Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1. Туберкулез, сведения о заболевании 13
2.1.1. Определение 13
2.1.2. Классификация 13
2.1.3. Эпидемиология 19
2.1.4. Характеристика возбудителя туберкулеза 21
2.1.5. Патогенез туберкулеза 29
2.1.6. Диагностика туберкулеза 45
2.1.7. Профилактика туберкулеза 48
2.2. Создание новых противотуберкулезных вакцин 49
2.2.1 .Модификация штаммов БЦЖ 50
2.2.2. Создание ДНК-вакцин 51
2.2.3. Субъединичные вакцины 53
2.2.4. Предпосылки к созданию субъединичной вакцины на основе белков теплового шока 57
2.2.5. Выбор адъюванта 59
2.2.6. Теоретические предпосылки для создания конъюгированной противотуберкулезной вакцины на основе белков теплового шока и адъюванта полиоксидония 60
3. Материалы и методы исследования 62
4. Результаты и их обсуждение 79
4.1. Получение рекомбинантного белкаМ tuberculosis HSP70 79
4.2. Изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка HSP70, важных для последующей конъюгации с адъювантом 81
4.3. Очистка полученного рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 от эндотоксина 83
4.4. Изучение условий хранения белка HSP70 86
4.5. Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 на иммунный ответ на мышах 87
4.6. Повышение антигенных свойств рекомбинантного белка HSP70 за счет коньюгирования с полиоксидонием 91
4.7. Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием на Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ на мышах 94
4.7.1. Оценка гуморального (антительного) ответа 96
4.7.2. Оценка Т-клеточного ответа 98
5. Выводы 105
6. Заключение 107
7. Список цитированной литературы 111
- Туберкулез, сведения о заболевании
- Создание новых противотуберкулезных вакцин
- Получение рекомбинантного белкаМ tuberculosis HSP70
- Очистка полученного рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 от эндотоксина
Введение к работе
Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно уносит жизни более 1 млн. человек (Dye С. et al., 2005). В нашей стране туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее распространенных инфекций и представляет огромную опасность для здоровья населения. В последние годы туберкулез стал характеризоваться более тяжелым течением в сочетании с полирезистентностью возбудителя болезни Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным лекарствам (Попович В.К., 2005; Соловьева И.П., 1998).
Следовательно, одной из важнейших задач, стоящих перед современной медициной, является разработка новых методов предупреждения заболевания туберкулезом.
За последние годы был сделан ряд значительных открытий в области изучения патогенеза заболевания, особенностей его возбудителя.
Одним из значимых достижений науки последних двух десятилетий явилось открытие и изучение функций белков теплового шока. Данные несколько групп белков присутствуют в клетках любого организма и являются необходимыми в целом ряде процессов. Так, эти белки исполняют роль молекулярных шаперонов (т.е. являются белками -дуэньями), которые необходимы для приобретения биологически активных конформаций вновь синтезированными белками. У позвоночных белки теплового шока выполняют важные роли в иммунной системе, связываясь с антигенами патогенных микроорганизмов и антигенами, специфическими для злокачественных опухолей (Pierce S.K., 1994). Клетки иммунной системы имеют рецепторы к белкам теплового шока, в результате чего эти комплексы вызывают сильный иммунный ответ (Wang Y. et al., 2001). Кроме этого, сами по себе белки теплового шока патогенных микроорганизмов являются одними из наиболее сильных антигенов (Heikema A. et al., 1997; Zugel U. et al., 2001). Одним из наиболее перспективных направлений создания новых генно-инженерных вакцин является использование белков теплового шока либо как иммуногенов, либо носителей белков-иммуногенов.
Основным средством профилактики является вакцина БЦЖ (BCG -Bacille de Calmette et de Guerin) - живая противотуберкулезная вакцина из аттенуированного штамма микобактерий туберкулеза. Эта вакцина была создана в 1921 году французскими учеными Альбером Кальметом и Камиллом Гереном путем пассирования культуры микобактерий бычьего типа (М. tuberculosis typ. bovis). До настоящего времени вакцина БЦЖ является единственным препаратом, применяемым для специфической профилактики туберкулеза. Вакцина вызывает Т-клеточный иммунный ответ. Принцип защитного действия прививки против туберкулеза заключается в ограничении распространения возбудителя из места первичной инфекции гематогенным путем, что снижает риск развития заболевания и реактивации процесса. Вакцина БЦЖ обеспечивает защиту от форм первичного туберкулеза, она наиболее эффективна при введении до момента инфицирования. Эффективность защитного действия вакцины БЦЖ значительно варьирует, от высоких процентов предупреждения развития туберкулеза у детей (92-100%) (Митинская Л.А, 2001), у взрослого населения она не подтверждается (0 - 80%) (Grange J.M., 2000). Определенную проблему при применении вакцины БЦЖ составляет, во-первых, гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), индуцируемая вакцинацией, которую сложно отличить от ГЗТ, вызванной М. tuberculosis. Следовательно, использование туберкулина (комплекса белков туберкулезной микобактерии) в кожных тестах для диагностических и эпидемиологических целей, влечет за собой сложности, связанные с дифференциальной диагностикой собственно туберкулезной инфекции и поствакцинальной аллергии (Lowrie, D.B. et al., 1995). Во-вторых, поскольку БЦЖ является живой вакциной, ее применение противопоказано при иммунодефицитных состояниях (в т.ч. ВИЧ-инфекции), так как возможно развитие туберкулеза (Mustafa A.S., 2001).
Следовательно, перспективным является поиск новых методов профилактики туберкулеза, основанный на последних достижениях науки в области изучения возбудителя заболевания и его патогенеза.
Основные направления поиска новой противотуберкулезной вакцины лежат в сфере создания субъединичных вакцин в сочетании с разрешенными для применения у человека адъювантами. Субъединичными называют вакцины, которые содержат только отдельные компоненты патогенного микроорганизма - рекомбинантные белки или синтетические пептиды, содержащие основные эпитопы антигенов, активно распознаваемые иммунной системой хозяина. Достоинства субъединичных вакцин заключаются в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные эффекты в организме-хозяине. В качестве основного компонента для прототипа противотуберкулезной вакцины был выбран белок теплового шока М. tuberculosis, принадлежащий к семейству HSP70 (heat shock protein, молекулярная масса 70 кД).
Туберкулез, сведения о заболевании
По Международной классификации болезней выделяют три группы основных клинических форм туберкулеза: I. Туберкулезная интоксикация у детей и подростков. Туберкулезная интоксикация у детей и подростков возникает при заражении туберкулезом и развитии первичной туберкулезной инфекции без локальных проявлений, определяемых рентгенологическим и другими методами исследований.
II. Туберкулез органов дыхания. В этой группе объединяет следующие клинические проявления:
1) Первичный туберкулезный комплекс. Характеризуется развитием воспалительных изменений в легочной ткани, поражением регионарных внутригрудных лимфатических узлов и лимфангитом.
2) Туберкулез внутригрудных лимфоузлов развивается в результате первичного заражения туберкулезом у детей, подростков и взрослых молодого возраста. Реже возникает вследствие эндогенной реактивации имевшихся туберкулезных изменений во внутригрудных лимфатических узлах. Формы: инфильтративный, опухолевидный, «малые» варианты туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов.
3) Милиарный туберкулез легких характеризуется генерализованным образованием очагов, преимущественно продуктивного характера, в легких, печени, селезенке, кишечнике, мозговых оболочках. Реже милиарный туберкулез встречается как поражение только легких. Диссеминированный туберкулез легких характеризуется наличием множественных специфических очагов в легких; в начале заболевания возникает преимущественно экссудативно-некротическая реакция с последующим развитием продуктивного воспаления. В зависимости от пути распространения микобактерий туберкулеза различают гематогенный и лимфобронхогенный диссеминированный туберкулез. Оба варианта могут иметь подострое и хроническое начало болезни.
4) Очаговый туберкулез легких. Характеризуется наличием немногочисленных очагов, преимущественно продуктивного характера, локализующихся в ограниченном участке одного или обоих легких и занимающих 1 - 2 сегмента, и малосимптомным клиническим течением. К очаговым формам относятся как недавно возникшие, свежие (мягко очаговые) процессы с размером очагов менее 10 мм, так и более давние (фиброзно-очаговые) образования с явно выраженными признаками активности процесса.
5) Инфильтративный туберкулез легких. Характеризуется наличием в легких воспалительных изменений, преимущественно экссудативного характера с казеозным некрозом в центре и относительно быстрой динамикой процесса (рассасывание или распад). Клинические проявления инфильтративного туберкулеза зависят от распространенности и выраженности инфильтративно-воспалительных (перифокальных и казеозно-некротических) изменений в легких.
Создание новых противотуберкулезных вакцин
В качестве альтернативы БЦЖ рассматриваются самые разные разработки, от модификации способов получения вакцинного штамма до создания нового поколения вакцин с использованием методов генной инженерии.
Так, в 1984 году И.Л. Диким был разработан новый способ получения вакцинных штаммов микобактерий туберкулеза. Полученный этим способом новый вакцинный штамм «БК-Харьков» обладал более низкой аллергенностью, не вызывал специфической клеточно-тканевой реакции в зоне введения и во внутренних органах. Остаточная вирулентность данного штамма по сравнению с БЦЖ была в восемь раз ниже, «БК-Харьков» больше подвержен завершенному фагоцитозу «неиммунными» макрофагами здоровых, невакцинированных животных (Львова Л.В., 2001).
В 1996 г I. Guleria и соавторы изучили на мышах с комбинированной иммуной недостаточностью способность пяти ауксотрофных штаммов БЦЖ к диссеминации. Продолжительность жизни мышей, которым вводили бактерии из ауксотрофных штаммов превышала таковую у мышей, иммунизированных БЦЖ. Также была изучена протективная способность ауксотрофных штаммов БЦЖ на мышах линии BALB/c, заражаемых внутритрахеально или внутривенно вирулентными М. tuberculosis. Некоторые из изучаемых штаммов демонстрировали результаты, сопоставимые с таковыми для вакцины БЦЖ (Guleria I. et al., 1996).
S. Baumann из Max Planck Institute for Infection Biology, (Берлин, Германия) с коллегами представили новую модификацию вакцины БЦЖ, которая в эксперименте на мышах продемонстрировала большую эффективность в профилактике туберкулезной инфекции, чем традиционный препарат, в том числе на резистентные штаммы. Новый штамм, генетически модифицированный для создания этой вакцины, способен продуцировать белки, нарушающие целостность мембран фагосом макрофагов, осуществивших фагоцитоз. Последующая гибель макрофага вызывает активизацию клеток CD4+ и CD8+, то есть активизирует иммунитет значительно сильнее, чем применение традиционной вакцины БЦЖ. Тем не менее, существуют определенные опасения, что применение этой вакцины в случае наличия у пациента иммунодефицитных состояний, может вызвать развитие инфекции, что уже происходило при применении традиционной вакцины БЦЖ у людей, больных СПИДом (Baumann S. et al., 2006).
Данный подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген.
Одной из первых попыток ДНК-вакцинации против туберкулеза стала работа C.L. Silva и D.B. Lowrie 1994 года, продемонстрировавшая протективный эффект у мышей, вакцинированных макрофагами клеточной линии J774, трансфецироваными белком теплового шока HSP65 из М. leprae (Silva C.L., Lowrie D.B., 1994).
Сходные результаты были получены для вакцин, экспрессирующих один из секретируемых фибронектин-связывающих антигенов белка 85А (Ag85A) (Huygen К., 1996) и для антигена с молекулярным весом 38 кД (транспортер фосфата, PstS-1) (Zhu X., 1997).
С того времени было изучено большое количество антигенов-кандидатов для конструирования ДНК-вакцины на различных моделях (мыши, морские свинки, крупный рогатый скот). В основном использовались секретируемые антигены, однако некоторые несекретируемые антигены так же демонстрировали протективный эффект (например, белок HSP65 (Tascon R.E., 1996) и цитоплазматический фермент KatG (Li Z., 1999). Несмотря на то, что многие из этих антигенов вызывали иммунный ответ, результаты, сопоставимые с протективным эффектом вакцины БЦЖ были получены всего для нескольких антигенов. В частности, такие результаты демонстрировала вакцина на основе белка HSP65 (Tascon R.E., 1996; Lowrie D.B., 1997), а также вакцина на основе антигена 85А - части комплекса секреторных антигенов (состоящих из Ag85A, Ag85B, Ag85C), которые составляют главную фракцию секреторных белков в фильтратах культуры (Huygen К., 1996; Lozes Е., 1997; Baldwin S.L., 1998).
Однако в настоящее время не представляется возможным заявить о неоспоримой безопасности генной иммунизации. Судьба введенной в клетку молекулы ДНК точно неизвестна. Возможна, хотя и маловероятна, интеграция такой ДНК в геном хозяина с достаточно серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-либо важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Более вероятной судьбой введенной ДНК считается существование её в клетке в виде нереплецирующегося внехромосомного элемента с последующим разрушением.
Получение рекомбинантного белкаМ tuberculosis HSP70
Для целей данной работы ген HSP70, также несущий последовательность шести остатков гистидина, был клонирован в вектор pETl lc joy по сайтам рестрикции Ndel и Xhol.
Штамм Е. coli BL21/DE3 обеспечивал стабильный и достаточно высокий уровень экспрессии целевого белка.
Также нами были протестированы различные условия экспрессии белка HSP70 (различная температура роста культур, варьирование количеств индуктора /ас-промотора ИПТГ, продолжительность индукции). Оптимальными условиями экспрессии оказались: выращивание культур при +37С, индукция ИПТГ (до концентрации 1 мМ), продолжительность индукции - 3 часа.
Уровень экспрессии целевого белка составлял от 40 до 50% от общего клеточного белка (рис. 9, дорожка 4). Общий выход целевого белка при экспрессии составлял около 200 мг с литра культуры клеток, что соответствует 100 мг с грамма биомассы. Белок находился в растворимой фракции цитоплазмы. Белок полностью адсорбировался на носитель при очистке методом металло-хелатной хроматографии, за счет аффинного связывания шести гистидиновых остатков с ионами никеля. Чистота выделенного белка составляла не менее 95% (рис.9.) Концентрация белка в приведенном выделении составляла 1,33 мг/мл (по методу ВСА).
Как известно, конформация рекомбинантного белка может отличаться от той, которую он имеет в клетке (в данном случае, в составе М. tuberculosis), что может приводить к изменению его свойств.
Было изучено олигомерное состояние полученного рекомбинантного белка в растворе. Для этого белок подвергали гель-фильтрации и электрофорезу в нативных условиях. Гель-фильтрация в хроматографической колонке 1,2x30 см с носителем «Сефакрил S-300» показала, что белок выходит единым гомогенным пиком, при этом подвижность HSP70 соответствует его мономерной форме, в сравнении с использовавшимися стандартными белками и компонентами с известными молекулярными массами (рис.10.).
Электрофоретический анализ белка в нативных условиях (без добавления ДЦС-Na) может использоваться для определения олигомерного и конформационного состояния белков, так как условия анализа позволяют сохранить пространственную структуру большинства белков. Такой электрофоретический анализ белка HSP70 показывает присутствие только одной полосы, соответствующей мономеру, и полное отсутствие каких-либо других олигомерных форм и агрегатов с меньшей электрофоретической подвижностью (рис.11.).
Хотя проведенные тесты не свидетельствуют о сохранении нативной конформации белка, известно, что для неправильно свернутых и денатурированных белков характерна тенденция к агрегации. Отсутствие агрегации свидетельствует о сохранении основных конформационных свойств белка. Принципиальным для нашей работы является сохранение растворимости рекомбинантного белка и его стабильность в растворе как мономера, что важно для дальнейшего использования данного рекомбинантного белка в качестве основы для субъединичной вакцины.
Белок, получаемый в системе экспрессии в клетках кишечной палочки, содержит эндотоксин - липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который вызывает нежелательные побочные эффекты в организме человека. Его содержание не должно превышать нормы для препаратов, вводимых парентерально. Освободить получаемый продукт от эндотоксина позволяет использование аффинного сорбента, содержащего полимиксин В, который обладает высоким сродством к эндотоксину (Issekutz А.С, 1983). Для этого проводили хроматографию полученного препарата белка на указанном носителе.
Очистка полученного рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 от эндотоксина
Клеточный иммунитет является центральным звеном резистентности к туберкулезу. Для активации иммунного ответа к туберкулезной микобактерии необходимо представление белковых антигенов именно из этой бактерии.
Это представление осуществляют антиген-представляющие клетки (АПК). В процессе фагоцитоза АПК представляют пептиды из туберкулезных микобактерии на собственной поверхности с помощью молекул главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, МНС) II класса. Т- клетки хелперного ряда, несущие маркер CD4+, играют важную роль в формировании противотуберкулезного иммунитета. CD4+T лимфоциты распознают именно комплекс молекулы МНС II класса с пептидами антигенов. Активируясь, Т-лимфоциты-хелперы пролиферируют и секретируют различные цитокины. В частности, интерлейкин-2 (IL-2), стимулирующий пролиферацию как CD4+T-лимфоцитов (хелперов), так и цитотоксических С08+лимфоцитов (киллеров) и NK-клеток, и интерферон-у (IFN-y), который активирует макрофаги и влияет на В-клетки во время перемены класса так, что они начинают производить антитела IgG3, которые хорошо опсонизируют вирусы и бактерии и фиксируют комплемент. СБ8+лимфоциты распознают молекулы МНС I класса и играют важную роль при инфекционном процессе, вызванном колонизацией туберкулезных микобактерий. Одной из основных составляющих патогенеза туберкулеза является персистенция туберкулезных микобактерий в макрофагах. Цитотоксические С08+лимфоциты способны уничтожать инфицированные макрофаги, а также непосредственно уничтожать персистирующие внутри макрофагов туберкулезные микобактерий.
Нами был сравнен иммунный ответ на белок HSP70 у мышей, иммунизированных конъюгатом рекомбинантного белка HSP70 и полиоксидония и мышей, иммунизированных только рекомбинантным белком HSP70. В эксперименте было показано, что иммунизация конъюгатом значительно усиливает иммунный ответ (рис.17.)
Пролиферация Т-клеток достаточно сильная в случае иммунизациии только рекомбинантным белком HSP70 и еще более значительная при иммунизации конъюгатом. В обоих случаях имеются участки линейной зависимости от концентрации антигена. При иммунизации рекомбинантным белком HSP70 и при иммунизации конъюгатом пролиферация в обоих случаях превышала значение таковой для стандартного контроля стимуляции пролиферации (ФГА). ФГА известен как один из наиболее сильных стимуляторов пролиферации. Контроль использовался для каждой из групп мышей.
