Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Многообразие пероксидаз и их роль в жизни растений (обзор литературы) 10
1.1. Основные свойства пероксидаз растений 10
1.1.1. Структура фермента пероксидазы 10
1.1.2. Физико-химические свойства пероксидаз 11
1.1.3. Молекулярное разнообразие фермента пероксидазы 13
1.1.4. Молекулярное разнообразие генов пероксидазы 18
1.2. Физиологические функции пероксидаз в растении 19
1.2.1. Роль пероксидаз в лигнификации клеточных стенок 20
1.2.2. Участие пероксидаз в ответных реакциях растения на стресс 22
1.3. Регуляция активности пероксидазы и ее участие в трансдукции элиситорного сигнала 26
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1 Объекты исследований 40
2.2. Условия проведения опытов 40
2.3. Фитопатогены и методы работы с ними 40
2.3.1. Визуальная оценка пораженности растений фитопатогенами 40
2.3.2. Инфицирование растений 41
2.4. Методы биохимических исследований 42
2.4.1. Фиксация растительного материала для биохимических исследований 42
2.4.2. Получение ферментных экстрактов свободной и связанной с клеточными стенками пероксидазы 43
2.4.3. Определение активности пероксидаз 43
2.4.4. Определение активности оксалатоксидазы 44
2.4.5. Колориметрический метод определения белка по Бредфорду 44
2.4.6. Изоэлектрофокуссирование пероксидаз 45
2.5. Молекулярно-биологические исследования 45
2.5.1. Выделение и очистка ДНК из растений 45
2.5.2.Выделение и очистка РНК из растений 46
2.5.3. Измерение концентрации ДНК и РНК 47
2.5.4. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ГИДР 47
2.5.5.Полимеразная цепная реакция ДНК 48
2.5.6. Реакция обратной транскрипции РНК и полуколичественный анализ экспрессии генов 48
2.5.7. Электрофорез фрагментов ДНК и РНК в агарозных и полиакриламидных гелях. 49
2.5.9. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 49
2.6. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Устойчивость образцов Aegilops umbellulata к Septoria nodorum Berk, в связи с активностью пероксидаз различной локализации в клетке. 51
3.1.1. Анализ образцов Aegilops umbellulata Zhuk. на устойчивость к Septoria nodorum Berk . 51
3.1.2. Связь устойчивости образцов Aegilops umbellulata Zhuk. к Septoria nodorum Berk, с активностью пероксидазы различной локализации 58
3.2. Выявление в структуре фермента пероксидазы пшеницы сайтов, ответственных за сорбцию к полисахаридам. 62
3.3. Участие оксидоредуктаз в ответных реакциях пшеницы на грибную инфекцию 72
3.3.1. Пероксидазы в защитных реакциях растений пшеницы, различающихся по устойчивости к возбудителю септориоза S. nodorum 72
3.3.2. Защитная роль оксалатоксидазы при поражении пшеницы возбудителем корневой гнили Bipolaris sorokiniana 16
3.2.3. Влияние инфицирования фитопатогенным грибом В. sorokiniana на активность пероксидаз различной локализации в растениях устойчивой и восприимчивой пшеницы 80
3.4. Регуляция индукторами устойчивости уровня экспрессии анионной пероксидазы в растениях пшеницы при грибном патогенезе 83
3.4.1. Участие хитоолигосахаридов в защитных реакциях растений пшеницы при инфицировании возбудителем корневой гнили В. sorokiniana 83
3.4.2. Влияние салициловой кислоты на уровень экспрессии гена анионной пероксидазы пшеницы при инфицировании каллусов S.nodorum 89
Заключение 91
Выводы 93
Список литературы 94
- Регуляция активности пероксидазы и ее участие в трансдукции элиситорного сигнала
- Фиксация растительного материала для биохимических исследований
- Анализ образцов Aegilops umbellulata Zhuk. на устойчивость к Septoria nodorum Berk
- Влияние инфицирования фитопатогенным грибом В. sorokiniana на активность пероксидаз различной локализации в растениях устойчивой и восприимчивой пшеницы
Введение к работе
Актуальность исследований. Изменения в спектре защитных белков и экспрессионной активности их генов под влиянием инфицирования фитопатогенными грибами позволяет выявить физиологические предпосылки устойчивости или же, напротив, восприимчивости растений. В связи с открытием сигнальной и защитной роли активных форм кислорода большое внимание уделяется оксидоредуктазам, регулирующим их уровень в клетке [Hippeli et al., 1999; Droge, 2002]. Среди них особый интерес представляют пероксидазы, активность которых коррелирует с развитием устойчивости растений как к биотическим, так и абиотическим стрессам [Passardi et al., 2004].
Являясь конституционно необходимым, этот фермент участвует в различных биохимических реакциях, происходящих в живом организме [Савич, 1989; Passardi et al., 2004]. Поскольку пероксидаза представлена семейством полифункциональных белков, возникает определенная трудность в разграничении роли отдельных изоформ в различных физиологических процессах растительного организма и, в частности, в реализации защитных свойств растения к воздействию фитопатогенов [Hawkins, Boudet, 2003; Kawano, 2003; Максимов и др., 2004; Arrieta-Baez, Stark, 2006]. Показано, что непосредственное участие в синтезе лигнина, ограничивающего поступление питательных веществ к инфекционным структурам гриба в зоне его проникновения в ткани растения, принимает анионная пероксидаза [Zhao et al., 2005].
Одним из условий функционирования пероксидазы является наличие перекиси водорода, инициирующей активность этого фермента. Известно, что в растениях часто пероксидаза работает в комплексе с различными оксидазами, например НАДФН-оксидазой [Тарчевский, 2001]. Поскольку ранее была показана возможность сорбции на компоненты поверхности клеточной стенки фитопатогенных грибов кроме пероксидазы и оксалатоксидазы [Черепанова, 2005] можно предположить, что они также
7 могут формировать определенный комплекс в зоне инфицирования. При этом
оксалатоксидазы играют роль поставщика перекиси водорода, а пероксидазы
используют ее для окисления фенольных соединений. Однако, на фоне
четкого доказательства патоген-индуцированной активации оксалатоксидазы
[Thordal-Christinsen et al., 1997] остается до сих пор не выясненной роль
анионной пероксидазы в формировании защитных свойств растений.
Особенно скудна информация, касающаяся экспрессии генов анионной
пероксидазы у мягкой пшеницы, так как полноразмерная нуклеотидная
последовательность данного изофермента еще не определена. Изучение
молекулярных механизмов регуляции отдельных изопероксидаз внесет вклад
в понимание физиологических основ устойчивости растений к
фитопатогенам.
Цель данной работы состояла в выявлении роли анионной пероксидазы в механизмах формирования устойчивости растений пшеницы к фитопатогенным грибам.
Задачи исследований:
Определить характер изменений в активности оксидоредуктаз пшеницы различной локализации в клетке при инокуляции возбудителями грибных болезней.
Провести анализ полисахарид-специфичных сайтов в предсказанных аминокислотных последовательностях пероксидаз из разных растений и на основе их нуклеотидных последовательностей подобрать праймеры для оценки уровня экспрессии гена анионной пероксидазы в растениях пшеницы.
3. Изучить уровень экспрессии гена анионной пероксидазы у разных
видов пшеницы и эгилопса при инфицировании возбудителями септориоза
Septoria nodorum Berk, и корневых гнилей Bipolaris sorokiniana (Sacc.)
Shoenaker. и после обработки индукторами устойчивости.
Научная новизна. Выявлена роль оксидоредуктаз различной локализации в клетке в процессах формирования устойчивости растений к фитопатогенным грибам. Обнаружено, что степень устойчивости образцов
8 Aegilops umbellulata к возбудителю септориоза коррелирует с активностью
пероксидаз, локализованных в клеточной стенке. Наличие в гене анионной
пероксидазы пшеницы мотива, гомологичного пектин-специфичному сайту
пероксидаз арабидопсиса, позволяет характеризовать его как потенциально
полисахарид-связывающий. Повышенный уровень экспрессии гена анионной
пероксидазы и значительное усиление этого процесса под влиянием
индукторов устойчивости коррелирует с высокой ферментативной
активностью пероксидаз в растениях пшеницы.
Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание молекулярных механизмов естественного и индуцированного фитоиммунитета. Анализ экспрессии гена анионной пероксидазы пшеницы под влиянием хитоолигосахаридов и салициловой кислоты может быть использован для скрининга эффективности новых средств защиты растений с иммуностимулирующими свойствами. Выделенные в ходе работы образцы из мировой коллекции ВИР Ае. umbellulata (К-3294, К-571691, К-577973, К-578107) могут быть предложены в качестве доноров устойчивости к септориозу.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийском съезде общества генетиков и селекционеров (Москва 2004), на Молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2003), на VIII Молодежной конференции ботаников (С.-Петербурге, 2004), на втором съезде по защите растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем» (Санкт-Петербург, 2005); на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006).
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№01-04-48495) "Хитин-специфичные" пероксидазы как регуляторы интенсивности элиситорных сигналов при грибном патогенезе", РФФИ (№ 05-04-48310) «Хитин-специфичные» оксидоредуктазы в сигнальной регуляции устойчивости растений к фитопатогенным грибам» и
9 РФФИ-Агидель (№ 02-04-97923) «Совместные культуры клеток пшеницы с фитопатогенами как модель для скрининга средств защиты растений с иммуностимулирующими свойствами».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Регуляция активности пероксидазы и ее участие в трансдукции элиситорного сигнала
При контакте с растениями клетки патогенов выделяют различные соединения, обеспечивающие их проникновение в растение, питание и развитие. Некоторые из этих соединений являются токсинами, которые патогенные микроорганизмы выделяют для ослабления сопротивляемости растения-хозяина. Другой тип соединений, выделяемых патогенами, получил название элиситоров. Элиситоры играют роль первичных сигналов и приводят в действие сложную цепь процессов индукции и регуляции фитоиммунитета. Это проявляется в синтезе защитных белков, фитоалексинов, в выделении антипатогенных летучих соединений. В настоящее время охарактеризована структура множества природных элиситоров. Некоторые из них продуцируются микроорганизмами, другие (вторичные элиситоры) образуются при ферментативном расщеплении высокополимерных соединений кутикулы и полисахаридов клеточных стенок растений и микроорганизмов, третьи представляют собой стрессовые фитогормоны, синтез которых в растениях индуцируется патогенами и абиогенными стрессорами.
Некоторые элиситоры образуются в результате действия на ткани растений гидролаз, выделяемых патогенами. Гидролазы разрушают клеточные стенки растений, стоящие на пути проникновения патогенов, до олигосахаридных продуктов деградации, которые обладают элиситорными свойствами. Олигосахариды, связываясь со специфическими рецепторами, включают триггерные механизмы обеспечения выживаемости растения [Aldington, Fry, 1993], то есть приводящие к синтезу фитоалексинов, ингибиторов протеиназ, лигнина и изопероксидаз, Р 1,3-глюконаз и хитиназ, а также к другим иммунным ответам. Олигосахариды по своему множественному действию на растение напоминают классические фитогормоны, хотя некоторые олигосахариды активны в значительно более низких концентрациях [Усов, 1993]. Более того, существует мнение, что ауксины и гиббереллины активируют ферменты, высвобождающие из клеточных стенок олигосахариды, а те уже служат специфическими медиаторами различных функций растений [Hoson, 1993]. Изучение действия олигосахаридов на растения позволило установить, что спектр ответных реакций зависит от концентрации и структуры исследуемых веществ. Помимо этого, олигосахариды регулируют растяжение клеток растений, стимулированное ростовыми гормонами, контролируют процессы морфогенеза, индукцию этилена, вызывают быстрые изменения в ионных потоках и проницаемости плазматической мембраны, индуцируют фосфорилирование белков [Озерецковская, 2002].
Стрессовые фитогормоны, которые накапливаются под влиянием различных патогенов и элиситоров, вызывают синтез различных защитных соединений и повышение устойчивости как в клетках, подвергшихся действию элиситоров (местная и локальная устойчивость), так и на удалении от них (системная устойчивость). Последнее объясняется способностью большинства фитогормонов транспортироваться на большие расстояния или вызывать в клетках появление транспортных вторичных метаболитов.
Вышеперечисленные элиситоры, как известно, связываясь с факторами транскрипции, запускают экспрессию защитных генов растений. В настоящее время у растений интенсивно исследуются структура иромоторных участков генов, отвечающих за приобретение иммунитета к различным патогенам и их элиситорам.
Так, вирус табачной мозаики и салициловая кислота вызывали у растений табака индукцию двух генов факторов регуляции транскрипции класса WRKY, узнающих в промоторных участках защитных генов определенную последовательность нуклеотидов - TTGAC (W-box). Активация этих факторов регуляции транскрипции осуществлялась с помощью их фосфорилирования протеинкиназами. [Chen, Chen, 2000]. Один из доменов факторов регуляции транскрипции, отвечающего за преобразование жасмонатного сигнала, активирует регуляторний участок промотора нескольких генов, кодирующих жасмонат- и элиситор-индуцируемые белки [Van der Fits, Memelink, 2000]. Было показано, что в растениях табака под влиянием салициловой кислоты экспрессируются гены кислых PR-белков, а под влиянием этилена и жасмоновой кислоты — гены основных PR-белков [Ohtsubo et al., 1999].
Активно изучаются и факторы регуляции транскрипции и промоторные участки пероксидазных генов. Так, в промоторнои последовательности восьми пероксидазных генов Arabidopsis thaliana были выявлены цис-элементы, регулирующие их транскрипцию гормонами и стрессовыми воздействиями [Лебедева и др., 2003]. В промоторнои области пяти генов найдены г/ис-элементы, которые функционируют при действии ауксина (АСТТТА, CATATG, TGTCTC) и z/wc-элементы ТААСААА и ТТТТТТСС, участвующие в ответе на гиббереллин. Регулируемый этиленом, i/wc-элемент AWTTCAAA обнаружен в четырех генах пероксидаз, а также по одному или несколько разных АБК-регулируемых z/wc-элементов. У многих генов выявлены г ис-элементы (YTGTCWC), потенциально способные включаться при водном стрессе, гипотермии или под воздействием патогенов.
Интересно, что при воздействии внешних стрессов на растения практически одновременно запускается синтез целого ряда патоген-индуцируемых белков (PR-белков). Это может быть связано с «включением» элиситорами нескольких сигнальных систем, которые, функционируя параллельно, активируют несколько типов факторов регуляции транскрипции и вызывают экспрессию нескольких видов защитных белков, или возможность того, что промоторы генов определенных белков имеют одну и ту же структуру регуляторных элементов, что приводит к их одновременной экспрессии [Тарчевский, 2002].
Фиксация растительного материала для биохимических исследований
Известно, что в устойчивости растений значительное место отводится пероксидазам, локализованным в клеточной стенке [Nair, Showalter, 1996; Van der Westhuizen et al., 1998; Lin, Kao, 2001]. Мы сравнили активность связанных с клеточными стенками пероксидаз с устойчивостью исследуемых образцов. Представленные на рис. 7 данные показывают, что, действительно, степень развития S. nodorum на листьях Ае. umbellulata зависела от активности фермента в этой фракции белка. Чем выше активность фермента, тем ниже был балл поражения патогеном образцов этого вида эгилопса; коэффициент корреляции между этими показателями составил 0.78. Анализ Ае. umbellulata на устойчивость к возбудителю септориоза S. nodorum Berk. позволили выделить формы, наиболее устойчивые к фитопатогену в фазу проростков. Образцы эгилопса характеризовались не только вариабельностью по устойчивости к септориозу, но и имели различия в активности и изоферментном составе пероксидаз. Наибольшее развитие возбудителя септориоза на листьях происходило у растений, имеющих наименьшую изначальную активность связанных с клеточными стенками изопероксидаз.
Высокая активность этого фермента в клеточных стенках Ае. umbellulata и наличие в цитоплазматической фракции белка изопероксидазы с р/ 7.5, а также дополнительная активация анионных изопероксидаз с р/ 3.5 при инфицировании, вероятно, способствовали задержке роста и развития фитопатогенного гриба и локализации основных симптомов болезни в точке инокуляции. Обнаруженные нами показатели можно использовать в качестве высокоэффективного маркера устойчивости образцов этого вида эгилопса против фитопатогенного гриба - возбудителя септориоза S. nodorum Berk.
Активация защитных белков при патогенезе обуславливается системной ответной реакцией растений, предполагающей довольно длительный и многоступенчатый перенос информации внутрь растительной клетки и синтез PR-белков de novo [Тарчевский, 2001]. Можно предположить, что конкретные защитные белки, синтезируемые в растении, направленно взаимодействуют с инфекционными структурами патогенов. Так, например, хитиназы и глюканазы необходимы для разрушения хитина и глюкана грибного мицелия, соответственно, RIP-белки направлены на дезорганизацию синтеза белков [Ясенецкая и др., 2003; Veronese, et al., 2003], а ингибиторы протеаз - на ингибирование активности протеаз патогена [Мосолов, 2001]. Несомненно, специфичность действия защитных белков предполагает наличие в их молекулярной структуре определенных сайтов, позволяющих им взаимодействовать с "мишенями" на инфекционных структурах патогена. Например, осмотины (PR-5) имеют сродство к грибным фосфомананам [Ibeas et al., 2001; Coca et al., 2000], тауматин-подобные белки - к грибным глюканам [Trudel et al., 1998; Osmond et al., 2001]. У ингибиторов протеиназ, гевеин-подобных белков, хитиназ, глюканаз, RIP-белков, антимикробных белков Ас-АМР и Рп-АМР [Veronese et al., 2003], а также у тионинов обнаружено свойство сорбции на хитин [Oita et al., 2000], что объясняется наличием в их структуре хитин-связывающих консервативных доменов [Veronese, et al., 2003].
Среди многообразия оксидоредуктазных белков ранее в лаборатории биохимии иммунитета растений были обнаружены пероксидазы и оксалатоксидазы пшеницы, способные к ионообменному взаимодействию с хитином при сохранении у них функциональной активности [Максимов и др., 2005]. Хотя эта связь с полимером и носила ионообменный характер, степень взаимодействия пероксидазы и оксалатоксидазы с углеводным полимером GlcNAc зависела от наличия в структуре хитина ацетильных групп.
Сорбцию пероксидазы на полисахариды наблюдали и другие авторы [Caprin et al., 2001; Dunand et al., 2002]. Так, исследователями из Женевского университета была показана сорбция пероксидаз, выделенных из цуккини и арабидопсиса, на пектаты в присутствии Са2+ и выдвинуто предположение, что ионообменное сродство к пектатам, у изученных пероксидаз, связано с наличием в молекуле фермента электростатически активных зон.
На представленной компьютерной модели молекулы пероксидазы арабидопсиса (рис. 8), созданной на основе аминокислотной последовательности белка [Caprin et al., 2001], видно, что поверхность молекулы пероксидазного белка характеризуется такими областями. Одна из них характерна для субстрат-связывающего канала пероксидазы, а другая находится на противоположной стороне молекулы и представлена последовательностью аминокислотных остатков R262-R268--R271-R117 (рис. 8).По предположению авторов цитированной работы эта зона может быть ответственна за связывание с пектатами. Это предположение было доказано путем делеции в гене пероксидазы нуклеотидной последовательности, ответственной за трансляцию полисахарид-связывающей аминокислотной последовательности, и последующего трансгеноза мутантного белка в растения табака [Dunand et al., 2002]. Следовательно, можно допустить существование и в белковой структуре хитин-специфичной анионной пероксидазы пшеницы аминокислотных мотивов, способных специфически взаимодействовать с ацетильными остатками хитина. Мы провели сравнительный анализ предсказанных аминокислотных последовательностей аполипопротеина Е млекопитающих, ответственного за связывание с гепарином, пектин-связывающего сайта пероксидаз арабидопсиса ATg08770 и ATg08780 с гомологичными последовательностями анионных пероксидаз цуккини APRX, кукурузы ZM 004710, изопероксидаз пшеницы TAAF532972, ТАХ85227-ТАХ85229, ТС151917 и риса OS 378734, OS378735, OS022438. Как видно из рис. 9, мотив - (XXRXXXXXKXX), характерный для гепарин-связывающего домена аполипопротеина Е, имеет аналогичные последовательности (ХХКХХХХХКХХКХХ), находящиеся в пределах от 217 до 250 остатка аминокислоты, в молекулах пектин-связывающих пероксидаз арабидопсиса и цукини. Часть подобного фрагмента была обнаружена нами у анионной пероксидазы кукурузы (ХХКХХХХХХХКХХХКХ), ассоциированной с тилакоидами аскорбат-пероксидазы пшеницы (ХХКХХХХХХКХХКХКХ) и анионной пероксидазы пшеницы ТС151917 (ХКХХХХХХХХККХ) [http://peroxidase.isb-ib.ch]. Положение аргинина (R) определяет сродство проанализированных пероксидаз к пектинам [Carpin et al., 2001]. Следует заметить, что замена лизина на аргинин, согласно сообщениям Н. Margalit с соавторами [1993] и С. Dunand с соавторами [2002], не снижала сродства отмеченных сайтов с гепарином и пектинами, а удаление этого мотива из молекулы пероксидазы приводила к потере ее сорбционных свойств [Carpin et al., 2001]. Среди других известных аминокислотных последовательностей пероксидаз пшеницы, включая патоген-индуцируемые [Baga et al., 1995], и риса данного мотива нами не обнаружено (рис. 9). Все это говорит о вариабельности полисахарид-связывающего сайта даже внутри одного вида растений. Таким образом, это позволяет отнести анионные изопероксидазы пшеницы и кукурузы к подобным пектин-связывающим пероксидазам.
Анализ образцов Aegilops umbellulata Zhuk. на устойчивость к Septoria nodorum Berk
Для сравнительного анализа изменения активности пероксидазы у проростков пшеницы при инфицировании возбудителем септориоза S. nodorum нами были отобраны несколько генотипов пшеницы и эгилопса, любезно предоставленные нам сотрудниками Всероссийского НИИ растениеводства им Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург), приведенные в таблице 4.
При проведении анализа нами было обнаружено, что исходно здоровые растения изученных видов пшеницы и эгилопса имели различную пероксидазную активность в цитоплазматической фракции. Так, она была наибольшей у Ае. longissima и Т. timopheevii, средней у Ае. taushi, Т. aestivum, Т. boeoticum и слабой у остальных (рис. 15). Как видно, полученные данные показали, что между устойчивостью видов к септориозу (табл. 4) и активностью их устойчивостью по отношению к возбудителю септориоза S. nodorum (Максимов, 2005). Во вторую группу вошли виды пшеницы и эгилопса (Г. aestivum, Т. boeoticum, Т. топососсит), у которых происходила незначительная активация пероксидаз при инфицировании. Как видно, в этом случае можно наблюдать высокую степень корреляции активности фермента со степенью устойчивости образцов к септориозу. Таким образом, степень активации цитоплазматической пероксидазы под влиянием инфицирования является наиболее четким критерием последующей устойчивости растений к септориозу.
Для нас представляло интерес понять экспрессируется ли ген анионной изопероксидазы под воздействием инфицирования фитопатогенными грибами. С помощью праймеров к гену анионной пероксидазы нами был проведен анализ экспрессии на различных видах пшеницы при инфицировании S. nodorum (рис. 16). Образцы пшеницы были отобраны с учетом их различной устойчивости к септориозу. При этом вид Т. urartu характеризовался высокой восприимчивостью, Т. топососсит средней восприимчивостью и Т. timopheevii - высокой устойчивостью. Как видно, в контрольных листьях пшеницы Т. urartu, не подвергнутых инфицированию, целевой амплификат с любой парой праймеров не проявляется, а его экспрессия происходит только в ходе инфицирования. Средне-восприимчивый образец Т. топососсит характеризовался изначальным снижением уровня экспрессии гена анионной пероксидазы, что вероятно связано с супрессорным воздействием гриба. Что интересно, к 4-м сут после инфицирования транскрипт начинает активно проявляться, что, вероятно, позволяет в последствии этому виду пшеницы сопротивляться инфицированию патогеном. Наиболее активно ген анионной пероксидазы экспрессировался у высокоустойчивого вида пшеницы Т. timopheevii.
Следовательно, синтез анионной пероксидазы у устойчивых растений конституционно поддерживается, что, вероятно, и обеспечивает их устойчивость к воздействию фитопатогена S. nodorum. Таким образом, можно полагать, что данный фермент является составной частью активной защиты растений при патогенезе. Полученные нами результаты коррелируют с известными данными о быстром накоплении активности анионной пероксидазы под влиянием инфицирования у других видов растений [Roberts etal., 1989].
Один из неспецифических путей запуска ответных реакций растений и синтеза защитных белков при патогенезе растений связан с образованием активных форм кислорода, в том числе перекиси водорода. В последнее время большой интерес вызывает образование перекиси водорода при окислении щавелевой кислоты с участием растительного фермента оксалатоксидазы [Азаришвили и др., 1996]. Роль оксалатоксидазы в защите растений от патогенов продемонстрирована в ряде работ [Dumas et al., 1995; Berna, Bernier, 1999; Hurkman, Tanaka, 1996]. Авторы этих исследований в качестве инфицирующего агента использовали биотрофные патогены. Известно, что характер защитных реакций определяется типом пищевой специализации патогена [Морозов, 1992]. Поэтому значительный интерес представляет изучение защитных реакций с участием оксалатоксидазы в растениях пшеницы при поражении некротрофным грибом Bipolaris sorokiniana. Этот патоген поражает в основном корни и основания стебля растений [Чулкина, 1985]. Известно, на долю корневой оксалатоксидазы в проростках мягкой пшеницы приходится 40% активности этого фермента [Berna, Bernier, 1999]. Следовательно, появление в зоне корневой системы пшеницы фитопатогенных микроорганизмов обязательно должно определенным образом отразиться на активности оксалатоксидазы, как одного из поставщиков перекиси водорода для пероксидаз.
Анализируя данные постинфекционных изменений активности оксалатоксидазы в корнях пшеницы, можно заметить, что ответная реакция определяется типом устойчивости сорта (рис. 17, 18). Так, уже через 24 ч после инфицирования у растений устойчивого сорта Заря активность оксалатоксидазы повышается во фракции, связанной с клеточными стенками, почти на 40 % по сравнению с контролем (рис. 18). В цитоплазматической фракции повышение активности оксалатоксидазы наблюдается через 48 ч
Динамика изменения активности этого фермента на ранних этапах патогенеза в местах внедрения патогена у растений восприимчивого сорта Жница иная: через 24 ч после заражения активность оксалатоксидазы во фракции, связанной с клеточными стенками, снижается относительно контроля на 25% (рис. 18), а в цитоплазматической фракции - повышается вдвое (рис. 17). Через 48 ч происходит снижение активности оксалатоксидазы в цитоплазматической фракции (рис. 17) и повышение активности во фракции, связанной с клеточными стенками (рис. 18), но различия между зараженными и здоровыми растениями становятся не столь
Влияние инфицирования фитопатогенным грибом В. sorokiniana на активность пероксидаз различной локализации в растениях устойчивой и восприимчивой пшеницы
Динамика изменения активности этого фермента на ранних этапах патогенеза в местах внедрения патогена у растений восприимчивого сорта Жница иная: через 24 ч после заражения активность оксалатоксидазы во фракции, связанной с клеточными стенками, снижается относительно контроля на 25% (рис. 18), а в цитоплазматической фракции - повышается вдвое (рис. 17). Через 48 ч происходит снижение активности оксалатоксидазы в цитоплазматической фракции (рис. 17) и повышение активности во фракции, связанной с клеточными стенками (рис. 18), но различия между зараженными и здоровыми растениями становятся не столь существенными, как в первые сутки после инфицирования.
Интересно, что, начиная с 72 ч после инфицирования, прослеживается схожесть ответных реакции растений устойчивого и восприимчивого сортов пшеницы по активации оксалатоксидазы в цитоплазматической фракции (рис. 17). В инфицированных растениях она выше уровня контрольных и максимальна в момент появления видимых симптомов заболевания (9-е сутки). В то же время в зараженных растениях восприимчивого сорта происходит подавление активности оксалатоксидазы во фракции, связанной с клеточной стенкой, в ходе развития болезни (рис. 18). В отличие от растений восприимчивого сорта активность связанной с клеточными стенками оксалатоксидазы в растениях устойчивого сорта остается выше уровня контрольных растений на всем протяжении опыта.
Участие оксалатоксидазы в защитном ответе при инфицировании грибными патогенами было показано на разных видах растений [Dumas et al., 1995; Berna, Bernier, 1999; Donaldson et al., 2001]. Считается, что фактором патогенности ряда грибов является щавелевая кислота (Cessna et al., 2000) и от активности растительной оксалатоксидазы зависит возможность ее нейтрализации и утилизации [Dumas et al., 1995]. Кроме этого, образующаяся при этом перекись водорода, действуя как вторичный мессенджер, включает экспрессию защитных генов [Mittler, 2002] и, кроме того, оксалатоксидаза непосредственно сама участвует в защитных реакциях [Thordal-Christinsen et al., 1997].
Таким образом, у растений устойчивого сорта уже в первые сутки после инфицирования происходит повышение активности оксалатоксидазы, связанной с клеточными стенками в местах внедрения патогена (корни) (рис. 18). Вероятно, активация именно этой фракции фермента обеспечивает успешное развитие защитных реакций. Известно, что внедрение В. sorokoniana и изменение метаболизма в инфицированных тканях наступает через 18 ч после нанесения инокулюма [Трошина и др. 1992]. Возможно, что усиление активности оксалатоксидазы, связанной с клеточными стенками, в первые сутки после заражения способствует генерации перекиси водорода, успешному сигналингу и, как следствие, своевременному запуску ответных реакции растений пшеницы, направленных на защиту. Гриб В. sorokiniana относится к патогенам, способным вырабатывать фитотоксины, которые дезорганизуют нормальный метаболизм клетки [Чулкина, 1985[. Можно предположить, что способность возбудителя корневых гнилей на ранних этапах патогенеза системно подавлять активность ферментов, участвующих в образовании АФК, является одним из факторов общей стратегии, направленной на преодоление защитных систем растения - хозяина. Влияние инфицирования фитопатогенным грибом В. sorokiniana на активность пероксидаз различной локализации в растениях устойчивой и восприимчивой пшеницы
Важнейшей каталитической системой, задействованной в индуцируемом патогенами и их элиситорами защитном ответе растений и, в частности, в регуляции уровня перекиси водорода в клетках, является пероксидаза. При ее участии происходит как непосредственное разложение молекул Н2О2, образующихся под действием оксалатоксидазы на ранних сроках защитного ответа растений, так и утилизация активных форм кислорода в процессе синтеза лигнина и суберина [Carpin et al., 1999]. Активирование пероксидазы в ответ на инфицирование может происходить как за счет активации имеющихся изоформ, так и в результате появления форм с иными каталитическими свойствами.
Мы изучили влияние инфицирования грибом В. sorokiniana на активность и изоферментный спектр пероксидаз в растениях пшеницы, различающихся по устойчивости к данному некротрофу. Полученные данные показывают, что в здоровых растениях пшеницы устойчивого сорта Заря активность пероксидазы в цитоплазматической фракции в несколько раз выше, чем в восприимчивых растениях сорта Жница (рис. 19 а, в). Через 24 часа после инфицирования у растений пшеницы как устойчивого (рис. 19 в), так и восприимчивого сортов (рис. 19 а) наблюдалось повышение пероксидазной активности, что является естественной реакцией клеток на воздействие патогенов. В то же время, обнаружились и определенные сортовые различия в динамике изменения активности пероксидазы в ходе патогенеза. У устойчивых растений после инфицирования происходило повышение активности цитоплазматической пероксидазы, которая значительно превосходила аналогичный показатель как здоровых (рис. 19 в), так и инокулированных растений восприимчивого сорта (рис. 19 а).
