Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Строение лигнина 8
ГЛАВА 2. Грибы - деструкторы лигнина 10
ГЛАВА 3. Энзимология разложения лигнина 11
3.1 Лигнин пероксидаза 11
3.1.1 Окисление различных субстратов лигнин пероксидазой 13
3.1.2 Участие вератрилового спирта в окислении субстратов 14
3.1.3 Лигнинолитические свойства лигнин пероксидазы 15
3.2 Мп-пероксидаза 15
3.2.1 Механизмы реакций, катализируемых Мп-пероксидазой 17
3.2.2 Реакции Мп-пероксидазы с участием радикалов 18
3.2.3 Разложение лигнина Мп-пероксидазой 19
3.3 Гибридная Мп-пероксидаза 20
3.4 Строение активных центров лигнинолитических пероксидаз 21
3.5 Условия продукции лигнинолитических пероксидаз 22
3.6 Разложение ксенобиотиков лигнинолитическими пероксидазами 24
3.7 Лакказа 25
ГЛАВА 4. Материалы и методы 27
4.1 Реактивы и материалы 27
4.2 Объект исследования и его культивирование 27
4.3 Очистка фермента 27
4.4 Электрофорез 28
4.5 Спектральные методы и получение интермедиатов каталитического цикла 28
4.6 Пиридингемохромовый метод и определение коэффициентов молярной экстинкции фермента .29
4.7 Проведение реакции с бензиловыми спиртами и модельным соединением лигнина в присутствии медиаторов 29
4.8 Идентификация продуктов реакции медиаторов с бензиловыми спиртами и модельным соединением лигнина 30
4.9 Методы определения активности ферментов 30
4.10 Аналитические методы 31
4.11 Определение концентрации белка 32
4.12 Инактивация фермента в присутствии ГБТ и ГБТО 32
4.13 Определение типа ингибирования фермента 32
4.14 Реакция гибридной Мп-пероксидазы с 2,4,6-ТХФ в присутствии ГБТ 32
ГЛАВА 5. Результаты исследований 33
5.1 Очистка гибридной Мп-пероксидазы 33
5.2 Спектральные свойства гибридной Мп-пероксидазы 33
5.3 Субстратная специфичность 38
5.4 Каталитический цикл гибридной Мп-пероксидазы 40
5.5 «Оксидазная» реакция гибридной Мп-пероксидазы 43
5.5.1 Окисление НАДН гибридной Мп-пероксидазой 43
5.5.2 Участие различных форм фермента в окислении НАДН 47
5.6 Окисление субстратов в присутствии медиаторов 50
5.7 Инактивация гибридной Мп-пероксидазы в присутствии медиаторов 57
Обсуждение результатов 64
Выводы 72
Список литературы 73
- Разложение лигнина Мп-пероксидазой
- Условия продукции лигнинолитических пероксидаз
- Спектральные свойства гибридной Мп-пероксидазы
- Участие различных форм фермента в окислении НАДН
Введение к работе
Актуальность проблемы. Лигнин составляет до 30 % биомассы сосудистых растений и, таким образом, является одним из наиболее распространённых веществ в живой природе. Столь широкое распространение лигнина указывает на активное участие этого вещества в круговороте углерода. Однако, лигнин устойчив к воздействию микроорганизмов, и способность разлагать лигнин показана только для грибов-базидиомицетов двух экологических групп: дереворазрушающих ксилотрофов и грибов, разлагающих листовой опад. Поэтому понимание роли лигнина в геохимических циклах невозможно без дальнейшего изучения микробиологии разложения лигнина, а так же разнообразия ферментов, участвующих в этом процессе. Наряду с устойчивостью к микробному разложению, лигнин так же устойчив к химическому разложению, что затрудняет обработку древесины при производстве бумаги и обработку растительных волокон в текстильной промышленности. Ежегодно в мире образуется большое количество лигнинсодержащих отходов, из которых лишь малая часть подвергается дальнейшей переработке, а остальное - сваливается в отвалы или сжигается. В последние 20 лет в мире активно разрабатываются биотехнологии удаления лигнина с помощью грибов, разрушающих это вещество, либо посредством лигнин-разлагающих ферментов этих организмов. В связи с этим, без изучения механизма реакций ферментов, участвующих в деполимеризации лигнина, прогресс в этой области маловероятен. Учитывая высокую окислительную способность и неспецифичность действия лигнинолитических ферментов, интенсивно исследуется возможность применения грибов белой гнили для деградации ксенобиотиков и ремедиации загрязнённых природных сред.
Состояние проблемы. В настоящее время ведущую роль в деполимеризации лигнина отводят трём внеклеточным ферментам грибов - деструкторов лигнина: лигнин пероксидазе, Mn-пероксидазе и, в меньшей степени - лакказе [Hatakka, 2001]. Мп-пероксидаза занимает ключевое место в лигнинолитических ферментных комплексах многих грибов [Hofrichter, 2002]. Активность Mn-пероксидазы полностью зависит от наличия Мп2+, который окисляется ферментом до Мп3+. Однако, Мп-пероксидаза не способна окислять наиболее устойчивые нефенольные подструктуры лигнина [Wariishi et al., 1989b; Hammel et al., 1993]. Поэтому, долгое время ведущая роль в разложении полимерного лигнина отводилась лигнин пероксидазе, ферменту, обладающему мощным окислительным потенциалом и способному разрушать нефенольные связи. Тем не менее, были обнаружены грибы, эффективно разлагающие лигнин, не имеющие лигнин пероксидазы в составе лигнинолитического ферментного комплекса, но обладающие высокой активностью Мп-пероксидазы [Maltseva et al., 1991; Perie, Gold, 1991]. Способность Мп-пероксидазы окислять нефенольные соединения можно объяснить участием медиаторов - низкомолекулярных соединений, окисляемых до промежуточных радикалов, которые далее реагируют с конечным субстратом. Участие медиаторов в окислении нефенольных соединений хорошо известно у лакказы, для которой подобные реакции используются в биотехнологии [Call, Muke, 1997]. В качестве медиаторов Mn-пероксидаза способна использовать ненасыщенные жирные кислоты, а также соединения, содержащие SH-группы [Forrester et al., 1988; Wariishi et al., 1989c; Jensen et al., 1996]. Существование эффекта медиаторов позволяет поставить Мп-пероксидазу на один уровень с лигнин пероксидазой. Несмотря на важное прикладное значение реакций с участием медиаторов, более подробных исследований разнообразия веществ, позволяющих Mn-пероксидазе окислять нефенольные соединения, не проводилось.
Наряду с лигнин пероксидазой и Mn-пероксидазой у нескольких грибов был обнаружен третий лигнинолитический фермент - гибридная Мп-пероксидаза, сочетающий в себе свойства ранее открытых лигнинолитических пероксидаз [Leontievsky et al., 1995; Mester, Field, 1998]. Этот фермент подобно Mn-пероксидазе способен окислять Мп до Мп и, подобно лигнин пероксидазе, окисляет органические соединения, в том числе и нефенольные [Camarero et al., 1999]. Гриб Partus tigrinus 8/18 является эффективным деструктором лигнина, наличие лигнин пероксидазы в составе его лигнинолитического ферментного комплекса обнаружено не было, тем не менее гриб обладает высокой активностью Мп-пероксидазы и лакказы [Maltseva et al., 1991]. Mn-пероксидаза гриба P. tigrinus 8/18 первоначально была описана как обычная Mn-пероксидаза, были охарактеризованы молекулярные свойства фермента и Мп2+-зависимые реакции, показана способность окислять НАДН в оксидазной реакции - без перекиси водорода [Леонтьевский и др., 1990]. Однако, необычные свойства гибридной Мп-пероксидазы гриба Partus tigrinus 8/18, механизм окисления НАДН, а также участие различных форм фермента в этом процессе детально не были изучены.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить гибридные свойства Мп-пероксидазы гриба P. tigrinus 8/18, а так же механизмы реакций, осуществляемых этим ферментом. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
очистить фермент и изучить его Мп """-независимую активность;
изучить спектральные свойства различных форм и каталитический цикл гибридной Мп-пероксидазы;
- определить механизм оксидазного окисления НАДН с помощью гибридной Мп пероксидазы в присутствии Мп2+;
- изучить реакции гибридной Мп-пероксидазы с синтетическими медиаторами в присутствии ароматических спиртов.
Научная новизна работы.
Впервые изучено Мп -независимое окисление субстратов гибридной Мп пероксидазой гриба P. tigrinus 8/18. Экспериментально показано, что каталитический цикл фермента может функционировать как в присутствии Мп2+, так и без него - за счёт органического вещества.
Показано, что оксидазная реакция окисления НАДН происходит только в присутствии Мп2+. Полученные данные свидетельствуют о том, что фактически реакция является обычной пероксидазной. Роль Мп2+ заключается в защите фермента от инактивации и продолжении образования перекиси водорода за счёт Мп3+.
Впервые показано, что гибридная Мп-пероксидаза способна окислять нефенольные соединения в присутствии некоторых медиаторов, и реакция осуществляется за счёт окисления медиатора с помощью Мп3+. В результате взаимодействия фермента с медиаторами наблюдалась его инактивация.
Практическая значимость. Гибридная Мп-пероксидаза обладает высокой окислительной способностью и неспецифичностью действия, что позволяет ей трансформировать широкий спектр субстратов. Изученные реакции с участием медиаторов усиливают окислительную способность фермента и могут быть использованы при делигнификации растительного материала или разложении ксенобиотиков. Полученная информация о механизме катализа различных реакций, в том числе Мп2+-независимого и Мп2+-зависимого окисления субстратов, а так же реакциях с участием НАДН, расширяют наши представления о функционировании гибридной Мп-пероксидазы в составе лигнинолитических ферментативных комплексов грибов.
Разложение лигнина Мп-пероксидазой
МпП была способна деполимеризовать и разлагать до мономеров синтетический полимерный лигнин, содержащий фенольные группы [Wariishi et al., 1991], но не лигнин, такими группами не обладающий [Hammel et al., 1993]. Поскольку МпП фактически является фенолоксидазой, то этому ферменту отводилась вспомогательная роль в разложении лигнина, которая заключалась в окислении фенольных структур лигнина, а так же в продукции перекиси водорода для ЛП в ходе оксидазной реакции [Asada et al., 1986]. Вцелом, при воздействии МпП на лигнинсодержащие материалы происходила деполимеризация лигнина и образование его водорастворимых фрагментов [Kondo et al., 1994; Reid, Paice, 1998; Hofrichter et al. 1999a; Hofrichter et al., 2001]. Потенциально Mn3+ способен окислять нефенольные соединения, однако это относительно медленный процесс [Hammel et al., 1989]. Предполагется, что окисление нефенольных структур лигнина МпП в основном происходит в ходе переокисления липидов, поскольку ненасыщенные жирные кислоты активно продуцировались и переокислялись ксилотрофными грибами в процессе роста [Капич, Шишкина, 1995; Enoki et al., 1999; Gutierrez et al., 2002]. Несмотря на то, что тиилрадикал обладал высокой окислительной способностью и активировал выделение 14СОг из ,4С-искусственного лигнина [Hofrichter et al., 1999b], участие SH-соединений в разложении лигнина in situ маловероятно, поскольку их продукция грибами не описана. Также рассматривалась возможность взаимодействия МпП с другими ферментами грибов. Например, синергетическое взаимодействие с ЛП [Thompson et al., 1998] или лакказой [Galliano et al., 1991], окисление нефенольных соединений посредством их гидроксилирования совместно с целлобиозодегидрогеназой [Hilden et al., 2000].
Гибридная Mn-пероксидаза (другие названия Mn-зависимая лигнин пероксидаза, универсальная пероксидаза) была обнаружена у некоторых грибов белой гнили: P. tigrinus [Leontievsky et al., 1995; Karavaeva et al,. 1995], Bjerkandera adusta [Дзедзюля, Беккер, 2000], Pleurotus ostreatus [Беккер и др., 1992], Bjerkandera sp. BOS55 [Mester, Field, 1998], Pleurotus eryngii [Camarero et al., 1999], Ceriporiopsis subvermispora [Urzua et al., 1995]. Молекулярные свойства фермента аналогичны свойствам МпП: молекулярная масса порядка 45 кДа, pi около 3,5. Подобно МпП, гМпП была способна катализировать перекисьзависимое окисление Мп до Mn , поэтому до открытия необычных свойств этого фермента у тех же видов грибов он описывался как типичная МпП [Леонтьевский и др., 1990; Беккер и др., 1992; Martinez et al., 1996; Mester, Field, 1997]. ГМпП способна окислять Мп2+, поэтому все Мп-зависимые реакции, характерные для МпП, характерны и для этого фермента. Однако, подобно ЛП и ПХ гМпП способна окислять органические соединения в отсутствии Мп2+. Данные по спектру окисляемых субстратов довольно противоречивы. Все гМпП могли окислять без Mn + типичные субстраты лакказ и пероксидазы хрена -ароматические амины, 2,2 -азино-бис(3-этилбензотиазолин)-6-сульфоновую кислоту (АБТС), гидрохиноны. Но для гМпП грибов В. adusta, Bjerkandera. sp. BOS55, PI. eryngii показана способность окислять, гваякол, 2,6-диметоксифенол, пирокатехин и нефенольные соединения, такие как вератриловый спирт, диметоксибензол [Mester, Field, 1998; Heinfling et al., 1998a,1998b; Camarero et al., 1999]. Хотя по другим данным
гМпП В. adusta не окисляла гваякол, пирокатехин и вератриловыи спирт [Дзедзюля, Беккер, 2000]. Возможно это связано с различием штаммов грибов или выделением различных изоформ гМпП, как это показано для PL eryngii [Camarero et al., 1999]. He однозначен и вопрос о влиянии Мп + на окисление органического субстрата. Внесение Мп ускоряло окисление ароматических аминов, фенолов и АБТС. Однако на окисление нефенольных соединений Мп производил разный эффект. Так окисление вератрилового спирта и красителя Reactive Black 5 с помощью гМпП ингибировалось Мп2+ у грибов В. adusta, Bjerkandera. sp. BOS55 и PL eryngii [Mester, Field, 1998, Heinfling et al., 1998b]. В то время как гМпП грибов P. tigrinus и Lentinula edodes окисляли вератриловыи спирт только в присутствии Мп2+, причём в последнем случае реакция шла с расщеплением ароматического кольца [Maltseva et al., 1991; D Annibale et al., 1996].
С учётом способности гМпП окислять Мп и органические субстраты каталитический цикл фермента представляет собой синтез каталитических циклов МпП, то есть Мп2+ или органическое вещество восстанавливали как соединение I каталитического цикла, так и соединение II [Camarero et al., 1999; Леонтьевский, 2002]. Таким образом, стационарное протекание реакции может обеспечиваться как Мп2+, так и органическим веществом.
3.4 Строение активных центров лигнинолитических пероксидаз.
На основании анализа кристаллической структуры ЛП гриба Ph. chrysosporium было высказано предположение, что вератриловыи спирт и субстраты, подобные ему, окислялись в канале доступа к гему, который позволял субстратам реагировать непосредственно с гемом [Poulos et al., 1993]. Предполагалось, что во взаимодействии вератрилового спирта с ферментом участвовали Gln222, His82 и Glul46. Так же было показано, что мутации Glul46 снижали активность ЛП в отношении гваякола и вератрилового спирта, но не полностью подавляли её [Ambert-Balay et al., 1998]. Однако такая модель активного сайта не объясняла, каким образом фермент реагировал с полимерными субстратами, которые не способны проникнуть в канал доступа к гему. Поэтому, были предположены модели окисления субстрата на поверхности молекулы с переносом электронов к гему с помощью «длинного пути переноса электронов» ("long-range electron transfer" - LRET). В отличие от мутаций Glul46, His82, Gln222 полное ингибирование окисления вератрилового спирта, а также модельного олигомера лигнина оказывали мутации аминокислоты Тгр171, находящейся на поверхности молекулы [Doyle et al., 1998; Mester et al., 2001; Sollewijn Gelpke et al., 2002]. Аминокислотный остаток Trpl71 образовывал радикал, что указывает на его способность принимать участие в переносе электронов к гему [Blodig et al., 1999]. Таким образом, ТгрПІ является более предпочтительным сайтом взаимодействия субстрата с ферментом, чем аминокислоты гемового канала. Окружение Тгр171, кроме Glul68, являлось консервативным и для различных изоформ ЛП и возможно также участвует в переносе электронов [Sollewijn Gelpke et al., 2002]. Другой LRET был предложен для окисления полимерного лигнина [Johjima et al., 1999]. В качестве аминокислоты, ответственной за реакцию с субстратом, указывался His239. По мнению авторов, His239 передавал электроны на Asp238, который связан водородной связью с проксимальным лигандом железа - His 175 [Johjima et al., 1999].
Условия продукции лигнинолитических пероксидаз
В ходе реакции гМпП (системы гМпП/НгОг/Мп /малонат) с вератриловым спиртом в присутствии медиатора ГБТ было обнаружено постепенное падение активности фермента. За 3,3 ч реакции активность гМпП снизилась почти на 50% (Рис. 24). При инкубации гМпП такой же концентрации в малонатном буфере при 30С за то же время, активность фермента не снижалась.
Инкубация гМпП в присутствии перекиси водорода и без субстрата приводила к инактивации фермента. Дополнительное внесение в состав реакционной смеси Мп2+, ГБТ или ГБТО предохраняло гМпП от инактивации перекисью водорода (Рис. 25). Мп является натуральным субстратом Мп-пероксидаз, способным восстанавливать интермедиаты редокс-цикла этих ферментов. Защитный эффект ГБТ и ГБТО предполагал, что эти соединения также являются редуцирующими субстратами гМпП. Одноэлектронноокисленный интермедиат редокс-цикла гМпП — соединение II — восстанавливался ГБТ с образованием нативной формы, что подтверждает это предположение (Рис. 26). Подобный эксперимент с ГБТО провести не удалось, поскольку это вещество поглощает в видимой области. Вератриловый спирт не предохранял гМпП от инактивации (Рис. 25).
Известно, что пероксидазы, включая Mn-пероксидазы, инактивируются перекисью водорода с образованием каталитически неактивного соединения III с последующим обесцвечиванием гема. Соединение III Mn-пероксидазы может ревертировать в нативный фермент под воздействием Мп2+ как субстрата и Мп3+ как продукта реакции [Timofeevskii et al., 1998]. Мы проверили воздействие ГБТ как редуцирующего субстрата на соединение III гМпП. Искусственно полученное внесением к нативному ферменту 300 моль-эквивалентов перекиси водорода с последующим удалением её избытка каталазой соединение III было стабильным в течение 15 минут, а затем самопроизвольно ревертировало в нативный фермент в течение 1 ч. При избытке Н2О2 происходило необратимое разрушение соединения III гМпП с исчезновением поглощения во всем диапазоне спектра. После внесения ГБТ соединение III сразу переходило в нативную форму фермента, что видно по восстановлению максимумов поглощения при 406, 504 и 638 нм (Рис. 27). Однако поглощение при 406 нм составляло 80% от исходного, а поглощение при 504 и 638 нм было выше на 50%. Внесение вератрилового спирта не влияло на превращение соединения III.
Мы проверили возможность инактивации фермента самими медиаторами. Как ГБТ, так и ГБТО инактивировали гМпП, причём скорость инактивации увеличивалась с увеличением концентрации медиатора.
Однако полученные значения ккаж не показывали линейной зависимости от концентрации инактиватора, но линейно зависели от концентрации ГБТ, возведённой в третью степень с прохождением линейной аппроксимации через ноль (Рис. 28). Это указывает на то, что реакция инактивации фермента ГБТ является реакцией псевдотретьего порядка по инактиватору. На рисунке 29 изображены результаты аналогичных экспериментов, проведённых с ГБТО. С этим медиатором наблюдались такие же закономерности.
Инактивация гМпП под действием ГБТ (в отсутствии марганца и Н2О2) сопровождалась изменением спектра поглощения фермента, а именно снижением поглощения в полосе Соре и возрастанием поглощения в максимумах видимой области спектра поглощения фермента (Рис. 30). Изменение спектра происходило в течение 2 часов, после чего интенсивность поглощения в полосе Соре составляла 50% от такового у нативного фермента (максимум поглощения сместился от 406 нм к 403 нм). В максимумах при 504 и 638 нм интенсивность поглощения увеличивалась на 30%. Таким образом, данные экспериментов с полной реакционной смесью и только с ГБТ указывают на то, что причиной инактивации фермента могло быть взаимодействие гМпП с ГБТ или ГБТО.
Очистка, субстратная специфичность, спектральные свойства и реакции каталитического цикла гМпП. В ходе очистки фермента особое внимание обращали на отделение от лакказы, которая продуцировалась в условиях культивирования гриба в значительном количестве, жертвуя показателем выхода. Удаление даже следовой активности лакказы было необходимым для изучения Mn-независимой активности гМпП, а высокая степень очистки для получения стабильных интермедиатов каталитического цикла.
Как видно из спектра пиридин гемохромового производного (Рис. 3) одна молекула фермента гМпП содержит в качестве простетической группы одну молекулу протопорферина IX. Максимумы спектра поглощения нативной гМпП, а так же комплексов с CN" и N3" указывают на то, что железо в составе гема находится в высокоспиновом пентокоординированном состоянии [Andersson et al., 1985; Minoet al., 1988]. Подобно другим пероксидазам гМпП может существовать в виде восстановленной формы и соединения IIL Максимумы спектра поглощения различных форм гМпП близки таковым ранее описанных лигнинолитических пероксидаз - МпП, ЛП и ПХ, однако, спектральные свойства последней отличались. При образовании соединения II полоса Соре смещалась с 406 к 420 нм. При этом интенсивность поглощения снижалась на 40% по сравнению с нативным ферментом. Такое снижение интенсивности поглощения характерно для МпП и ЛП [Rengnathan, Gold, 1986; Wariishi et al., 1988], но не наблюдалось у ПХ [Dunford, Stillman, 1976], что дополнительно указывает на принадлежность гМпП гриба P. tigrinus к лигнинолитическим пероксидазам. Соединение III гМпП образовывалось после внесения 250 моль-эквивалентов перекиси водорода, то есть фермент менее чувствителен к инактивации перекисью водорода чем ЛП [Rengnathan, Gold, 1986; Wariishi, Gold, 1989], и, в этом отношении, похож на МпП [Wariishi et al., 1988].
Наряду с Нг02-зависимьім окислением Мп до Мп и окислением органических субстратов в присутствии MnS04, гМпП так же катализировала окисление некоторых субстратов и в отсутствие марганца. В этом отношении фермент аналогичен другим гМпП, выделенным ранее из грибов: Bjerkandera adusta [Дзедзюля, Беккер, 2000], Pleurotus ostreatus [Беккер и др., 1992], Bjerkandera sp. BOS55 [Mester, Field, 1998], PI. eryngii [Camarero et al., 1999].
Спектральные свойства гибридной Мп-пероксидазы
В ацетатном буфере окисление вератрилового спирта системой Мп3+/медиатор происходило более эффективно, чем в тартратном и малонатном (Рис. 18). Известно, что Мп3+ способен реагировать с малонатом и тартратом [Hofrichter et al., 1998а; Watanabe et al., 2001] и таким образом медиаторы конкурировали с элементами буфера за Мп +. Однако, в нашем случае эксперимент проводился в условиях избытка концентрации Мп3+ацетата в отношении медиаторов. Для АБТС показано, что её окисленная форма АБТС восстанавливалась малонатом, глиоксилатом, оксалатом и в очень малой степени тартратом обратно в АБТС [Collins et al., 1998]. Возможно, что радикалы ГБТ и ГБТО так же могут реагировать как с малонатом, так и с тартратом, поскольку являются более сильными окислителями чем АБТС2+ [Bourbonnais et al., 1998; Xu et al., 2001]. Возможно этим же объясняется более эффективное образование бензотриазола и бензотриазина в ацетатном буфере по сравнению с малонатным и тартратным (Рис. 19 и 20), то есть органические кислоты играют роль, аналогичную роли вератрилового спирта, и восстанавливают радикалы -N(O)" обратно в ГБТ и ГБТО. Также возможно, поэтому происходило небольшое окисление вератрилового спирта в ацетатном буфере, но не в малонатном или тартратном, без Мп2+ в присутствии медиаторов (Табл. 4), поскольку в этих условиях так же наблюдалось слабое образование бензотриазола и бензотриазина.
Инактивация гМпП в присутствии медиаторов. Лакказа инактивировалась в ходе реакций с участием ГБТ [Call, Mucke, 1997]. Инактивацию гМпП P. tigrinus в аналогичных условиях (Рис. 24) нельзя объяснить термоинактивацией — фермент был стабилен в таких условиях вне реакционной смеси. Хорошо известна инактивация пероксидаз в присутствии Н2О2, через образование каталитически неактивного интермедиата - соединения III, однако, субстраты пероксидаз, Мп в случае МпП и вератриловый спирт в случае ЛП, и реактивируют соединение III в нативный фермент [Timofeevskii et al.,1998; Wariishi, Gold, 1989; Wariishi, Gold, 1990]. В случае гМпП P. tigrinus инактивацию нельзя объяснить окислением перекисью водорода, поскольку, фермент предохранялся от инактивации субстратами - Мп , ГБТ и ГБТО (Рис. 25) и, возможно, продуктом реакции Мп + [Timofeevskii et al., 1998]. Снижение интенсивности поглощения в полосе Соре нативной гМпП, ревертированной из соединения III, могло быть следствием частичного обесцвечивания гема в результате воздействия высокой концентрации перекиси водорода (Рис. 27). Однако, в спектре нативной гМпП, образованной самопроизвольной реверсией соединения III без участия ГБТ, не наблюдалось увеличения поглощения в максимумах видимой области спектра при 504 и 638 нм, по сравнению с исходным. ГБТ или ГБТО инактивировали гМпП P. tigrinus без Н2О2 и MnSC 4, что указывает на инактивацию фермента не окисленными медиаторами. При взаимодействии ГБТ с ферментом происходило изменение спектра поглощения. Поглощение в максимумах при 504 и 638 нм увеличивалось на 50% от исходного уровня (Рис. 30). Так как в спектре нативной гМпП, образованной самопроизвольной реверсией соединения III без участия ГБТ, не наблюдалось увеличения поглощения в максимумах видимой области, это могло быть следствием взаимодействия гМпП с не окисленным медиатором. Инактивация фермента подчинялась кинетике псевдотретьего порядка по инактиватору (Рис. 28, 29), что предполагает участие более одной молекулы медиатора в инактивации фермента.
Заключение. Гибридная Mn-пероксидаза гриба P. tigrinus 8/18 способна катализировать окисление субстратов как в ходе Mn-зависимой, так и Мп-независимой реакции, при этом окисления нефенольных соединений не наблюдалось в обоих случаях. Спектральные характеристики различных форм фермента, а так же организация каталитического цикла близки таковым других пероксидаз. Окисление НАДН происходило только в присутствии Мп и полностью ингибировалось каталазой, что указывает участие в реакции пероксидаз но го цикла фермента. Взаимодействие Мп3+ с НАДН приводит к образованию перекиси водорода, что видимо приводило к продолжению окисления НАДН в обычной пероксидазной реакции гМпП. В присутствии НАДН гМпП превращалась в каталитически неактивное соединение III с последующей инактивацией и обесцвечиванием гема. Мп2+ предотвращал образование соединения III, чем предохранял фермент от инактивации. гМпП окисляла нефенольные соединения в присутствии ГБТ или ГБТО и, в меньшей степени, ВЛК. Эффективное окисление субстрата происходило только в присутствии Мп3+. В ходе реакции ГБТ и ГБТО трансформировались в бензотриазол и бензотриазин соответственно. Трансформация медиаторов не связана с взаимодействием их радикалов в вератриловым спиртом, а происходила из-за нестабильности радикалов. ГБТ и ГБТО инактивировали фермент в ходе реакции. Одну молекулу гМпП инактивировали несколько молекул медиаторов. 1. Разработана схема получения высокоочищенных препаратов гМпП из культуральной жидкости гриба P. tigrinus 8/18 с величиной Rz, достигающей 5,7. В результате изучения субстратной специфичности фермента показано наличие как Мп - зависимой, так и Мп - не зависимой реакций. 2. Отработаны способы получения интермедиатов каталитического цикла фермента. Это позволило изучить механизм реакции каталитического цикла и доказать гибридную природу Мп-пероксидазы. 3. Впервые изучено окисление НАДН гМпП в «оксидазной» реакции с участием Мп +, восстановленных форм кислорода и обычного пероксидазного цикла фермента. Образование перекиси водорода в ходе реакции происходило в результате взаимодействия Мп3+, НАДН и кислорода. Мп2+ в ходе окисления НАДН гМпП предохранял фермент от инактивации, обращая каталитически неактивное соединение III фермента в нативную форму. 4. Впервые изучен эффект медиаторов в реакции гМпП с устойчивыми субстратами. Из десяти соединений, известных для других оксидоредуктаз в качестве медиаторов, лишь три служили эффективными медиаторами для гМпП (ГБТ, ГБТО, ВЛК). В присутствии медиаторов гМпП приобретала способность окислять бензиловые спирты, нефенольное модельное соединение лигнина и более глубоко трансформировать 2,4,6-ТХФ.
Участие различных форм фермента в окислении НАДН
Участие соединения III и Мп2+ в окислении НАДН гМпП. В результате взаимодействия гМпП с НАДН фермент переходил в соединение III. Соединение III пероксидаз может образовываться несколькими путями: 1. При взаимодействии нативного фермента с 02" [Yamazaki, Piette, 1963; Odajima, Yamazaki, 1972]. 2. За счёт реакции интермедиата каталитического цикла фермента соединения II с избытком перекиси водорода [Nakajima, Yamazaki, 1987]. 3. Путём взаимодействия восстановленной формы пероксидазы с кислородом [Kettle, Winterbourn, 1992; Tamura, Yamazaki, 1972]. В нашем случае образование соединения III не связано со вторым путём, поскольку избытка перекиси водорода не было. Взаимодействие 02 с нативным ферментом частично может объяснить образование соединения III, так ка СОД снижала скорость обесцвечивания гема, но не предотвращала его. Наиболее вероятно образование соединения III путём окисления кислородом восстановленной с помощью НАДН формы фермента. Восстановление пероксидаз НАД или радикалами гидрохинона известно из литературы [Yamazaki, Yokota, 1967; Kettle, Winterbourn, 1992]. Образование соединения II в ходе обесцвечивания гема объяснить труднее. Как было показано [Yamazaki, Yokota, 1967; Nakajima, Yamazaki, 1987], соединение III ПХ разлагается с образованием соединения II: соединение III соединение II + Н2О2 схема 1 Соединение II гМпП способно обращаться в нативный фермент только в присутствии Мп +. Поэтому возможно идёт накопление соединения II, которое опять будет взаимодействовать с перекисью водорода и переходит в соединение III с последующей инактивацией. Опыты с каталазой косвенно подтверждают эту гипотезу, поскольку каталаза, удаляя перекись водорода, способна сдвинуть равновесие, указанное на схеме 1, вправо, а соединение II гМпП гриба P. tigrinus может спонтанно ревертировать в нативный фермент. Но гМпП гриба P. tigrinus является гибридной, то есть её соединение II способно восстанавливаться как Мп2+, так и некоторыми органическими соединениями. Может ли НАДН служить восстановителем соединения II выявить сложно, так как в присутствии НАДН фермент переходит в соединение III. СОД не предотвращала обесцвечивание гема, но образования соединения II не наблюдалось (Рис. 16). Это возможно связано с тем, что СОД образует дополнительное количество перекиси водорода, что сдвигает равновесие между соединением II и соединением III в сторону последнего.
Соединение III играет регуляторную роль в окислении НАДН пероксидазой хрена, с его распадом начинается быстрое окисление субстрата [Yamazaki, Yokota, 1973]. Однако, активное образование соединения III в ходе окисления НАДН гМпП маловероятно, поскольку Мп обращает его в нативный фермент (Рис. 17), поэтому, соединение III скорее является побочным, неактивным продуктом и не играет роли в «оксидазной» реакции гМпП.
Таким образом, реакция окисления НАДН в отсутствии перекиси водорода, как и в случае ПХ, по сути, является пероксидазной реакцией, но главную роль в образовании перекиси водорода и продолжении реакции играет Мп3+. Поглощение кислорода обусловлено его взаимодействием с продуктами реакции Мп с НАДН с последующим образованием активных форм кислорода. Мп2+ играет роль субстрата гМпП в пероксидазной реакции и предохраняет фермент от инактивации.
Окисление различных субстратов гМпП в присутствии медиаторов. Соединения, испытанные нами в качестве потенциальных медиаторов для гМпП Р. tigrinus, хорошо известны как эффективные медиаторы лакказ. Однако только ГБТ и ГБТО, и в небольшой степени ВЛК, оказались эффективными в реакции окисления вератрилового спирта гМпП (Табл. 4). Сходный набор лакказных медиаторов, включающий АБТС, ВЛК, ГБТ, ГБТО и 3-ГАК, был использован для отбеливания бумажной массы МпП из гриба Trametes versicolor, и только в присутствии ГБТО наблюдался положительный эффект [Bermek et al., 2002]. Общий принцип действия медиаторов изображён на рисунке 4. В случае Ы-гидрокси[-КОН-] соединений (ГБТ, ВЛК и ГБТО) реакционноспособным продуктом окисления медиатора служит радикал -N(O)- [Xu et al., 2001; D Acunzo et al., 2002; Cantarella et al., 2004]. Так как гМпП P. tigrinus способна окислять и Mn , и органический субстрат, мы проверили возможность окисления вератрилового спирта в отсутствии марганца, рассчитывая, что медиаторы могут окисляться гМпП как субстраты, альтернативные марганцу. В этих условиях гМпП P. tigrinus окисляла и неэффективный АБТС, и эффективные ГБТ и ГБТО. Однако наблюдалось только незначительное окисление вератрилового спирта в отсутствии марганца и в присутствии ГБТ или ГБТО в ацетатном буфере (Табл. 4). Поэтому, окисление вератрилового спирта происходило практически только в присутствии Мп и Н2О2 или при замене системы гМпП/НгОг/Мп /хелатор на Мп +ацетат, что указывает на то, что эффективное окисление медиатора до реакционноспособного радикала происходит только в присутствии Мп3+. Способность окислять не только вератриловый, но и анисовый спирт, а так же осуществлять разрыв Р-1 связи модельного соединения лигнина указывают на значительный окислительный потенциал системы гМпП/НгОг/Мп /медиатор. Окислительное дегалогенирование в иара-положении 2,4,6—ТХФ МпП с образованием 2,6-ДХБХ в качестве единственного продукта известно [Reddy et al., 1998], поэтому убыль 2,6-ДХБХ и образование других продуктов указывает на дополнительную возможность системы гМпП/Н202/Мп2+/медиатор в трансформации этого ксенобиотика.
Цикличность реакции с участием медиаторов и образование продуктов трансформации медиаторов. Низкое стехиометрическое соотношение медиатор/вератровый альдегид указывает на то, что реакция ГБТ или ГБТО с вератриловым спиртом не является циклической, то есть медиатор не является в данной реакции катализатором, и радикал медиатора после взаимодействия с вератриловым спиртом восстанавливается не обратно в ГБТ или ГБТО, а в бензотриазол и бензотриазин соответственно. Схема, соответствующая такому механизму, показана на рисунке 31 А. Однако согласно этой схеме внесение вератрилового спирта в реакционную смесь должно увеличивать образование бензотриазола и бензотриазина. Но, как видно из рисунков 19 и 20 внесение в реакционную смесь вератрилового спирта снижало выход продуктов трансформации медиаторов. Известно, что радикалы ГБТ и ГБТО не устойчивы и переходят в невосстанавливаемые продукты [Bourbonnais et al., 1998; Xu et al., 2001]. Хотя в этих работах не определяли природу этих продуктов, но вполне возможно, что это бензотриазол и бензотриазин, поскольку в случае окисления нефенольного соединения системой лакказа/ГБТ происходило образование бензотриазола [Li et al., 1998].
