Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1.1. Функции клеток Лейдига 10
1.2. Регуляция функции клеток Лейдига 15
1.3. Клетки Лейдига in vitro 23
1.4. Лечение тестостерондефицитных состояний и бесплодия у мужчин 25
1.4.1. Гормональная терапия 27
1.4.2. Лечение тестерондефицитных состояний
и бесплодия у мужчин методом трансплантации .31
Глава II. Материалы и методы исследования 35
2.1. Получение суспензии клеток тестикул для культивирования 35
2.2. Определение количества и жизнеспособности клеток...36
2.3. Получение очищенной фракции клеток Лейдига 37
2.4. Морфологическая идентификация клеток Лейдига 38
2.5. Культивирование клеток Лейдига 38
2.6. Оценка возможных контаминации клеточных культур 39
2.7. Хранение клеток Лейдига 40
2.8. Использование замороженных клеточных культур 40
2.9. Трансплантация клеток Лейдига 41
2.10. Определение тестостерона в сыворотке крови 42
2.11. Обследование эякулята 45
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение 47
3.1. Оптимизация условий культивирования и хранения клеток Лейдига 47
3.2. Ксенотрансплантация клеток Лейдига экспериментальным животным 54
3.3. Применение ксеногеной трансплантации клеток Лейдига для лечения тестостерондефицитных состояний у мужчин 66
3.3.1. Лечение мужчин, страдающих эректильнои дисфункцией и бесплодием 67
3.3.2. Лечение мужчин, страдающих хроническим простатитом 73
Выводы 78
Литература 79
- Функции клеток Лейдига
- Лечение тестостерондефицитных состояний и бесплодия у мужчин
- Получение суспензии клеток тестикул для культивирования
- Оптимизация условий культивирования и хранения клеток Лейдига
Введение к работе
Спектр нарушений мужской половой системы включает в основном крипторхизм, миоплазию полового члена, гипоплазию и аплазию семенных пузырьков, предстательной железы, моно- и анорхизм, различные варианты гипоспадии. Пороки развития мужской половой системы сопровождаются тестостерондефицитными состояниями (ТДС) и приводят к бесплодию. Наряду с пороками развития инфертильное состояние мужчин связано с воспалительными заболеваниями половых органов, влиянием вредных факторов внешней среды, аллергическими заболеваниями, бесконтрольным и широким применением лекарственных средств, злоупотреблением алкоголем и никотином и пр. Бесплодие является одной из ключевых проблем андрологии. Проблема мужского бесплодия приобретает в последние годы особую медицинскую и социальную значимость, так как удельный вес бесплодных браков в мире достигает 15%, половина из которых обусловлена бесплодием у мужчин [39].
Полиэтилогичность ТДС и мужского бесплодия, сложность развития заболеваний, функциональная взаимосвязь мужских гонад со всеми системами и органами создают большие трудности в разработке адекватных методов лечения нарушений сперматогенеза.
С давних пор пытаются лечить ТДС и бесплодие у мужчин пересадкой мужской половой железы [6, 17, 18, 31, 43, 81]. В настоящее время вместо пересадки целой железы начинают применять трансплантацию андрогенпродуцирующих клеток Лейдига (КЛ) [21, 92, 19], что обусловлено прогрессом в изучении функций различных клеток семенников, успехами выделения и культивирования клеток. Кроме того, нарушения сложных молекулярных внутриклеточных и
межклеточных взаимодействий лучше компенсируются клетками, чем отдельными фармпрепаратами.
Интерстициальные КЛ семенников синтезируют андрогены, с чем связано их влияние на дифференцировку и функцию клеток мужской половой системы. Нарушение сперматогенеза, многие заболевания яичек и нарушение репродуктивной функции можно рассматривать как следствие нарушения активности КЛ. Поэтому чрезвычайно актуальным является разработка методов культивирования и способов трансплантации КЛ для лечения ТДС и бесплодия у мужчин.
Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было:
изучить возможность трансплантации без иммуносупрессорной терапии ксеногенных КЛ экспериментальным животным;
разработать оптимальные методы трансплантации КЛ;
изучить эффективность трансплантации для лечения ТДС у экспериментальных животных;
4. использовать полученные экспериментальные результаты для
лечения мужчин, страдающих ТДС и бесплодием.
При этом поставлены следующие задачи исследования:
разработать методы забора и хранения трансплантируемого материала;
разработать способы хирургической трансплантации КЛ;
изучить условия культивирования и их влияние на биологическую активность КЛ;
осуществить ксеногенную трансплантацию К Л экспериментальным животным;
осуществить наблюдение за эффективностью трансплантации;
осуществить трансплантацию КЛ мужчинам, страдающим ТДС и бесплодием;
осуществить наблюдение за успешностью лечения мужчин с помощью трансплантации КЛ.
Функции клеток Лейдига
КЛ секретируют андрогены, которые синтезируются из холестерина. Холестерин сначала превращается в прегненолон, в результате удаления боковой Сгі-цепи, а затем через прогестерон - в несколько андрогеновых веществ (рис.1).
Первые стадии процесса превращения холестерина в тестостерон (Т) катализируются ферментным комплексом, обнаруженным во всех тканях, образующих стероидные гормоны. Реакции являются уникальными для этих тканей и осуществляются в митохондриях. Ферментный комплекс включает холестериндесмолазу, требующую NADP, Mg2+ (или Са 2+) и цитохром Р-450; образующийся в результате прегненолон является главным предшественником всех стероидных гормонов. Он проявляет регуляторное действие (по типу обратной связи) на стероидогенез из холестерина, ингибируя начальную стадию (гидроксилирование боковой цепи), которая является скоростьлимитирующей при биосинтезе стероидов. Ферментативное оксигенирование по С22 может происходить одновременно с расщеплением связи между углеродами 17 и 20. Ферменты, участвующие в последующих превращениях прегненолона, находятся в эндоплазматическом ретикулуме клеток. Скоростьлимитирующие стадии - гидроксилирование холестерина и расщепление боковой цепи стимулируются гипофизарными гонадотропинами [42]. КЛ и клетки Сертоли также способны превращать Т в эстрадиол [76]. К Л синтезируют и другие биологически активные вещества: пропиомеланокортин, мелатонин, которые включаются в паракринную/аутокринную регуляцию функции яичка. Синтез тестикулярного пропиомеланокортина и его метаболитов находится под контролем гипофизарного лютеинизирующего гормона (ЛГ) [73].
КЛ (зрелые клетки крыс in vitro) способны также продуцировать окситоцин. Продукция окситоцина, как и Т, стимулируется ЛГ, что не опосредовано Т, хотя последний также увеличивает продукцию окситоцина [60].
Главными гормонами семенников являются Т и дигидротестостерон, однако известен ряд соединений - стероидов также обладающих андрогенной активностью (рис. 2) [42].
Именно с секреторной функцией КЛ связывают их влияние на дифференцировку и функцию клеток мужской половой системы. Так молинат ( 40 мл/кг) вызывает значительное уменьшение концентрации циркулирующего Т, а КЛ являются местом сорбции меченого молината. Нарушения сперматогенеза, заболевания яичек и нарушения репродуктивной функции можно рассматривать как следствие нарушения активности КЛ [59].
В опытах на крысах показано, что индукция экспрессии генов ферментов синтеза и деградации стероидов происходит не одновременно, но посредством последовательного изменения экспрессии генов ферментов биосинтеза и деградации Т. Например, 5а-андростан-За,17(3-диол, является преимущественным андрогеном, синтезируемым неполовозрелыми крысами, тогда как Т - андроген, синтезируемый взрослыми животными. В результате во время пубертатного периода секретируются разные конечные андрогенные продукты [62].
Продукция Т уменьшается с возрастом [40, 55], что не связано с изменением числа КЛ, уровнем ЛГ, содержанием зародышевых клеток. Уменьшение продукции Т, вероятно, связано с дефектом стероидогенного пути от рецептора ЛГ к сАМР-каскаду [55].
Кроме возрастного, снижение эндокринной функции семенников наблюдали у крыс с наследственной галактоземией [34].
КЛ (и клетки Сертоли) синтезируют также ингибин. Ингибин -соединение нестероидной природы с молекулярной массой 10000 Да. Это соединение предупреждает гипертрофию гипофиза у самцов животных при ТДС [42]. Изменения в плазме крови концентрации ингибина коррелируют с репродуктивной активностью животных [80].
Гипоталамус играет важную роль в регуляции функции семенников, секретируя различные количества гонадотропин-рилизинг-фактора (ГРФ). Гипоталамус представляет собой звено, посредством которого центральная нервная система влияет на репродуктивную функцию. От уровня ГРФ зависят уровни ЛГ и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) гипофиза. Представление о том, что функции семенника зависят от функции гипофиза, возникло на основе экспериментов, выполненных Филипом Смитом в период между 1920 и 1930 гг. Он показал, что размеры семенников резко уменьшаются после удаления гипофиза, причем уменьшение затрагивало оба компонента семенника - семенные канальцы, в которых образуются сперматозоиды, и межканальцевую ткань, содержащую КЛ, в которых синтезируются стероидные гормоны [27]. Два гормона передней доли гипофиза: ФСГ и ЛГ, которые впервые обнаружили J.Greep и О. Fevold [64], предотвращают атрофию семенников у гипофизэктомированных крыс. ФСГ действует на семенные канальцы, а ЛГ - на КЛ [27].
Как становится ясно из исследований последних лет, многие молекулярные механизмы играют роль в дифференцировке и регуляции секреторной функции КЛ. Секреция андрогенов контролируется преимущественно ЛГ передней доли гипофиза и опосредовано рецептором ЛГ [21, 94]. Мутации рецептора ЛГ приводят к изменениям активности КЛ, их количества и согласуются с клиническим фенотипом пациентов [76, 99]. ЛГ индуцирует синтез вторичных мессенджеров: сАМР, циклических инозитолфосфолипидов. Ионы Са способны модулировать биосинтез Т [68].
Хорионический гонадотропин (ХГ), являющийся гормоном плацентарного происхождения, стимулирует секреторную активность КЛ подобно ЛГ [42], причем остаткам сиаловой кислоты человеческого ХГ (чХГ) принадлежит большая роль в стимулирующем эффекте (но не в связывании с рецептором), особенно при взаимодействии чХГ с гетерологичными рецепторами крыс [49].
Известно, что снижение функции щитовидной железы сопровождается нарушениями в мужской половой сфере.
Экспериментально выявлено, что количество Т в крови и яичках, а также активность 3-[3- и 17-(3-гидроксистероидных дегидрогеназ КЛ у гипотиреоидных крыс снижены. Гипотиреоидизм был спровоцирован у животных в препубертатном периоде. Стимулирующий эффект ЛГ на стероидогенную активность КЛ и синтез сАМР также обратимо тормозились. Все эти изменения снимались при введении L-тироксина. Таким образом, препубертатный гипотиреоидизм подавляет как фоновую, так и стимулированную активность КЛ [48]. Гипотиреоидизм приводит также к гипотрофии зародышевых КЛ и уменьшению образования зрелых КЛ в яичках крыс в неонатальном периоде, то есть тиреоидные гормоны играют регуляторную роль в дифференцировке клеток-предшественниц в КЛ и становлении популяции зрелых КЛ [79].
Лечение тестостерондефицитных состояний и бесплодия у мужчин
По степени тяжести неблагоприятных социальных последствий Всемирная Организация Здравоохранения поставила проблему мужского бесплодия сразу вслед за проблемами онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний. Согласно современным представлениям, для определения лечебных мероприятий с учетом полиэтиологичности и полипатогенетичности тестостерондефицитных состояний и мужской фертильности предложена классификация бесплодия у мужчин [39]: 1) секреторное бесплодие: а) первичная недостаточность яичек (вследствие поражения самих яичек врожденного и приобретенного генеза) б) вторичная недостаточность яичек: центрального происхождения (вследствие поражения гипоталамо-гипофизной области и других отделов центральной нервной системы (ЦНС); дискорреляционная недостаточность яичек (вследствие нарушений функций эндокринных желез и других внутренних органов); 2. экскреторное бесплодие: а) заболевание и пороки развития мочеиспускательного канала и придаточных половых желез, б) экскреторно-обтурационное бесплодие (вследствие врожденной и приобретенной обструкции семевыносящих путей); в) асперматизм; 3. иммунное бесплодие (аутоиммунное, изоиммунное); 4. сочетанное бесплодие (секреторная недостаточность половых желез в сочетании с воспалительными, обструктивными и иммунными процессами); 5. относительное бесплодие (при отсутствии, несмотря на тщательное обследование супругов, причин вызывающих бесплодие).
После выявления нарушений функции половых желез на основании жалоб, анамнеза, исследования эякулята, секрета предстательной железы, исследования эндокринной функции системы гипофиз-гипоталамус-яичко и проведенной при необходимости биопсии, генитографии возможен конкретный диагноз и назначение соответствующей терапии.
Тактика лечения конкретных нарушений мужской половой функции определяется характером и степенью тяжести патологии, особенностями физического и психического статуса пациента и зачастую носит симптоматический характер.
Для лечения секреторного бесплодия употребляют андрогенные препараты в случае гипергонадотропного гипогонадизма. Андрогены способны подавлять секрецию гонадотропных гормонов и восстанавливать сперматогенную функцию. Лечение гипогонадотропного гипогонадизма заключается в основном в применении препаратов гонадотропинов иногда в сочетании с препаратами Т. Если применение препаратов гонадотропинов не стимулирует андрогенную функцию яичек, то проводят заместительную терапию Т и другими андрогенами. Лечение экскреторнго бесплодия включает мероприятия, направленные на лечение заболеваний и осложнений заболеваний, которые приводят к ТДС и стерильности. После купирования воспалительного процесса в органах половой сферы проводится терапия, стимулирующая процесс сперматогенеза и андрогенную функцию яичек. При андрогенной недостаточности применяют препараты Т. При лечении сочетанного бесплодия также применяют терапию препаратами андрогенов. Итак, среди большого количества препаратов, предложенных для терапии различных форм ТДС и бесплодия у мужчин, основное внимание уделяется гормонам: андрогенам, антиэстрогенам, гонадотропинам, рилизинг-гормонам, ингибиторам секреции пролактина. В гормонотерапии можно выделить следующие направления:
1. метод заместительной терапии - введение гормонов для замещения их эндогенного дефицита;
2. метод блокирующей терапии - введение гормонов для подавления функции соответствующей железы (например, для подавления гиперфункции гипофиза);
3. метод стимулирующей терапии - введение небольших физиологических доз гормонов, оказывающих благоприятное влияние на обменные, воспалительные, иммунные и другие процессы в организме без выраженных изменений в системе гипоталамус-гипофиз-яички [37]. Лечение андрогенами проводится как заместительная терапия в случаях: первичного препубертатного гипогонадизма (орхидэктомия, ранняя функциональная кастрация, врожденный анорхидизм, дегенеративные синдромы); постпрепубертатного гипогонадизма (орхидэктомия, поздняя функциональная кастрация, тотальная атрофия яичек после грыжесечения, синдром Клайнфельтера); выраженный констицитуонной задержке развития (отставание костного возраста или пубертатного развития на 3-5 лет); импотенции, обусловленной дефицитом андрогенов; бесплодия (некоторых форм); недостаточного для определенного возраста насыщения сыворотки крови андрогенами (мужской климакс) [46]. Среди препаратов, предложенных для лечения бесплодия у мужчин андрогены играют значительную роль [89, 97], хотя возможности лечения бесплодия особенно ограничены [91].
Получение суспензии клеток тестикул для культивирования
Подсчет количества клеток и их жизнеспособности проводили при помощи светового микроскопа (рабочее увеличение 10x12) с использованием счетной камеры Горяева и красителя - трипанового синего. Раствор красителя 10.5% готовили на стерильном 0.85% растворе NaCl. Пробу суспензии клеток, объемом 100 мкл, стерильно отбирали в ламинарном шкафу, помещали во флаконы, вместимостью 5-10 мл, пипетировали и 10 мкл переносили в одну из лунок стандартной культуральной планшетки (48- или 9 6-луночной), добавляли 10 мкл раствора красителя, тщательно (40-50 раз) пипетировали, заполняли обе счетные камеры. Подсчет клеток вели последовательно в обеих счетных камерах, по всей площади каждой камеры. Считали все клетки в поле зрения: живые (неокрашенные) поврежденные (синего цвета). Результаты подсчитывали следующим образом: 1. X = Xi +Х2 где: X - общее количество клеток в счетной камере; X] - количество живых клеток; Х2 - количество мертвых клеток где: Хз - концентрация клеток в исследуемой суспензии, хЮ6 кл/мл 3 Р = —М00 X где: Р - % живых клеток в пробе. Пригодным для культивирования либо после культивирования пригодным для трансплантации считали тот образец, где уровень жизнеспособных клеток оказывался не менее 80-85%.
Индекс пролиферации (Ип) определяли как отношение количества клеток после определенного времени культивирования к количеству клеток, взятых для посева.
Сырой препарат КЛ очищали путем центрифугирования в непрерывном градиенте перколла. Стартовый раствор получали смешиванием 9 частей перколла и 11 частей (v/v) сконцентрированной в 1,8 раза среды 199, содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1% пенициллина (100 ед/мл) или канамицина в той же концентрации. Формировали непрерывный градиент: 35 мл стартового раствора помещали в центрифужный стакан, объемом 50 мл, и центрифугировали при 20000g 60 мин при 4С. Для разделения клеток на верхний уровень градиента наносили 2 мл клеточной о суспензии с концентрацией жизнеспособных клеток 0,5" 10 кл/мл и центрифугировали при 800g в течение 20 мин при 4С. Верхние 27 мл градиента не содержали КЛ. Следующие 3 мл отбирали, переносили в стерильную центрифужную пробирку, содержащую 9 мл среды 199 с 0,1% БСА, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 25 мл HEPES. Центрифугировали 15 мин при 150g и комнатной температуре. Супернатант отбрасывали; осадок промывали 10 мл среды для культивирования и центрифугировали 5 мин при 300g. Клетки ресуспендировали, проводили морфологическую идентификацию и использовали для культивирования.
Идентификацию КЛ проводили путем их окрашивания, возникающего в результате реакции, катализируемой специфическим для КЛ ферментом - Зр-гидроксистероиддегидрогеназой (субстрат -дегидроэпиандростерон) в присутствиии тетранитросинего тетразолия. 1 мл клеточной суспензии инкубировали при 37 С в течение 100 мин с 0,3 мл окрашивающего раствора, содержащего 0,07 М фосфатный буфер, рН 7,2; 0,3 мл никотинамида; 1,8 мг никотинамиддинкулеотида; 0,45 мг тетранитросинего тетразолия и 0,3 мг дегидроэпиандростерона. Затем подсчитывали в камере Горяева под световым микроскопом количество окрашенных клеток и общее число клеток, определяли долю (в %) клеток, в цитоплазме которых обнаружены синие гранулы формазана (КЛ). При содержании в суспензии не менее 70% окрашенных клеток, суспензию использовали для культивирования КЛ.
При посеве 250-400 тыс. клеток помещал в 100 мл питательной среды 199 и инкубировали в течение 8-12 часов в термостате при 37С. Через 8-12 часов сливали среду, содержащую неприкрепившиеся клетки, элементы соединительной ткани, крови и др. компоненты. В культивационные матрасы добавляли свежую питательную среду 199 и снова помещали их в термостат. Следующие замены питательной среды проводили через каждые 24-48 часов. Проводили микроскопический контроль образовавшегося монослоя клеток и контроль питательной среды, чтобы исключить контаминацию клеточной культуры микробной, грибковой флорой и микоплазмой. Для предотвращения контаминации использовали предварительно прогретую в течение 30 мин (56С) СКРС и добавляли в ростовую среду гентамицин (1,6 мг/мл), канамицин или линкомицин (1,0 мг/мл).
Оптимизация условий культивирования и хранения клеток Лейдига
Результаты морфологических исследований показали, что при использовании градиента перколла удается получить клетки из семенников млекопитающих, содержащие 65-70% КЛ, которые были использованы для культивирования КЛ. Оптимизацию условий культивирования КЛ в монослое проводили по таким параметрам, как посевная концентрация клеток, состав питательной среды, продолжительность культивирования. Для трансплантации необходимо было получить достаточное количество (в 1 мл) функционально активных (синтезирующих тестостерон) КЛ. В качестве критериев были выбраны: количество выросших в 1 мл клеток (продуктивность), доля жизнеспособных клеток в культуре, концентрация тестостерона в культуральной жидкости. Найдено, что оптимальные значения посевных концентраций клеток находятся в диапазоне (3-4)-10 клеток в 1 мл.
Изучали зависимость роста и тестостеронсинтезирующей способности КЛ от содержания в среде 199 гидролизатов ряда белков, сыворотки крови телят, концентрации аминокислот и витаминов. В результате исследований получена оптимизированная пропись ростовой среды (табл. 2).
Из литературных данных известно, что наибольшей андрогенсинтезирующей способностью обладают КЛ эмбрионов и новорожденных [35], что подтвердилось и нашими исследованиями.
При культвировании, как было показано во многих работах, андрогенсинтезируюшая способность КЛ уменьшается [16, 71, 72]. В наших опытах клетки сохраняли функциональную активность, как и наибольшую способность к пролиферации, в течение 2-5 дней культивирования (1-3 смены среды), при более длительном культивировании уровень тестостерона в культуральной жидкости и индекс пролиферации уменьшаются (рис. 3 ,4, 5).
Процент жизнеспособных клеток был также высоким в первые 5-6 дней культивирования (98%), далее снижался, однако сохранялся на высоком уровне (80%) до конца культивирования. С использованием опыта криоконсервации клеточных суспензий [32, 45] удалось осуществить криоконсервацию КЛ.
При подборе условий криоконсервации изучали жизнеспособность и функциональную активность клеток в зависимости от режима замораживания (скорость замораживания и оттаивания) и концентрации криопротекторов (глицерина и диметилсульфоксида - ДМСО).
Оптимальным оказалось охлаждение со скоростью 10 в мин до - 80С с последующим погружением в жидкий азот (табл. 3).
Концентрация ДМСО при криоконсервации влияет на функциональную активность КЛ. Оптимальной оказалась 5% концентрация (табл. 4). Результатом аналогичных опытов с другим криопротектором - глицерином выявили его оптимальную для-состояния КЛ концентрацию - 10%.
Зависимость содержания тестостерона в культуральной жидкости при культивировании КЛ от концентрации ДМСО при предварительной криоконсервации КЛ. Наблюдения за культурой после криоконсервации показали, что при выбранных условиях хранения (см. раздел «Материалы и методы») жизнеспособность клеток сохраняется на уровне 88-96% в течение 18-22 месяцев. Более длительное хранение клеточных культур вызывает как снижение количества жизнеспособных клеток, так и уменьшение их андрогенсинтезирующей способности.
В результате оценки жизнеспособности, способности к пролиферации и функциональной активности КЛ при культивировании, хранении при низкой температуре (-70 С) и реконсервации были отобраны для трансплантации следующие клеточные культуры: 1. первичные культуры КЛ семенников африканской зеленой мартышки (особи пубертатного возраста), выдержавшие не более 1 смены питательной среды (24-48 час); 2. культуры К Л эмбриональных телят, выдержавшие не более 3 смен культуральной среды; 3. культуры КЛ новорожденных поросят, выдержавшие не более 3 смен культуральной среды.
