Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Микроорганизмы- продуценты белка и физиологически активных веществ 8
1.2. Сырье и субстраты, используемые для культивирования микроорганизмов с целью получения белка 15
1.2.1. Глубинное культивирование с использованием отходов различных отраслей промышленности 16
1.2.2. Использование полимерных субстратов при твердофазном культивировании микроорганизмов 20
1.3. Биоконверсия лигноцеллюлозных субстратов грибами 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
2.1. Микроорганизмы 33
2.2. Реактивы, субстраты и материалы 34
2.3. Культивирование микроорганизмов 34
2.4. Микробиологические методы 36
2.5. Аналитические методы 38
2.6. Статистическая обработка 41
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ P. TIGRINUS ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ 42
3.1. Влияние условий культивирования на культурально-морфологические признаки гриба 42
3.2. Влияние условий культивирования на физиологические признаки гриба 57
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ P. TIGRINUS ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ 62
4.1. Изучение культурально-морфологических признаков гриба при различных условиях культивирования 62
4.2. Влияние состава питательной среды на выход биомассы гриба 77
4.3. Влияние источников углерода и азота на динамику биомассы P. tigrimis 80
4.4. Влияние температуры и рН среды культивирования на выход биомассы/5, tigrimis 87
4.5. Влияние промышленных и полимерных субстратов на рост гриба 91
4.6. Влияние условий культивирования P. tigrimis на изменение рН среды 96
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ P. TIGRINUS ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ 104
5.1. Рост гриба при культивировании на пшеничной соломе 104
5.2. Влияние возраста инокулята на рост и биосинтез белка грибом .. 111
5.3. Биодеградация лигноцеллюлозного компонента пшеничной соломы при воздействии P. tigrimis 117
5.4. Обогащение соломы грибным белком 127
ВЫВОДЫ 134
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 135
- Микроорганизмы- продуценты белка и физиологически активных веществ
- Микроорганизмы
- Влияние условий культивирования на культурально-морфологические признаки гриба
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из задач современной биотехнологии является восполнение белкового дефицита в животноводстве. Источником увеличения ресурсов белка может быть промышленное производство мицелия высшего базидиального гриба Partus tigrinns, который по вкусовым и питательным качествам обладает преимуществом перед многими продуктами растительного, микробного и животного происхождения. Выращивание гриба можно вести на соломе, которая является сельскохозяйственным отходом и мало используется.
Использование грибов на основе прямой биоконверсии природных полимеров, к сожалению, не находит широкого применения. Разобщена информация, характеризующая грибы с точки зрения перспективности введения в культуру. Не в полной мере освещены вопросы, касающиеся биохимических и культурально-морфологических признаков разных штаммов P. tigrinns, особенно при росте на природных полимерах, недостаточно изучены условия культивирования, их продуктивность и скорость роста при различных условиях выращивания. Для биодеструкции лигноцеллюлозных отходов необходимо выявление новых активных штаммов.
Проведение таких работ представляется актуальным, поскольку они направлены на решение теоретических проблем микологии и разработку практических подходов при использовании грибов в биотехнологии. Дополнительные сведения о физиолого-морфологических особенностях и закономерностях роста разных штаммов гриба расширяют представления о его физиологии и систематическом статусе.
Цель и задачи исследования. Цель работы - морфо-физиологическая характеристика базидиомицета P. tigrimts в связи с его возможным применением для обогащения грибным белком лигноцеллюлозных субстратов.
6 Для достижения этой цели нами решались следующие задачи:
1) Исследовать культурально-морфологические особенности гриба
P. tigrimis шт. 317 в условиях различных способов культивирования;
Изучить рост P. tigrimis шт. 317 в различных условиях культивирования на плотных средах;
Подобрать и оптимизировать условия глубинного культивирования гриба с максимальным выходом биомассы;
4) Установить степень деструкции лигноцеллюлозного компонента
пшеничной соломы при твердофазном культивировании P. tigrimis шт.
317;
5) Дать количественную оценку влияния условий твердофазного куль
тивирования базидиомицета на биосинтез белка.
Научная новизна. Впервые исследованы морфо-физиологические признаки P. tigrimis ВКМ F-3616 D при различных способах и условиях культивирования, что расширяет представления о приспособляемости разных штаммов одного вида. Морфологические признаки гриба, выявленные на стандартных средах и имеющие таксономическое значение на уровне вида, не изменяются под влиянием условий культивирования и сохраняются при росте на лигноцеллюлозном субстрате, что позволяет вести надежный микробиологический контроль чистоты культуры. Подобраны оптимальные условия культивирования исследуемого штамма. Установлено, что вновь выделенный штамм способен расти на среде с березовыми опилками, используя их в качестве единственных источников углерода. При твердофазном культивировании гриб разрушает лигноцеллюлозный комплекс соломы и в зависимости от условий культивирования обогащает ее белком до 15-20%. Исследованный штамм можно рекомендовать для получения белковых кормовых добавок, используемых в рационе сельскохозяйственных животных.
Научно-практическая значимость работы. Использование предварительной обработки соломы съедобным грибом P. tigrimis шт. 317 позволит получить полноценную кормовую смесь непосредственно в условиях животноводческого хозяйства.
Микроорганизмы- продуценты белка и физиологически активных веществ
Основа кормовой базы для животноводства - это производство полноценных кормов, сбалансированных по важнейшим питательным веществам и, в первую очередь, по белковому составу. Растительная биомасса, используемая в сельском хозяйстве, является возобновляемым и наиболее распространенным источником сырья, она ежегодно накапливается в огромных количествах и по энергопотенциалу в несколько раз превышает мировую добычу нефти, газа и угля (Бабицкая, Щерба, 2002).
Основным источником белка в рационах сельскохозяйственных животных служат растительные корма — зерно, жмыхи и шроты. Доля растительного белка в общем балансе кормового белка превышает 90%. Однако, ориентируясь только на растениеводство, невозможно в полном объеме и на требуемом качественном уровне решить проблему кормового белка. Белок большинства растительных кормов является неполноценным, в нем обнаруживается дефицит незаменимых аминокислот — лизина, метионина, триптофана. В связи с этим, например, из 10% белка ячменя эффективно используются лишь 6%, из 23% белка гороха — только 10%. Необмолоченные растения злаков, состоящие из соломы, зерна, половы (зернофураж), имеют высокую энергетическую ценность и большое количество углеводов, но содержат лишь около 6-7% сырого белка (Авров, Мороз, 1979). Поэтому растительные рационы, особенно для птицы, свиней и молодняка жвачных, дополняют бе-локсодержащими продуктами животного происхождения — молоком, рыбной или мясокостной мукой, но ресурсы таких кормов ограничены, и они очень дорогие.
Сегодня одним из широко распространенных способов по восполнению белкового дефицита кормов - это применение соевой муки, характеризующейся высоким содержанием полноценного белка. Однако в сое и соевой муке, импортируемых из США и Канады, была обнаружена высокая степень контамининации токсичными штаммами грибов (Осипян и др., 2002). Это ограничивает её применение в качестве компонента кормов.
Одним из реальных путей удовлетворения потребностей животноводства в полноценном кормовом белке является производство белка одноклеточных - дрожжей, бактерий, низших мицелиальных грибов, простейших, водорослей. Производство микробного белка выгодно отличается от производства белков растительного и животного происхождения тем, что микроорганизмы обладают высокой скоростью роста (Олешко, Бабицкая, 1991). Белок, получаемый микробиологическим синтезом, отличается более высокой биологической ценностью: по аминокислотному составу он значительно превосходит растительный белок и в большей степени соответствует белку животного происхождения. Кроме того, производство белка одноклеточных не зависит от погодных и климатических факторов, выращивание микроорганизмов не требует больших площадей, может осуществляться на различных питательных субстратах. Кроме белков, микроорганизмы богаты витаминами, особенно группы В, микроэлементами и другими ценными соединениями (Соломко, 1988).
С технологической точки зрения более перспективны, по сравнению с другими микроорганизмами, дрожжи. В производстве кормовых дрожжей чаще всего применяются представители родов Candida, Trichosporon, Saccharomyces и другие (Олешко и др., 1986). Ценность дрожжевой биомассы определяется содержанием в ней белка, витаминов, микроэлементов. Некоторые дрожжи {Rhodotonila gracilis) интенсивно накапливают липиды (до 40%), каратиноиды (до 300 мкг/г) при содержании белка 30-35%. Липиды дрожжей характеризуются высокой степенью ненасыщенности за счет присутствия в них олеиновой, линолевой и линоленовой кислот (Залашко, Королева, 1988).
link2 Микроорганизмы link2 \
В процессах биоконверсии важная роль отводится высшим базиди-альным грибам, одним из представителей которых является P. tigrimis. Гриб обладает высокой продуктивностью, образует биомассу с приятным грибным ароматом, усваивает многие недефицитные источники питания, в том числе различные отходы сельскохозяйственного производства.
В качестве субстрата для P. tigrimis можно использовать различные среды и проводить как глубинное, так и твердофазное культивирование. В работе использовали штамм Panus (Lentimis) tigrimis (Bulliard: Fries) Fries 317, выделенный сотрудниками кафедры биотехнологии Мордовского госуниверситета из сухих плодовых тел, растущих на березовом валежнике в окрестностях города Саранска. Гриб обладает лигнолитической и целлюло-литической активностями благодаря чему, воздействуя на лигноцеллюлоз-ный комплекс растительных субстратов, способен разрушать такие трудно гидролизуемые полимеры, как лигнин и целлюлозу. В условиях оптимального роста образует плодовые тела, состоящие из шляпки и ножки (шляпка 1-3 см в диаметре, ножка длиной 1-3 см, иногда до 6 см), имеет кутикулу, гиме-ний, траму. Шляпка воронковидная, ассиметричная, с завернутым вниз краем. Кожица шляпки сухая, грязно-белая, с черно-бурыми чешуйками, пластинки нисходящие. Ножка белая, к основанию буроватая, слабочешуйчатая. Половое размножение осуществляется с помощью базидиоспор, образующихся на особых выростах - бзидиях.
Культура гриба была депонирована во Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН под номером ВКМ F-3616 D (Ревин и др., 1998).
Также в качестве объекта исследования использовали гриб Panus tigrimis ВКМ F-160, полученный из Всероссийской коллекции ИБФМ РАН.
В работе использованы реактивы отечественного производства, марки хч, чда и ч: нитрат натрия, хлорид калия, сульфат магния, двузамещенный фосфат калия, трихлоруксусная кислота, феррицианид калия, углекислый натрий, нитрат и сульфат аммония, хлорид натрия, хлорид кальция, уксусная, азотная, серная, соляная кислоты, водный аммиак, глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, пептон, крахмал, а также кумасси бриллиантовый голубой G-250 - "Loba Feinchemie" (Чехословакия).
В качестве субстратов при твердофазном культивировании использовали: 1. пшеничную солому - необработанную и модифицированную: 5%-ным раствором аммиака с последующей обработкой 2,5%-ным раствором серной кислоты, 4%-ным раствором гидроксида натрия и горячим паром. 2. Стебли хлопчатника (гузапаю). Размер субстратов -15x1-5 мм.
Оптическую плотность исследуемых образцов определяли на спектрофотометре СФ-46 "Ломо" (Россия). Морфологические признаки мицелия исследовали, используя световой микроскоп МБР-1 и люминесцентный микроскоп "Люмам Р-8" (Россия).
Влияние условий культивирования на культурально-морфологические признаки гриба
Для роста и развития микроорганизмов в питательных средах должны содержаться в необходимом количестве и в усвояемой форме питательные вещества. В настоящее время известно большое количество сред для грибов, различающихся, главным образом, по источникам азота и углерода и их соотношению в среде (Дудце , 1986).
Традиционным способом идентификации культур является их культивирование на плотной агаризованной среде. Сусло-агар используется в качестве стандартной среды при изучении культурально-морфологических признаков высших базидиомицетов большинством отечественных микологов. При культивировании на данной среде более четко выражена морфология колоний многих исследуемых видов (Дудка, 1978).
Уже многие годы используется кукурузный экстракт (КЭ) в качестве инградиента к питательным средам, поскольку он богат не только источниками углерода и азота, но также микроэлементами и витаминами. Часто используемой средой с кукурузным экстрактом является среда Чапека-Докса (Бухало, 1983). Одним из перспективных субстратов в экономическом отношении является меласса, которая может быть использована как основной источник углеродного питания (Морозова, 1978).
Одним из ярких представителей базидиальных грибов является P. tigrimis. Благодаря легкости выделения, хорошему росту и наличию БАВ, в лабораторных условиях он используется как модельный объект при изучении высших базидиомицетов (Бухало, 1988). Мицелий этого гриба обладает приятным грибным ароматом, содержит почти все незаменимые аминокислоты, что позволяет его использовать в пищевых и кормовых целях (Капич и др., 1984).
На кафедре биотехнологии Мордовского госуниверситета был выделен новый штамм гриба P. tigrimis. Поскольку в литературе описана морфология мицелия небольшого числа штаммов исследуемого гриба, мы сочли необходимым сравнить морфо-физиологические признаки вновь выделенного штамма при выращивании как на стандартных средах, так в последствии и на лигноцеллюлозных субстратах.
Нами были исследованы культурально-морфологические свойства 2 представителей ксилотрофных базидиомицетов - P. tigrimis шт. 317 и шт. 160. В работе использовали агаризованные среды: пивное сусло (контроль), Чапека-Докса, Райстрика.
Изучаемые штаммы характеризовались быстрым ростом на всех агари-зованных средах. В исследуемых условиях культивирования колонии имели высокую плотность, округлую форму, белый цвет, высокий воздушный мицелий, наблюдалось переплетение отдельных мицелиальных гиф во всех направлениях. При культивировании на контрольной среде P. tigrimis шт. 317 образовывал более пушистый воздушный мицелий (рис. З.1.).
