяции в область 10$ концентрации НК показателей поглощения растворов : красителя в различных длинах волн при рН=4.5 и 7.0.
Показатели поглощения, вычисленные на основании параметров, полученных при записи спектров буферных растворов НК, аппроксимировались прямыми, имевшими разные наклоны к оси абсцисс(рис. 15 (Г).Экстраполяция этих прямых в область 10$ концентрации НК (по логарифмической шкале) позволила определить показатели поглощения НК для этой концентрации при рН 4.5 и 7.0. Реконструкция спектров производилась по 5 точкам в следующих длинах волн: 400, 450, 470, 520 и 610 нм. Эти точки соответствовали началу записи спектра, максимумам поглощения нейтральной и протонированной форм Ж, изобестической точке спектров и длине волны на спаде кривой спектра, (рис. 15а). Поскольку концентрации и толщина реальных клеточных структур могут варьировать, спектры лизосом и цитоплазмы были соответственно нормированы по D470 На пРивеДенном рисунке (рис. 16 ) видно, что форма реальных спектров поглощения окрашенных НК лизосом хорошо согласуется с формой реконструированных спектров. Это дает основание считать экстраполяцию К в область 10$ концентрации НК правомочной. Совпадение формы спектров характерно также для окрашенных участков цитоплазмы и 0.08%-ных и %-тх растворов НК (рис.17 ). Приведенные данные свидетельствуют также о том, что влияние селективного светорассеяния (которое наиболее выражено в области максимума спектров поглощения) на спектры структур, окрашенных НК, незначительно, поскольку формы спектров растворов и внутриклеточных структур близки. 11Л 2 Лочность определения Й_стру;кту с различной кондентра-цией_найтрального красного Для определения рН по величине К необходимо знать концент- Величина К по калибровочной кривой дает значения рН=6,6 ед» Запись на приборе МАШ. Імпульсами отмечены реперные длины волн. По оси абсцисс - длины волн, нм; по оси ординат - пропускания в %, рацию НК в исследуемой структуре. Определить её для каждой конкретной лизосомы не представляется возможным, т.к. нельзя измерить толщину последней в живой клетке. Сднако, на основании полученной экспериментально зависимости 470= для лизосом разного размера ( $ -площадь лизосомы) при одинаковом значении рН в них(т.е. в тех условиях, когда концентрацию НК в таких лизосомах можно считать одинаковой), можно заключить, что толщина лизосом изменяется пропорционально VJ3 (рис. 18 ). Из рисунка видно, что для разных по величине рН групп лизосом зависимость оптической плотности ( D Q) ОТ площади лизосом аіґроксимируется практически одной и той же кривой, которая математически описывается зависимостью, пропорциональной v$ .
Поскольку, концентрация НК в каждой группе лизосом постоянна, то изменение D470 УДет зависить только от толщины лизосомы, следовательно, изменение толщины тоже будет пропорционально V$". Сопоставляя диапазон изменений Б470 и толщину лизосом можно сделать вывод, что концентрация НК как в одной лизосоме, так и для всей популяции измеренных лизосом может изменяться в среднем примерно в 2 раза, т.е. при средней концентрации НК в лизосомах, равной 10$, возможны колебания концентрации красителя от 7 до 14$. Это приводит к возникновению зоны неопределенности величины рН на калибровочной кривой (рис. 19 ). Ошибка определения рН в разных точках калибровочной кривой из-за этого фактора представлена на рисунке 19 (кривая 4 ). При рН=4.7 она составляет ±0.26 ед рН, а в области более высоких значений рН структуры она заметно снижается. При уменьшении пределов изменения концентраций НК или в отсутствии его, точность метода значительно возрастает. Заштрихована зона неопределенности в-величине рН. По оси абсцисс -единицы рН; по оси ординат: относительнне единицы (значения К) - слева; единицы рН - справа. НК является слабым основанием, поэтому при накоплении его в цитоплазме и, особенно, в лизосомах может наблюдаться сдвиг рН структуры в щелочную сторону/ Lynn, 1968; Reijn-goud et al.,I976 !j Johnson, Epel,I98I; /. Еще ОДНОЙ причиной такого сдвига может быть увеличение размера структуры за счет повышения осмотического давления в ней в результате накопления Ж, что, в свою очередь, может привести к уменьшению концентрации водородных ионов. Из анализа работ ряда авторов/ Rei- jngoud et al.f1976 Ohkuma,Poole,1981 / СЛЄДУЄТ, ЧТО При НаКО- плении в лизосомах различных слабых оснований (метиламина, про-пранола, трибутиламина, хлористого аммония и др.) наблюдается повышение рН в этих структурах, и величина его зависит от концентрации слабого основания в среде. Однако, по-видимому, благодаря достаточно высокой буферной емкости лизосом, в некотором диапазоне концентраций слабых оснований в среде, их накопление не влияет на величину рН в лизосомах / Lloyd,1974;De Duve et ai.,iE974;Henning,i975 / Измерения рН, проведенные предлагаемым методом в отдельных лизосомах клеток культуры СПЭВ при увеличении концентрации БК в среде от 0.002$ до 0.01 показали, что среднее значение внутрилизосомального рН при этом не изменялось и составляло 5.8 ед (рис. 20);при дальнейшем увеличении концентрация НК в среде ( 0.05$) оно возрастало до 6.4 ед и появлялась диффузионная окраска цитоплазмы. Учитывая возможность подобного сдвига, измерения рН в лизосомах следует проводить при таких концентрациях БК в среде, которые не вызывают диффузной окраски клеток, т.е. являются физиологическими.
Нейтральный красный и гранулообразование в клетках.
Как мы уже говорили, процесс гранулообразования является удобным тестом на интактность клеток. Однако, сам механизм гранулообразования и причины его нарушения при действии на клетки различных агентов до сих пор не ясны. Накопление НК в гранулах, происходящее против градиента концентрации, свидетельствует о зависимости этого процесса от энергетики клетки. Однако, по-видимому, не само накопление красителя требует затрат энергии,, а создание в лизосомах кислой среды, благодаря которой и осуществляется концентрирование НК в гранулах. Тем не менее, строгой зависимости снижения интенсивности гранулообразования от уменьшения уровня АТФ в клетках не обнаружено. Одни авторы считают, что гранулоообразование зависит от энергии, вырабатываемой в ходе окислительного фосфорилирования /Насонов, Александров, :: 1940/, другие отводят ведущую роль гликолизу Дирьянова, Зеленин, I970;Robbins, Marcus,1963/. Так,Кирьянова и Зеленин показали, что ряд ингибиторов (ДНФ, арсенат натрия и др.) в дозах, специфически разобщающих окислительное фосфорилирова-ние и дыхание, не влияли на накопление НК в лизосомах. На основании этого авторы делают предположение, что гранулообразо-вание обеспечивается энергией за счет гликолиза. В работах Панова и Розовской проведено сравнительное изучение влияния на гранулообразование целого ряда различных ингибиторов энергетического метаболизма клеток: 2,4-динитрофенола (ДНФ), амитала, моноиодацетата (МИА), карбонилцианид-трифторфенилгидразона, цианида и др. Этими авторами показано, что при действии некоторых из них, например, ингибитора гликолиза МИА, наблюдалось полное отсутствие гранул в дяффузно окрашенной цитоплазме, хотя уровень АТФ в клетках был достаточно высоким - 73% от контрольного. С другой стороны, такие дыхательные яды как цианид и амитал, вызывающие полное прекращение дыхания, не влияли на гранулообразование /Панов, Розовская, 1977 а; 1977 б/. Однако, до сих пор не была исследована зависимость процесса гранулообразования от величины рН в клеточных компартментах. В связи с этим нами было проведено изучение действия повышенных концентраций НК, буферов с разными рН и ряда ингибиторов энергетического метаболизма на внутриклеточные рН. Ш.З. Материал и методы. Работа выполнена на клетках культуры СПЭВ, фибробластах китайского хомячка клон 237 и клон 431 линии d-ii-P и первичной культуре эмбриональных куриных фибробластов, it и Ш пассажи /Султанова и др.,1968; Eidus et ai., 1977/.
Клетки выращивали на покровных стеклах, размером 9x18 мм, в пенициллиновых флаконах на среде 199 (СПЭВ), среде 199 и Игла в соотношении 1:1 (фибробласты китайского хомячка) и среде Игла с 1% глютамина (куриные фибробласты), во всех случаях с добавлением 10$ сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков - 100 ед пенициллина и 50 ед канамицина. Посевная доза-80-100 тыс.кл/мл. В каждый флакон наливали по 2 мл взвеси клеток. Для всех экспериментов культуру после пересева помещали на одни сутки в 37С, чтобы клетки нормально прикрепились, распластались на стекле и начали расти. Через сутки флаконы с культурой вынимали из термостата и все измерения проводили в условиях комнатной температуры. Возраст культуры считали от момента пересева. Клетки культуры сохранялись в условиях комнатной температуры в течение нескольких суток: не сползали со стекла, не теряли способности к гранулообразованию при окраске физиологическими концентрациями НК, лизосомы сохраняли способность к слиянию друг с другом, что несколько раз удавалось наблюдать в процессе работы. Для определения рН лизосом покровные стекла с клетками окрашивали при комнатной температуре в течение 15 минут НК в физиологических концентрациях (0.002-0.01$), который разводили на инкубационной среде, взятой из флакона, где росла культура (рН среды 7.0-6.9). Объем добавляемого 0.1$ или 1% водного раствора НК не превышал 1/10 от общего количества разводимого раствора. Продолжительность окрашивания клеток НК выбрали, исходя из следующих соображений, БК проникает в клетки очень быстро / Левин и др., 1968/. В наших экспериментах уже через 3-5 секунд после начала окрашивания (наблюдения за окрашиванием клеток на камере) появлялась диффузная окраска цитоплазмы, а через 7-15 секунд начинали окрашиваться гранулы. По данным ряда авторов за первую минуту в клетку входит половина того количества красителя, которое накапливается в ней за 15 минут окрашивания. При дальнейшем увеличении продолжительности окрашивания до 24 часов накопление красителя в клетках возрастает всего на 2-3% /Семеньков, 1970; Панов, Розовская 1972/. Следовательно, 15-минутной инкубации в растворе красителя вполне достаточно, чтобы считать окрашивание законченным; в то же время, проведение экспериментов и измерений рН в клетках в течение 2-3 часов в присутствии НК не приведет к сколько-нибудь существенному изменению концентрации индикатора в структурах живых клеток. После окрашивания покровное стекло с клетками и каплей среды окрашивания помещали клетками вниз на предметное стекло и герметически заклеивали резиновым клеем. . -Такой препарат не подсыхал в течение суток, и клетки не меняли своего вида. остановка опытов шла по единой схеме: окрашивание живых клеток НК, монтаж препарата на предметное стекло или камеру, измерение исследуемых объектов через каждые 3-8 минут в течение 40-180 минут для определения среднего рН структуры. Во всех экспериментах клетки находились в среде окрашивания, чтобы предотвратить выход из них НК.
Запись спектров в диапазоне длин волн 400-700 нм и измерение оптических плотностей D 450 и - 470 ПР0ИЗВДИЛИ на спектрофотометре МАНН при стороне квадратного измерительного зонда 0.5, 0.9, 1.0 и I.I мкм и увеличении 90x10. На каждом препарате производили многократные измерения рН небольшого числа объектов в течение длительного времени или однократные измерения многих лизосом. Размер измерительного зонда выбирали так, чтобы он свободно вписывался в гранулу. Зонд сравнения устанавливали на свободном от клеток участке препарата. Большая часть измерений проведена с зондом I мкыг. Результаты измерений обрабатывали следующим образом. Строили графики изменения рН и D Q ЛИЗОСОМ И цитоплазмы во времени, по которым изучали характер изменения указанных параметров. Среднее во времени значение рН структуры ( рНл, pEL)получали путем усреднения значений рН, измеренных в ней в течение всего эксперимента или части его, проведенной в одинаковых условиях. Среднее значение рН по всем лизосомам при одинаковых условиях эксперимента ( рН _) определяли путем усреднения сред-них значений рН для отдельных лизосом. Так же поступали при измерении рН в цитоплазме. Размах колебаний значений рН объекта вычисляли по графикам как разность между соседними максимальными и минимальными значениями рН в данной структуре. Период колебаний рН определяли как среднее время между соседними максимумами или минимумами на той же кривой. Достоверность различий в величине рН определяли по критерию Стьюдента. Градиент рН между цитоплазмой и лизосомами (ДрЕи_л) вычисляли как разность между соответствующими значениями рН. Размер лизосом оценивали визуально путем сопоставления с размером измерительного зонда? Результаты измерений выражали в относительных единицах, поскольку при таком способе определения размеров объекта, мы сочли некорректным пользоваться размерами, выраженными в мкм, предпо- - Io4 -Всего на приборе МАРШ произведено измерение динамики в 288 лизосомах и 122 участках цитоплазмы клеток культур тканей. В некоторых вариантах опытов оценивали гранулообразую-щую способность клеток, определяя число гранул (лизосом) в клетках после окраски в НК, Поскольку прибор МАРШ является уникальным лабораторным образцом, была проверена возможность использования промышленных приборов для определения рН клеток предлагаемым методом. При разработке метода было выяснено, что можно использовать любые микрофотометры, в конструкции которых имеется высококачественный монохроматор, предусмотрено визуальное наблюдение измерительного зонда,т.к. оператор должен видеть положение зонда относительно измеряемой структуры, и возможно быстрое измерение оптических плотностей объекта в двух длинах волн с коррекцией по светопропусканию фона.
Длияние различных агентов на рН внутриклеточных структур
Это сопровождалось уменьшением размаха колебаний рН в лизосо-мах до 0.6 ед и увеличением в них концентрации НК, о чем свидетельствовало возрастание D 470 Если увеличение концентрации НК производилось непосредственно в ходе эксперимента после предварительной окраски клеток 0.01$ НК, то рост среднего рН лизосом зависел от его начального значения: если при окраске 0.01$ НК рН лизосомы был довольно высоким, то при повышении концентрации НК в среде увеличение внутрилизооомального рН оказывалось незначительным, и наоборот (рис. зб ). При увеличении концентрации НК наблюдалось также появление диффузной окраски цитоплазмы, ядра и ядрышек. Наиболее интенсивно окрашивались ядрышки, наиболее бледно-ядра. Цитоплазма окрашивалась по-разному, от слабо диффузной окраски, оптическую плотность которой нельзя было достаточно точно измерить, до интенсивно розово-оранжевого тона, на котором часть гранул оказывалась не видна. Поэтому число различимых на фоне цитоплазмы гранул уменьшалось в 2-3 раза: с 50-60 до 20-30 лизосом на клетку. Появление окраски цитоплазмы коррелировало со снижением в ней среднего рН с 7.0 до 6.7 (рис. 36 ). Близкие результаты получены в аналогичных опытах и на приборе "Унивар" - 6.8. При измерении рНц была обнаружена гетерогенность значений рН как в разных клетках одного препарата, так и в различных участках одних и тех же клеток. Размах изменений величины рй_ в популяции составлял 7.28-6.50. В индивидуальных клетках вариабельность значений рН достигала 0.4-0.5 ед. Наши наблюдения подтверждаются работами других авторов. Так, Валет и соавторы с помощью проточной флуориметрии показали, что размах изменения величины рН клеток костного мозга крыс составлял от 4.948.0 ед при среднем значении для всей популяции, равном 7.2 ед/ Valet et ai., 1981/. Вариабельность значений рН в индивидуальной клетке от 6.1 до 7.2 показана недавно у дрожжей с помощью оригинального метода фотографической флуориметрии / siavik,i983 /. Увеличение рН лизосом и закисление цитоплазмы приводило к уменьшению градиента рН между ними, что, по нашему мнению, было главной причиной угнетания процесса гранулообразования в клетках. Аналогичное предположение о преимущественной роли закислення клеток в нарушении гранулообразования высказывается в работе Фельдман / Фельдман, 1953/. Ш» «2._%ияние_ Н среды на_величину; Е щзосом итоплазш.
При замене среды окрашивания с 0.01$ НК на такую же, содержащую буфер с рН 4.0, количество нейтральной формы НК в среде резко снижалось, в связи с чем наблюдали частичный выход красителя из гранул. Это приводило к окрашиванию цитоплазмы сначала вокруг лизосом, а затем окраска распространялась на всю клетку. Величина рНл в среднем уменьшалась до 4.8, a pEL - до 6.II ед (рис. 38 ). Градиент рН между этими структурами практически не изменялся. Визуально оцениваемое число гранул несколько уменьшалось, т.к. часть лизосом становилась не видна на фоне окрашенной цитоплазмы. Если производили окрашивание клеток-в 0.01$ НК при рН 4.0, то число гранул оказывалось очень небольшим (рис.39 в ). Цитоплазма в этих условиях оставалась бесцветной, хотя, по-видимому, происходило её закисление, т.к. в клетках увеличивалось светопреломление ядер и ядрышек, которое наблюдалось и в первом ва- рианте опыта, а также описано Насоновым и другими исследователями при закислении клеток /Насонов, 1963/. По-видимому, из-за очень малого количества нейтральной формы индикатора в среде, концентрация НК в цитоплазме была очень низкой, и окраски не было видно. В первом варианте опыта окрашенные: НК лизосомы являлись, по-видимому, внутриклеточным источником красителя, который частично перераспределялся в клетках при закислении цитоплазмы под влиянием рНс. Во втором - вход НК в клетки, оказывался резко сниженным, и можно предположить, что накопление НК происходило только в тех гранулах, в которых рН был кислее, чем в среде. Зависимость интенсивности гранулообразования от количества нейтральной формы индикатора в среде хорошо иллюстрируется на рис.39. При замене среды с рН 4.0 на среду с рН 7.1 наблвдалось возвращение рНц к исходному уровню, сопровождавшееся обесцвечиванием цитоплазмы, и повышение рН до 6.15(рис. 38). Число гранул не отличалось от контрольного. Градиент рН между цитоплазмой и лизосомами приближался к исходному, но не достигал его уровня. Возможно, более емкий, чем в инкубационной среде , буфер оказал некоторое влияние на рНл, вызвав в них небольшой подъём величины рН. При изменении кислотности среды с помошью буферов было проведено определение скорости изменения рНл и рНц. При рН 4.0 скорость закислення лизосом составляла в среднем 0.15 ед рН/мин. при общей вариабильности от 0,04 до 0.26 ед рН/мин. При последующем защелачивании среды средняя скорость увеличения рНл составляла 0.18 ед рН/мин., а размах изменений - от 0.06 до 0.40 ед рН/мин, т.е. максимальная зарегистрированная скорость изменения рНл составляла 0.40 ед рН/мин. В цитоплазме средняя скорость повышения или понижения рН составляла 0.06 ед рН/мин при размахе от 0.02 до 0.09. Таким образом, скорость изменения рН в лизосомах примерно в 3 раза выше, чем в цитоплазме (различия достоверны с р 0.01 ) Отсвда можно предположить, что буферная емкость цитоплазмы выше, чем буферная емкость лизосом . Щ.6.3.Действие протонофоров_на величину рН лизосом и цито шіазмн__клеток.
Действие ДНФ. В- течение первых 30 минут после введения ДНФ рНл увеличивался в среднем до 6.4 ед, а рЕ снижался до 6.7-6.6 ед (рис. 40 ). Это приводило к снижению градиента рН между ними с 1.2 ед в контроле, до 0.2-0.3 ед. Число гранул в клетках уменьшалось в 4-5 раз по сравнению с контролем (таблица В 15 ). При более длительном воздействии ДНФ (40-60 минут) pIL снова уменьшался, опускаясь до 5.2, а цитоплазма пе-реставала окрашиваться ЙК, что свидетельствовало об увеличении её рН. Это приводило к увеличению градиента рН между ними, что сопровождалось усилением гранулообразования почти до нормы. Такая двухфазная реакция на введение ДНФ и явилась, по-видимому, причиной расхождения данных разных авторов о действии ДНФ на процесс гранулообразования /Зеленин, 1971; Панов, Розовская, 19776/. Однако, описанная картина наблюдалась не всегда. В некоторых опытах диффузная окраска клеток сохранялась до конца эксперимента и усиленна гранулообразования не наступало. Возможно, это объясняется различным физиологическим состоянием клеток культур В первом случае клетки "справлялись" с дей- ствием ингибитора за счет компенсаторного усилия работы протонных насосов. Во втором такого явления, по-видимому, не наступало, и в клетках сохранялась диффузная окраска. Действие КЦХФ. Действие КЦХФ на внутрилизосомальный и ци-тошгазматический рН изучали в серии экспериментов с заменой инкубационной среды после окрашивания в 0.1$ НК на такую же с различными значениями рН: 5.57, 5.95, 6.45, 7.06. Окраска 0.1$ НК применялась в этих экспериментах для возможности измерения рБц при всех pHQ. Измерения показали, что 2"ЮМ КЦХФ выравнивал рН среды и цитоплазмы в интервале pHQ от 7.15 до 5.95 ед (рис. 27 ), т.е. в той области, где его активность достаточно велика. /stiiiweii,Doranvi980;J[H6epMaH, Топалы, 1968/. При рН= 5.57 и ниже КЦХФ менее активен и полного выравнивания pBL и рНс не происходило. Влияние КЦХФ на рНл и pEL при окраске 0.01$ НК выражалось в повышении рНл, снижении pEL и изменении уровня накопления НК в структурах: оптическая плотность D47O Уменьшалась в лизо-сомах и возрастала в цитоплазме. Градиент рН между лизосомами и цитоплазмой снижался до 0.2 ед. Гранулообразование заметно снижалось (табл.Л? 15 ), число гранул уменьшалось примерно в 5 раз. Возвращения к исходному состоянию не наступало.
