Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Грибы белой гнили. Характеристика субстрата 8
1.1.1. Особенности строения лигнина - природного субстрата грибов белой гнили 8
1.1.2. Общая характеристика лигнинразрушающих грибов 11
1.1.3. Факторы, влияющие на селективность деградации лигнина 12
1.2. Общая характеристика ферментов лигнолитической системы 16
1.2.1. Лигниназа 17
1.2.2. Мп-пероксидаза 18
1.2.3. Лакказа 20
1.3. Физиологические функции ферментов лигнолитической системы 23
1.4. Биосинтез ароматических соединений грибами, возбудителями белой гнили 28
1.5. Образование гуминовых веществ в природе. Гуминоподобные вещества грибов предшественники гуминовых кислот 34
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Материалы и объекты исследования 45
2.2. Жидкофазное культивирование Cerrena maxima и Coriolus hirsutus 46
2.2.1. Поверхностное культивирование Cerrena maxima и Coriolus hirsutus 46
2.2.2. Глубинное культивирование Cerrena maxima и Coriolus hirsutus 47
2.3. Твердофазное культивирование индивидуальных штаммов Cerrena maxima и Coriolus hirsutus и их совместное культивирование на природном лигнинсодержащем субстрате - овсяной соломе 47
2.3.1. Изучение совместимости Cerrena maxima и Coriolus hirsutus при культивировании 47
2.3.2. Совместное и раздельное твердофазное культивирование данных штаммов 48
2.4. Очистка лакказы и Mn-пероксидазы Cerrena maxima 48
2.5. Методы определения активности лигнолитических ферментов 49
2.6. Определение биохимических и кинетических характеристик лакказы и Mn-пероксидазы Cerrena maxima 50
2.7. Выделение и очистка ГПВ грибов белой гнили 53
2.8. Синтез ГПВ in vitro с помощью лакказы С. maxima 54
2.9. Определение основных количественных и качественных хапактеоистик ГПВ 54
2.9.1. Элементный анализ 54
2.9.2. Определение молекулярных масс ГПВ методом эксклюзионной хроматографии 55
2.9.3. Спектрофотометрическии и ИК - спектроскопический анализ ГПВ...55
2.9.4. 13СЯМР спектроскопия препаратов ГПВ 55
2.10. Методы определения содержания основных компонентов растительного сырья 57
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 59
3.1. Скрининг культуры Cerrena maxima 59
3.2. Культивирование и биосинтез лигнолитических ферментов базидиомицета Cer. maxima 61
3.3. Выделение, очистка и изучение лакказы и Мп-зависимой пероксидазы Cer. maxima 67
3.3.1. Выделение и очистка лакказы и Мп-зависимой пероксидазы 67
3.3.2. Характеристика физико-химических свойств лакказы Cer. maxima 69
3.3.3. Характеристика физико-химических свойств Мп- пероксидазы Cer. maxima 78
3.3.4. Субстратная специфичность лакказы и Мп-пероксидазы Сег. maxima 84
3.4. Изучение роли лакказы и Мп-пероксидазы Сег. Maxima в процессе деградации лигнина на природных лигноцеллюлозных субстратах 87
3.5. Структурная характеристика и исследование роли лигнолитического комплекса в биосинтезе ГПВ 97
3.5.1. Получение ГПВ 97
3.5.2. Структурная характеристика ГПВ 101
Выводы 115
Список цитируемой литературы 117
- Особенности строения лигнина - природного субстрата грибов белой гнили
- Физиологические функции ферментов лигнолитической системы
- Изучение совместимости Cerrena maxima и Coriolus hirsutus при культивировании
- Культивирование и биосинтез лигнолитических ферментов базидиомицета Cer. maxima
Введение к работе
В настоящее время во всем мире ведется интенсивная разработка биотехнологий на основе лигнолитических грибов и ферментов как для обработки лигноцеллюлозных материалов, так и для утилизации лигнинсодержащих отходов. Лигнин - полимер ароматической природы, составляющий 25% сухого веса фотосинтезирующей биомассы. Для него насчитывается не менее десяти типов связей между фенилпропановыми структурными единицами, которые обуславливают высокую степень разветвленности молекулы и недоступность для действия большинства микроорганизмов.
Базидиальные грибы, возбудители белой гнили древесины, принадлежат к немногочисленной группе микроорганизмов, способных разрушать лигнин и обладающих уникальной системой лигнолитических ферментов: лигнинпероксидазы, лакказы и Мп-пероксидазы. Несмотря на то, что проблемой биоконверсии лигнина последние 20-25 лет активно занимаются многие научные коллективы, окончательного решения данного вопроса еще не найдено. Это связано со значительной сложностью строения лигноцеллюлозного субстрата, а также с недостаточной изученностью метаболизма грибов-лигнолитиков, в том числе механизма действия разлагающих лигнин ферментов. Для эффективного использования биотехнологических подходов весьма актуальным представляется изучение лигнолитического потенциала грибов белой гнили и физиологических функций основных лигнолитических ферментов. Известно, что некоторые виды высших базидиальных грибов, деструкторов древесины, обладают уникальными механизмами детоксификации как продуктов деградации лигнина, так и ксенобиотиков. Для грибов белой гнили некоторыми исследователями показано образование из продуктов деструкции лигноуглеводного комплекса гуминоподобных веществ (ГПВ), обладающих физиологической активностью. Однако до настоящего времени практически отсутствуют данные о механизме образования, структуре и биологических свойствах ГПВ; поэтому представляется актуальным исследование
7 особенностей синтеза подобных полимеров и их характеристика, а также выяснение функций лигнолитического комплекса в этом процессе.
Понимание роли лигнолитических ферментов в процессе деградации лигнина открывает возможные пути оптимизации переработки этого полимера и сопутствующий синтез на основе продуктов его деструкции таких соединений, как гуминоподобные вещества. Исследование ГПВ представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения метаболизма грибов белой гнили, так и с позиции применения данных микроорганизмов для получения препаратов, которые могут использоваться в медицине.
Основными целями настоящей работы являлись:
изучение лигнолитического потенциала смешанной культуры грибов белой гнили Cerrena maxima и Coriolus hirsutus при росте на различных лигноцеллюлозных субстратах по сравнению с индивидуальными штаммами грибов, синтезирующих различные доминирующие лигнолитические ферменты.
характеристика ферментов лигнолитической системы Cer. maxima: лакказы и Мп-пероксидазы
изучение физиологической роли данных ферментов в процессе деградации лигнина и образовании ГПВ
исследование структуры полученных ГПВ и подтверждение их гуминовой природы.
Особенности строения лигнина - природного субстрата грибов белой гнили
В настоящее время много работ посвящено изучению различных микроорганизмов, которые способны разлагать лигнин и целлюлозу, при этом особое внимание уделяется именно микроорганизмам деструкторам лигнина [1]. Только некоторые виды микроорганизмов обладают специфическими ферментативными системами, способными деполимеризовать лигнин и разрывать связь в ароматическом кольце. В природе существует особая группа грибов, главным образом, базидиомицетов, способная использовать этот полимер в качестве основного источника углерода. Базидиомицеты, известные как "возбудители белой гнили", все чаще сейчас называются просто грибами белой гнили из-за специфической окраски мицелия и самой древесины, пораженной данными грибами [2]. Лигнин, являющийся труднодеградируемым биополимером, слабо разрушается другими видами микроорганизмов, что обусловлено особенностями его химического строения. Для понимания сущности процессов деструкции лигнина целесообразно остановиться на рассмотрении особенностей его строения.
Лигнин является вторым по распространенности (после целлюлозы) биополимером в биосфере. "Мягкая" древесина хвойных пород деревьев содержит 22-33% лигнина, "твердая" древесина (лиственные породы) - 19-28%, однолетние растения - 14-27%. Лигнин инкрустирует целлюлозные фибриллы, обеспечивая прочность стволов деревьев и высокую устойчивость растительных тканей, защищая углеводные компоненты от биологического воздействия [2].
Известно, что лигнин состоит из углерода (58,6-69,0%), водорода (5,3-7,0%) и кислорода (24,0-30,4%), представляя собой смесь нерегулярных ароматических полимеров высокого молекулярного веса. Лигнин синтезируется растениями из фенилпропановых предшественников кониферилового, n-кумарового и синапового спиртов (рис. 1.1). Структура лигнина неоднородна: у разных групп растений и растений разного возраста она различна. Лигнин хвойных пород имеет мономером конифериловыи спирт, лигнин лиственных пород - конифериловыи и синаповый спирт, а лигнин травянистых растений - конифериловыи и n-кумаровый спирты [3].
С химической точки зрения, лигнин является сополимером, для которого характерна нерегулярность структуры. Для лигнина насчитывается не менее десяти типов связей между фенилпропановыми структурными единицами, которые обуславливают высокую степень разветвленности молекулы биополимера. Предполагают, что лигнин в древесине является пространственным полимером, имеющим сетчатую трехмерную структуру. В лигнине установлено наличие двойных связей, а также различных функциональных групп: метоксильных, гидроксильных, карбоксильных и карбонильных [1,2].
Лигнин не является индивидуальным веществом, поэтому представление его химического строения в виде строгой структурной формулы невозможно. Следует говорить только о характерных типах связей между структурными единицами лигнина и типах структур, входящих в его макромолекулы. Наиболее часто встречаются два основных типа связи: простые эфирные ((3-0-4) (рис. 1.2) и углерод-углеродные [3]: При работе с лигнином- следует учитывать, что на его свойства оказывает существенное влияние не только источник получения, но и метод выделения его из древесины. Путем рентгенографических исследований было выяснено, что лигнин обладает аморфной структурой. Молекулярная масса полимера варьирует в очень широком интервале (от 1000 до 150000 Да) [4]. Функциональные группы лигнина обладают высокой реакционной способностью. Благодаря фенольной природе лигнин легко окисляется. Кроме того, для него характерны макромолекулярные реакции деструкции и сшивания цепей. Лигнин растворяется в щелочах, но устойчив к действию минеральных кислот. В органические растворители данный полимер переходит из древесины только в присутствии минеральных кислот и при длительном кипячении [3]. Специфическая структура лигнина обеспечивает высокую устойчивость растительных тканей, защищая их углеводные компоненты от биологической деградации. Как упоминалось выше, только определенная группа микроорганизмов в природе - грибы белой гнили - способна избирательно деградировать лигнин до полной его минерализации. Следует более подробно остановиться на характеристике данных базидиомицетов. Отличительной особенностью грибов белой гнили среди всех дереворазрушающих грибов является то, что только они способны к глубокому разложению и усвоению лигнина. Грибы белой гнили весьма многочисленны и включают более 2000 видов. Чаще всего это представители семейства Polyporaceae, Thelephoraceae, Corticiaceae, Agaricaceae, Coprinaceae. Белую гниль древесины могут вызывать также некоторые виды аскомицетов порядка Sphaeriales [2]. Грибы белой гнили значительно отличаются друг от друга по способности минерализовать лигнин и углеводы древесных тканей. По этому признаку их разделяют на две группы:
Физиологические функции ферментов лигнолитической системы
Как уже указывалось выше, ферментативная система, участвующая в деградации лигнина, очень сложна и кроме окислительных ферментов включает также восстановительные. Вследствие сложной физиологии высших грибов, до настоящего времени однозначно не установлены физиологические функции каждого из трех основных лигнолитических ферментов, которые могут проявляться в зависимости от вида культуры и условий роста. Тем не менее, при рассмотрении огромного накопленного материала по грибам белой гнили, представляется в некоторой степени возможным осветить этот важный вопрос. Полное понимание функционирования основных ферментов в процессе деградации лигнина позволило бы создать модельную систему, решающую технологические проблемы отбеливания и варки древесины, а также утилизации лигнина. Деградация лигнина.
В настоящее время известно, что лигниназа играет значительную роль в деградации лигнина. Только с ее помощью возможно прямое разрушение нефенольных структур лигнина, происходящее через Са - Ср расщепление или алкил-фенильное расщепление. Однако деградация лигнина может происходить и в отсутствии лигниназы, когда окислительный процесс происходит при участии различных природных медиаторов реакционноспособных продуктов распада лигнина, например, 3-гидроксиантранилата [57].
Не менее значимым ферментом, чем лигниназа, в процессе разложения лигнина грибами белой гнили считается Мп-пероксидаза [58]. Этот фермент обладает уникальным свойством - он может непосредственно окислять Мп2+ до Мп3+ [20]. Ион Мп3+ в комплексе с органическим анионом (оксалатом, малонатом, анионом дикарбоновых или а-оксикарбоновых кислот) способен диффундировать на значительное расстояние в глубь древесины и окислять там концевые фенольные структуры лигнина. Возможно также окисление ионом Мп3+ некоторых низкомолекулярных медиаторов [59]. Обсуждается способность образовывать высокоактивные радикалы, разрушающие нефенольные структуры лигнина, особенно на начальных стадиях разложения лигнина, и фенолоксидазная способность фермента, однако, полного понимания роли Мп-пероксидазы в составе лигнолитического комплекса пока не достигнуто [60, 61]. Роль лакказы в процессе делигнификации в настоящее время полностью не выяснена [62]. Показано, что мутанты Sporotrichum pulverulentum, дефицитные по лакказному гену, не могут осуществлять деградацию лигнина, в то время как лакказа-положительные ревертанты эффективно осуществляют этот процесс [63]. Кроме того, было показано, что мутанты гриба белой гнили Pycnoporus cinnabarinus, дефицитные по лакказному гену, не обладали способностью минерализовать синтетический ДНР-лигнин, содержащий 14С в ароматическом кольце. Однако, способность гриба деградировать лигнин восстанавливалась при добавлении чистой лакказы этого же штамма [64]. Считают, что при действии на лигнин данный фермент катализирует следущие реакции [8, 56, 62]: полимеризацию (за счет рекомбинации радикалов), деметилирование, образование хинонов. Хотя лакказа может катализировать процесс деградации лигнина in vitro, низкомолекулярные компоненты могут реполимеризоваться в ходе реакций [65]. Поэтому высказывается предположение, что важная функция лакказы заключается не в окислении лигнинов, а во влиянии на полимеризацию продуктов их окисления [66]. Тем не менее, деметилирование полимерного лигнина, являющееся следствием первичной атаки фенолокисляющих ферментов, представляет собой ключевой этап во всем процессе биодеградации лигнина [8]. Генерирование перекиси водорода.
Имеются данные об ассоциации внеклеточной Mn-пероксидазы с поверхностью грибного мицелия. ІІри отсутствии в среде Н202 фермент сам продуцирует перекись водорода, используя в качестве субстратов восстановленый глутатион, НАДН, дитиотреитол и другие вещества [8, 19]. Кроме того, ряд авторов предполагает, что физиологическая роль Мп-пероксидазы может также заключаться в генерировании Н202, используемой лигниназой в качестве субстрата [19, 60]. Лигниназа и лакказа никак не проявляют себя в этом процессе. Формирование пигментов. О роли лигниназы и Mn-пероксидазы в этом процессе неизвестно. Однако образование пигмента является наиболее изученной физиологической функцией грибных лакказ. Лакказа-дефицитный мутант Aspergillus nidulans образует желтые споры вместо зеленых, образуемых диким штаммом. При внесении в среду роста этого мутанта частично очищенной лакказы наблюдалось формирование зеленых спор, характерных для дикого штамма [67]. Есть и другие данные, подтверждающие участие лакказы в формировании .пигментов этого штамма [68]. Pycnoporus cinnabarinus, гриб белой гнили, способен образовывать красный пигмент циннабариновую кислоту при участии лакказы. Примечательно, что образование пигмента происходило при росте культуры на среде, содержащей глюкозу, и практически прекращалось, когда в качестве источника углерода выступала целлюлоза или целлобиоза [69]. Авторы связывают этот факт с действием другого фермента - целлобиозо хиноноксидоредуктазы, препятствующей реакции реполимеризации фенольных соединений, окисленных лакказой. Одновременно с этим целлобиозо-хиноноксидоредуктаза катализирует окисление целлобиозы в целлобионолактон. Этот пример сопряженного действия двух ферментов указывает на взаимосвязь процессов деградации лигнина и углеводной части древесины. Фитопатогенный аскомицет Gaeumannomyces graminis var. tritici синтезирует лакказу, участвующую в формировании высокомолекулярных меланиновых пигментов и деполимеризации лигнина инфицированных растений
Изучение совместимости Cerrena maxima и Coriolus hirsutus при культивировании
При глубинном культивировании продуцента для индукции биосинтеза внеклеточной лакказы в питательную среду вышеуказанного состава вносили дополнительно CuS04 в количестве 0,25 г/л. Среду доводили до значения рН 6,0 и стерилизовали автоклавированием при 1 атм. в течение 30 мин.
Дальнейший рост продуцента проводили глубинным способом в колбах. Мицелий, полученный при поверхностном выращивании культуры, размельчали керамическими бусами, находящимися в колбе, до малых размеров. Полученный таким образом инокулят вносили в колбы емкостью 750 мл со средой в количестве 10-15 % от объема среды. Культивирование осуществляли на круговых лабораторных качалках при 120-160 об/мини температуре 27-28С в темной аэрируемой камере.
Для индукции биосинтеза внеклеточной Мп-пероксидазы при глубинном росте Cerrena maxima были использованы те же условия и среда того же состава, что и для получения лакказы, однако вместо меди добавляли MnS04 в количестве 0.121 г/л. Среду доводили до значения рН 5,2 титрованием винной кислотой и стерилизовали автоклавированием при 1 атм. в течение 30 мин. 2.3. Твердофазное культивирование индивидуальных штаммов Сеггепа maxima и Coriolus hirsutus и их совместное культивирование на природном лигнинсодержащем субстрате - овсяной соломе Изучение совместимости Сеггепа maxima и Coriolus hirsutus при культивировании. Грибы выращивали при 28С на твердой среде Чапека-Докса, содержащей 20 г/л тонко измельченной овсяной соломы в качестве единственного источника углерода. Для получения посевного материала использовали 10-сут культуры, полученные описанным выше поверхностным культивированием. Из чашек с выросшими культурами вырезали агаровые блоки диаметром 8 мм и раскладывали их попарно на чашки со средой того же состава. Инкубировали 20 сут при 28С. Поставленные эксперименты дали возможность оценить способность данных грибов утилизировать овсяную солому, а также возможность совместного культивирования исследуемых штаммов с целью ускорения процессов разложения и гумификации соломы. Совместное и раздельное твердофазное культивирование данных штаммов.
Совместное выращивание штаммов Сеггепа maxima, Coriolus hirsutus, а также исследуемых индивидуальных культур проводили в течение 48 дней. Первые семь дней культивирование осуществлялось в тёмном помещении при температуре 28 С, а затем в помещении с температурой 37 С.
Грибы выращивали твердофазным способом на растительном субстрате - соломе овса - в качалочных колбах объемом 750 мл в стационарных условиях при 37С в течение 45 суток. Субстрат перед засевом автоклавировали при 120 С и 1 атм. в течение 1 ч. Количество мелкоизмельченного субстрата (размер частиц не более 1 см) в каждой колбе составляло 10 г. Среда для культивирования на соломе, вносимая в каждую колбу в количестве 50 мл, содержала медь (0,25 г/л) и не содержала глюкозы. В каждую колбу вносили 30 мл гомогенизированного инокулята, полученного при поверхностном жидкофазном выращивании культур, как описано выше. Внеклеточную лакказу, синтезируемую базидиомицетом С. maxima, выделяли из культуральной жидкости продуцента, выращенного в условиях глубинного культивирования, путем осаждения 90% сульфатом аммония в течение 2 часов при постоянном перемешивании и контроле рН. Осадок собирали центрифугированием при 2500 g в течение 30 мин и перерастворяли его в 200 мл дистиллированной воды. После 24-х часового диализа против 0,005 М К-фосфатного буфера рН 6,0 препарат фермента наносили на колонку (1x20 см) с ДЕАЕ-Тоуореагі 650 М, уравновешенную 5 мМ фосфатным буфером, рН 6,0. Белок элюировали линейным градиентом ионной силы 2x150 мл, создаваемой К-фосфатным буфером рН 6,8 с молярностью от 5 мМ до 200 мМ. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяли и после диализа против 5 мМ фосфата рН 6,0 рехроматографировали на колонке с DEAEoyopearl 650 М в тех же условиях, но с более пологим градиентом ионной силы (2x250 мл). Полученный препарат имел 95% чистоты согласно данным высокоэффективной жидкостной хроматографии. Внеклеточную Mn-пероксидазу из базидиомицета С. maxima также выделяли из культуральной жидкости продуцента, выращенного в условиях глубинного культивирования, путем ультрафильтрации на аппарате АР02 15ПА (Россия) с мембраной (предел отсечения - 15 кДа). Полученный отдиализованный ультрафильтрат при значении рН = 4 наносили на колонку (0,4x20 см) с носителем полибуфером-ионообменником 94 на основе Сефарозы 6В, уравновешенную 0,025 М буфером гистидин-HCl при том же значении рН. Белок элюировали 0,025 М полибуфером 74 при рН 3,1. Отдельные активные фракции после диализа против 0,025 М буфером гистидин-HCl при рН 4,0 рехроматографировали на колонке с полибуфером-ионообменником 94 на основе Сефарозы 6В в тех же условиях. Полученный препарат имел 95% чистоты согласно данным высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методы определения активности лигнолитических ферментов.
Метод определения активности лакказы. Измерение скоростей ферментативных реакций, катализируемых лакказой, проводили спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра Hitachi-557 (Япония). Активность лакказы детектировали при длине волны 410 нм, используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0.1 М Na-ацетатном буфере рН 4.5. Пирокатехин был предварительно очищен возгонкой в вакууме. За условную единицу активности принимали приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 мин. Удельную активность рассчитывали на 1 мг белка. Метод определения активности Мп-пероксидазы. Активность определяли, используя в качестве субстрата Мп2+. Катализируемая ферментом реакция проходит согласно уравнению: 2Мп2+ + Н202 — 2Мп3+ + Н20. Реакционная смесь содержала фермент; 0,1 М тартратный буфер рН 5,0; 0,1 мМ Н202 и 0,1 мМ MnS04. Реакция проводилась в 1 см кювете и инициировалась добавлением Н202 и MnS04. Продукт, Мп (III), образует мало стабильный комплекс с винной кислотой, имеющий характеристическое поглощение при 238 нм (є=6500 М"1 см"1). За единицу активности принимали окисление 1 мкмоль Мп (II) за 1 мин. Удельную активность рассчитывали на 1 мг белка.
Культивирование и биосинтез лигнолитических ферментов базидиомицета Cer. maxima
Для изучения физико-химических и биохимических характеристик указанных лигнолитических ферментов, а также для исследования возможности их практического применения в области биотехнологии, необходимо было разработать методы получения ферментов в достаточных для решения поставленных задач количествах.
С этой целью было предпринято сравнительное исследование поверхностного и глубинного культивирования базидиомицета Сег. maxima на глюкозо-пептонной среде с целью выбора наиболее эффективного способа культивирования. Кроме того, проводился подбор условий культивирования (концентрации ионов Си 2+ и Мп 2+, рН среды роста) для оптимизации синтеза внеклеточных лакказы и Мп-пероксидазы.
Изучение динамики роста культуры Сег. maxima показало, что при поверхностном росте культуры пик накопления лакказной активности в среде культивирования наблюдался на 18 сутки. При этом характерным являлось наличие двух пиков лакказной активности в процессе роста культуры гриба (рис. 3.2). Исследование активности Мп - пероксидазы при поверхностном росте культуры базидиомицета Сег. maxima показало, что пик активности фермента, как и для лакказы, наблюдался на 18 сутки (рис. 3.2), кроме того, наблюдался только один пик накопления фермента.
Изучение динамики глубинного роста культуры Сег. maxima показало, что пик лакказной активности наблюдался на 9 сутки, причем активность фермента в культуральной среде была в два раза выше, чем при поверхностном способе культивирования (рис. 3.3). При глубинном культивировании наблюдался только один пик накопления активности фермента. Исследование накопления биомассы Сег. maxima в условиях глубинной культуры было показано, что исследованный штамм имел следующие фазы роста: лаг-период; фаза ускорения роста; фаза экспоненциального роста; фаза замедленного роста; стационарная фаза роста; фаза отмирания. Наибольшее содержание внеклеточных ферментов для исследуемого штамма соответствовало концу экспоненциальной или началу квазистационарной фазы роста.
Для Мп-пероксидазы при глубинном культивировании максимальное накопление приходилось на 6 - 7 день культивирования (рис. 3.4), причем активность фермента была в 3,8 раз выше, чем при поверхностном культивировании.
Как известно, в современной биотехнологии при получении ферментных препаратов предпочтение отдается глубинному способу культивирования. В условиях глубинного роста использование специально подобранной питательной среды, обогащенной кислородом, способствует интенсивному росту культуры и повышенному синтезу биологически активных веществ, вследствие чего продуктивность культуры значительно увеличивается, что является важным фактором при получении значительных количеств ферментов. Основываясь на результатах проведенных исследований, мы пришли к аналогичному выводу и в дальнейшем для биосинтеза ферментов использовали метод глубинного культивирования штамма Cer. maxima.
. Динамика активности лакказы и Mn-пероксидазы Cer. maxima при поверхностном культивировании. 1 - лакказная активность, 2 - Мп-пероксидазная активность. Следует отметить, что для индукции синтеза лакказы содержание ионов меди в культуральной среде было доведено до 3,9 мМ, а начальный рН среды - до 5,8. В ходе проведенных исследований данная концентрация ионов меди и значение рН были найдены оптимальными для максимального образования фермента и использовались во всех экспериментах по глубинному культивированию.
