Введение к работе
Актуальность темы. В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных методов исследований в биологии и медицине стала визуализация различных процессов, происходящих в живых организмах, тканях или клетках в режиме реального времени с помощью флуоресцентных маркеров. Особое место среди них занимает зеленый флуоресцентный белок (GFP), его варианты и гомологи. Главными особенностями GFP-подобных белков при их использовании являются высокая стабильность и способность к формированию хромофора без участия кофакторов, ферментов или каких-либо субстратов, кроме молекулярного кислорода (Shaner et.al., 2007). Таким образом, образования хромофора и возникновения свечения возможно непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Оказалось, что N- и С-концы флуоресцентных белков (FPs) доступны для создания гибридных белков, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентного белка (FP) с белком-мишенью. При этом FP не оказывает влияния на локализацию и функцию исследуемого белка. Это свойство делает GFP-подобные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, которые стали незаменимыми инструментами для изучения взаимодействия белков, их локализации и транспорта, а также биосенсоров внутриклеточных метаболитов, позволяющих
9+
определять концентрацию Са и цАМФ, рН, мембранный потенциал, активность некоторых ферментов (например, каспаз, киназ и протеаз) в живой клетке (Stepanenko et.al., 2008).
Клонирование генов GFP-подобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальней красной областях спектра, явилось очередным этапом в использовании FPs для проведения исследований в области биологии (Matz et. al., 1999). Одновременное использование нескольких FPs с разными спектральными характеристиками привело к развитию современных методов исследований, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточном организме. Последующие научные исследования посттрансляционной химии, структуры и свойств GFP-подобных белков позволили разработать подходы к созданию новых FPs с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биотехнологии и клеточной биологии (Heim et.al., 1996).
Все красные FPs дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное
образование хромофора, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение FP. Поэтому получение оптимальных красных FPs является очень актуальной проблемой, решение которой значительно расширяет возможности применения FPs в биологии и биотехнологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных FPs является сочетание случайного и сайт-направленного мутагенеза с высоко эффективными техниками сортировки и отбора клеток. Данная стратегия уже была успешно использована для получения ряда FPs с заранее заданными физико-химическими характеристиками (Subach et.al., 2009а, b).
Практическая значимость красных FPs особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, так как свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Это объясняется тем, что вода, меланин и гемоглобин, основные вещества, которые поглощают свет в биологических тканях, имеют минимальный коэффициент экстинкции в диапазоне длин волн от 600 до 900 нм. Данный диапазон длин волн называется "оптическим окном" и является оптимальным для микроскопии биологических тканей и целых организмов (Konig, 2000). Более того, использование FPs с максимумом флуоресценции выше 600 нм может повысить чувствительность детекции флуоресценции. Это связано с тем, что автофлуоресценция клеток (прежде всего флуоресценция флавинов, витаминов, NAD(P)H) и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны света.
На данный момент одним из лучших методов, позволяющих получать высококачественное трехмерное изображение живых тканей на глубину вплоть до 1 миллиметра, является двухфотонная микроскопия (Zipfel et.ai, 2003). Суть двухфотонной микроскопии состоит в том, что возбуждение флуоресценции происходит с помощью инфракрасного лазера большой интенсивности, что приводит к поглощению флюорофором двух фотонов с длиной волны в два раза больше длины волны однофотонного возбуждения. Использование красных FPs в мультифотонной микроскопии может открыть новые возможности для проведения исследований живых тканей и целых организмов с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Однако красные FPs не могут быть эффективно возбуждены стандартным коммерчески доступным инфракрасным лазером, так как
спектры их двухфотонного поглощения лежат в более длинноволновой области относительно рабочего диапазона длин волн данного лазера (Drobizhev et.al., 2009). Возможным подходом к решению данной проблемы может быть разработка красного FP, спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, или, другими словами, красного FP с большим Стоксовым сдвигом (large Stokes shift, LSS).
В настоящее время существует острая необходимость дальнейшего развития методов визуализации биологических объектов для выяснения фундаментальных основ жизнедеятельности клеток в условиях нормы и патологий различного происхождения. Создание новых вариантов флуоресцентных белков с длиной волны флуоресценции более 600 нм и при этом характеризующиеся большим Стоксовым сдвигом является актуальной задачей, которая имеет большое теоретическое и практическое значение. Более того, сочетание подобных белков с зеленым или синим FPs может быть также использовано для многоцветной двухфотонной микроскопии, что позволит наблюдать за нескольким клеточными процессами одновременно. Введение этих белков в практику экспериментальной работы невозможно без выяснения механизмов, лежащих в основе спектральных свойств FP, а также изучения связи между их структурой и оптическими, а также биохимическими характеристиками. Понимание механизма большого Стоксового сдвига в GFP-подобных белках может позволить рациональный дизайн красных FPs с большим Стоксовым сдвигом на основе существующих стандартных FPs.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание на основе гена белка mKate (Scherbo et.al., 2007) новых мономерных красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, с длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, исследование связи особенностей первичной структуры новых белков с их спектральными свойствами и фотохимическими характеристиками. Оценить возможности практического применения новых красных FPs в белках слияния с различными клеточными белками в живых клетках в качестве флуоресцентного маркера для многоцветной одно- и двухфотонной микроскопии в тканях живых мышей.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. На основе гена мономерного красного FP mKate (длина волны флуоресценции 635 нм) методами молекулярного клонирования и эволюции создать по крайней мере
два новых красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, обладающих длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, названные LSS-mKatel и LSS-mKate2.
2. Измерить спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции, спектры
двухфотонного поглощения, определить величины фотостабильности, квантового
выхода, коэффициента экстинкции, скорости созревания хромофора и рН-
стабильности флуоресценции, исследовать олигомерное состояние LSS-mKate
белков. Сравнить полученные характеристики с соответствующими значениями для
единственного ранее опубликованного красного FP с большим Стоксовым сдвигом
mKeima (Стоксов сдвиг состовляет 180 нм) (Kogure et.al., 2006) и другими
страндартыми FPs других диапозонов флуоресценции.
Определить третичные структуры полученных LSS-mKate белков методом рентгеноструктурного анализа. Установить аминокислотные замены, ответственные за увеличение Стоксового сдвига флуоресценции, а также влияющие на биохимические характеристики новых LSS-mKate белков. Установить молекулярный механизм флуоресценции LSS-mKate белков.
Проанализировать возможности практического использования белков LSS-mKate в живых клетках путем создания и анализа экспрессии его химерных генетических конструкций с клеточными белками в культивируемых клетках млекопитающих, а также с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии показать возможности многоцветного мечения клеток новыми LSS-mKatel и LSS-mKate2 и известными красными FPs.
Исследовать возможности практиктического использования белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей и организмов.
Научная новизна полученных результатов. Созданы два новых мономерных красных FPs, названные LSS-mKatel и LSS-mKate2 и обладающие максимумами возбуждения около 460 нм и максимумами флуоресценции более 600 нм. Оба полученных LSS-mKate белка обладали улучшеными физико-химическими свойствами по сравнению с таковыми для единственного известного красного FP с большим Стоксовым сдвигом mKeima. Определены аминокислотные последовательности полученных белков. Установлены аминокислотные остатки, ответственные за сдвиг максимумов возбуждения в коротковолновую область и биохимические свойства новых белков.
Описаны спектральные и фотохимические свойства LSS-mKatel и LSS-mKate2. Измерены полупериоды формирования хромофора, эффективность созревания хромофора и рН-зависимость интенсивности флуоресценции для LSS-mKate белков. Установлено, что флуоресценция LSS-mKatel и LSS-mKate2 является самой рН-стабильной из всех известных красных FPs. Установлено влияние внесенных мутаций на структурно-функциональные изменения белка mKate, которые определяют флуоресцентные и биохимические свойства LSS-mKate белков в процессе молекулярной эволюции.
Впервые показано, при сравнении с аналогичными характеристиками уже существующего красного FP mKeima с большим Стоксовым сдвигом, LSS-mKate белки обладают существенными преимуществами для применения в клеточной биологии.
Были решены кристаллические структуры белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5 А. Изучены зависимости спектральных характеристик белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 от температуры, рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя. На основании полученных данных были предложены молекулярные механизмы большого Стоксового сдвига для LSS-mKatel и LSS-mKate2.
Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных FPs с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих стандартных красных FPs. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.
Показано, что новые LSS-mKate белки расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных FPs при использовании для многоцветной стандартной флуоресцентной микроскопии. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия тканей живых мышей с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Данный подход был использован для анализа взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли мыши как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Высокая фотостабильность LSS-mKate белков сделала возможным длительное наблюдение за отдельно взятой клеткой при ее миграции в раковой опухоли. Анализ полученных
изображенный показал поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных на расстояниях менее 40 мкм до ближайшего кровеносного сосуда.
Практическое значение полученных результатов. Практическое значение результатов диссертационной работы состоит прежде всего в том, что в ходе работы были получены новые белки LSS-mKate, которые могут быть эффективно использованы для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей. Спектральные характеристики LSS-mKate белков оптимальны для визуализации живых клеток и тканей с субклеточным разрешением в течение длительного времени. Белки LSS-mKate лишены таких серьезных недостатков, как склонность к агрегации в живых клетках, низкая рН-стабильность и остаточная зеленая флуоресценция и, таким образом, имеют большой потенциал применения в биотехнологии. Созданные FPs раскрывают новые возможности многоцветного мечения биологических объектов, поскольку могут быть эффективно спектрально разрешены с другими стандартными флуоресцентными белками. В паре с уже существующими синими FPs, LSS-mKate 1 и LSS-mKate2 могут использоваться для создания молекулярных биосенсоров, работающих на основе безизлучательного переноса энергии (FRET). Белки LSS-mKate возбуждаются стандартными синими лазерами 407 нм и 457 нм проточных цитофлуориметров, благодаря чему станут полезным инструментом для биомедицинских исследований. Предложенная схема рационального дизайна красных FPs с большим Стоксовым сдвигом может быть использована для получения других подобных FPs с улучшенными и заданными спектральными характеристиками.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлена на: The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting (San Francisco, США, 2008); VII Ежегодная Международная Молодежная Конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая Физика» (Москва, Россия, 2008); XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, 2009); Intern. Conf. «Biocatalysis-2009: Fundamentals&Applications» (Архангельск, Россия, 2009); III Международная конференция: "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, Россия, 2009).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 статей и 5 тезисов докладов на международных конференциях и симпозиумах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 120 страницы печатного текста, 29 рисунков, 5 таблиц, 153 ссылки.
