Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16
1.1. Первичная продукция и фотосинтез 16
1.2. Методы расчета первичной продукции 18
1.2.1. Принципиальные возможности измерения первичной продукции и их практическая реализация 18
1.2.2. Кислородный и радиоуглеродный методы измерения первичной продукции 22
1.3. Практическое применение кислородного и радиоуглеродного методов на водоемах 23
1.3.1. Измерения первичной продукции на водоеме без применения склянок 23
1.3.2. Измерение первичной продукции с использованием темных и светлых склянок 24
1.3.2.1. Принцип метода и его варианты 24
1.3.2.2. Совершенствование методики склянок 25
1.3.2.3. Преимущества и ограничения метода склянок в разных его модификациях 27
1.3.2.3.1. Общие ограничения метода склянок 27
1.3.2.3.2. Ограничения кислородного метода с применением склянок 27
1.3.2.3.3. Ограничения применения радиоуглеродного метода по методике склянок 28
1.3.2.3.4. Ограничения применения техники инкубаторов 29
1.3.2.3.5. Пересчет первичной продукции 30
1.3.2.3.6. Прогнозирование величины первичной продукции 30
1.4. Характеристика первичной продукции при помощи спектральных методов 31
1.4.1. Измерение отраженного света водоема 32
1.4.2. Флуоресцентный подход к получению характеристик фитопланктона и его продукции 34
1.4.2. Зависимость между флуоресценцией фитопланктона in. trim и Хл.а 34
1.4.2.2. Флуоресценция хлорофилла водорослей и первичная продукция фитопланктона 37
1.4.2.2.1. Методика применения dCMU 37
1.4.2.2.2. Применение D0MU в условиях культуры 37
1.4.2.2.3. Связь между флуоресценцией хлорофилла а in. Hif-o с применением BUMU и первичной продукцией фитопланктона 38
1.4.2.2.4. Замедленная флуоресценция и флуоресценция фитопланктона без ингибитора; их связь с первичной продукцией 40
1.4.2.2.5. Флуоресценция хлорофилла in tro, видовые различия и физиологическое состояние водорослей 41
1.4.2.2.6. Ограничения метода применения флуоресценции хлорофилла для характеристики способности фитопланктона к фотосинтезу 42
1.5. Физические и фотосинтетические фундаменты методов, основанных на изучении флуоресценции 45
1.5.1. Природа флуоресценции 45
1.5.2. Спектр и индукционная кривая флуоресценции 47
1.5.2.1. Спектр флуоресценции 47
1.5.2.2. Индукционная кривая флуоресценции, ее связь с процессами фотосинтеза 47
1.5.2.3. Действие 1)0МІ/ на индукционную кривую флуоресценции 50
1.5.3. Способы регистрации флуоресценции хлорофилла в экологических исследованиях 50
1.6. Перечень задач, требующих решения 52
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
2.1. Объекты исследований и условия культивирования водорослей 55
2.1.1. Объекты исследования 55
2.1.2. Условия выращивания водорослей 55
2.1.3. Модифицированные условия выращивания водоросли 58
2.2. Методика измерения ростовых параметров
культуры водорослей 59
2.2.1. Определение оптической плотности суспензии 59
2.2.2. Определение содержания сухой биомассы 59
2.2.3. Определение содержания фотосинтетических пигментов 60
2.2.3.1. Определение содержания хлорофиллов а, в, с 60
2.2.3.2. Определение содержания феофетина а и фео-форбида 61
2.3. Газохроматографическое определение содержания кислорода и интенсивности фотосинтеза культур планктонных водорослей 62
2.3.1. Определение содержания кислорода в водной среде 63
2.3.2. Измерение фотосинтеза культуры водорослей 64
2.3.2.1. Измерение фотосинтеза с экспонированием пробы в склянках без газовой фазы 64
2.3.2.2. Измерение фотосинтеза с экспонированием пробы в склянках с газовой фазой 65
2.3.3. Калибровка газового хроматографа кислородом 66
2.4. Регистрация параметров флуоресценции водорослевой суспензии 67
2.4.1. Описание флуоресцентной установки 67
2.4.2. Запись спектра флуоресценции в аналоговом и цифровом виде 70
Параметры, характеризующие спектр флуоресценции и их получение 71
Регистрация индукции /кинетики/ флуоресценции 73
Методы обработки результатов 75
РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГАЗОХРОМОТОГРАФИЧКСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА 78
СПЕКТРЫ СТАЦИОНАРНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ВОДОРОСЛЕВОЙ СУСПЕНЗИИ IJV VIVO И КРИВЫЕ РОСТА ВОДОРОСЛЕЙ 87
Рост водоросли и изменения в спектре флуоресценции 87
Изменения в физиологическом состоянии водоросли s и характеристика соотношения 1648-682 9I
Кривые роста водоросли 5, и изменения в спектре флуоресценции 93
Рост водоросли и изменения в спектре флуоресценции 97
Различия между водорослями по спектрам флуоресценции в красной области 100
ИНДУКЦИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ВОДОРОСЛЕВОЙ СУСПЕНЗИИ IN VIVO БЕЗ И С ДОБАВЛЕНИЕМ CMU... 103
Индукция флуоресценции как индикатор таксономических и физиологических различий водорослей 103
Подбор концентрации ингибитора CMU и способы измерения интенсивности индукционного
сигнала 108
СВЯЗЬ ПАРАМЕТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА W VIVO , ПОЛУЧАЕМЫЕ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ OMUС ИНТЕНСИВНОСТЬЮ ФОТОСИНТЕЗА И СОДЕРЖАНИЕМ ХЛОРОФИЛЛА В ВОДОРОСЛЕВОЙ СУСПЕНЗИИ 114
Связь между отношением F+CMUr-CMU и ПДл.а 114
6.2. Связь между F+CMU и ПДл.а V. 119
6.3. Связь между г+вмц и Хл.а 121
7. СВЯЗЬ ПЛОЩАДИ СПЕКТРА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛО РОФИЛЛА W V1V0 С ИНТЕНСИВНОСТЬЮ ФОТО СИНТЕЗА И Хл.а ВОДОРОСЛЕВОЙ СУСПЕНЗИИ 125
7.1. Связь между ПС и Пхл.а 125
7.2. Связь между ПС и Хл.а 127
8. ОТНОШЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТЕЙ ДВУХ ГЛАВНЫХ
ПОЛОС СПЕКТРА-ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА VIVO И ЕГО СВЯЗЬ С ФОТОСИНТЕЗОМВОДОРОСЛЕВОЙ СУСПЕНЗИИ 130
8.1. Отношение интенсивности флуоресценции фикобилинов к максимуму спектра флуорес
ценции хлорофилла и интенсивность фотосинтеза 130
8.2. Отношение 704-684 и интенсивность фотосинтеза водоросли 133
8.3. Отношение 712-687 и интенсивность фотосинтеза водоросли 134
9. ОБЩЕЕ ОБСЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 136
ВЫВОДЫ 142
СПИСОК ОСНОВНОЙ ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 145
ПРИЛОЖЕНИЕ 160
- Первичная продукция и фотосинтез
- Описание флуоресцентной установки
- Рост водоросли и изменения в спектре флуоресценции
- Индукция флуоресценции как индикатор таксономических и физиологических различий водорослей
- Связь между отношением F+CMUr-CMU и ПДл.а
Первичная продукция и фотосинтез
В экологии гидробиологических систем важную роль играют основные понятия "продукция" и "продуктивность". Не вдаваясь в определения этих двух понятий и различий между ними, мы остановимся лишь на понятии продукция как выражении количества органического вещества, которое накапливается популяцией определенного вида или всей экосистемой на протяжении определенного интервала времени [ікО ак известно, в каждой экосистеме различают два вида продукции - первичную и вторичную. Первичная продукция является основой вторичной продукции экосистемы. Поэтому ее четкое дифференцирование и количественная оценка являются ключевыми моментами в исследовании экосистемы.
Под первичной продукцией понимают количество органического вещества, образованное автотрофными организмами из неорганических соединений на протяжении определенного временного интервала [JISJJ , кроме того "способность экосистемы, потребляя внешнюю энергию обоих видов - лучистую и химическую, создавать первичные органические соединения высокого химического потенциала для дальнейшего их превращения и транспорта к более высоким уровням системы" [129] .
Первичную продукцию разделяют на валовую и чистую. Валовая первичная продукция означает общее количество органического вещества, образующегося в процессе фотосинтеза за единицу времени, включая и часть ее, расходуемую на дыхание [lI9] . Этот же автор определяет чистую первичную продукцию как количество органического вещества, накапливаемого автотрофами за единицу времени. Поскольку часть органического вещества расходуется на дыхание и тепловые потери, сопровождающие фотосинтез, обменные процессы, размножение клеток, чистая первичная продукция, как правило, меньше, чем валовая [lI9j .
На основе сформулированного выше определения первичной продукции обнаруживаются различия между ней и фотосинтезом. Последний представляет собой "процесс биологического преобразования электромагнитной /лучистой/ энергии в химическую" 19] . В результате этого преобразования полученная химическая энергия обнаруживается в форме энергии химических связей молекул органического вещества. В клетках автотрофных организмов образование органических веществ сопряжено не только с фотосинтезом, но и такими процессами, как усвоение ряда питательных веществ, их транспорта и метаболических превращений.
Описание флуоресцентной установки
Установка, на которой проводились измерения, собрана в Институте физиологии растений АН УССР /Киев/. Ее подробное описание имеется в литературе [б]. На рис.2 показана схема установки.
Источником света, возбуждающего флуоресценцию, являлась ртутная лампа ДРШ-250-3. Световой пучок направлялся системой оптических элементов /см.рис.2/ на образец, толщина водорослевой суспензии в кювете - I см. Длина волны возбуждающего света -435 нм. На 90 от линии облучения образца возбуждающим светом конденсором собирали флуоресцентное излучение. Далее флуоресценцию направляли через механический модулятор 8, создающий частоту 1000 Гц и через красный светофильтр 10 в монохроматор, диф-фракционная решетка которого имеет 600 штрихов на I мм. Проходя через ФЭУ-12, уже модулированный световой поток превращается в электрический сигнал. Этот сигнал через согласующий катодный повторитель попадает в настроенный на ту же частоту 1000 Гц резонансный усилитель 13, который усиливает величину сигнала. Син-хродетектор 14 селектирует полезный сигнал по фазе и преобразует его в постоянное напряжение, которое поступает на регистрирующий потенциометр 15. Далее, чтобы записать сигнал в форме дискретной записи на перфоленте, напряжение поступает в цифровой вольтметр 16, который преобразует его в цифровом виде. Транскриптор кодирует сигнал в код ЭВМ Мир-2 и перфоратор вырабатывает перфоленту для обработки данных на указанной машине.
Рост водоросли и изменения в спектре флуоресценции
Водоросль выращивали на протяжении месяца. За это время водорослевая суспензия, как видно по изменению БМ и Хл.а, прошла через лог-фазу до седьмого дня и потом через разные этапы стац-фазы роста /см.рис.5/. В разные моменты роста культуры были записаны спектры флуоресценции водорослевой суспензии г /г viiro. На рис.6 хорошо видны различия в этих спектрах для суспензий водорослей, в которых преобладают молодые или старые, отмирающие клетки. В спектре флуоресценции последних возрастает интенсивность высвечивания фикобилинового плеча относительно максимума спектра. В интенсивности флуоресценции длинноволнового плеча также есть изменения, однако их трудно четко идентифицировать, поскольку во второй производной спектра флуоресценции не удается наблюдать ясно обособленных полос /см.рис.7/. Представленная на рис.7 вторая производная подтверждает предположение о природе коротковолнового плеча спектра флуоресценции. Плечо при 648 нм, по-видимому, принадлежит С-фикоцианину анабены. Это устанавливается при сравнении полученной нами второй производной с результатами других авторов [20, 22]. Наблюдаемые компоненты второй производной анабены с максимумами при 642, 656 и 660 нм близки к максимумам второй производной флуоресценции препарата С-фикоцианина 642, 652 и 660 нм, экстрагированного из водоросли ftna-cbsii s ы.-c/ufart$ [20].
Индукция флуоресценции как индикатор таксономических и физиологических различий водорослей
Индукционная кривая флуоресценции /быстрая и медленная фазы/ водорослевой суспензии с/г iH&o дает определенную информацию о таксономической принадлежности водорослей /см. раздел 1.4.2.2.5./. В наших экспериментах имелась возможность записать только медленную фазу индукционной кривой. На рис.15 можно сравнить индукцию молодой и старой культур водоросли Д, lHLi LCL6vtis Молодая культура демонстрирует более характерную кривую индукции флуоресценции, в то время как кривые индукции флуоресценции у водоросли в присутствии BMU и старой культуры не имеют почти никаких изгибов. Кривые индукции флуоресценции старой и молодой культур в присутствии CMU очень близки по своей форме.
Подобное положение наблюдается и у кривых, показанных на рис.16. Надо отметить, что кривые индукции флуоресценции молодой культуры $. &ijutjo,ius без CMU отличается от соответствующей кривой для Д. variaiifeb На рис.17 представлены кривые индукции флуоресценции для диатомеи /. ігісоґпциту подобные полученным другими авторами [88].
Сравнивая кривые индукции флуоресценции для молодых культур представителей типов водорослей, можно отметить четкие различия между ними. Однако эти различия не наблюдаются в стационарной фазе роста, где кривая индукции для культуры без OMU почти не отличается от кривой индукции водоросли в присутствии CMU\ Можно полагать, что медленная фаза индукции флуоресценции может дать информацию о принадлежности водорослей к определенному типу только при преобладании в суспензии молодых клеток.
Связь между отношением F+CMUr-CMU и ПДл.а
Как уже было отмечено в литературном обзоре /1.4.2.2./, зависимость между P+fiCMufi-DDMU и Дл.а в последнее время интенсивно изучается многими исследователями как в культурах, так и непосредственно в водоемах и в полевых условиях. Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными других авторов [80, 99, І0Ґ). Обнаруженная нами и описанная в литературе зависимость между ч-ОМи/Я-СМи и П/Хл.а обычно наблюдалась на активно растущих культурах. Поэтому в первых экспериментах мы поставили перед собой задачу исследовать характер этой зависимости в лог- и стац-фазах роста культуры, поскольку в пресноводных водоемах повышенное количество органических веществ авто- и аллохтонного происхождения может существенно повлиять на измерения флуоресценции. Как видно из табл. 3, 4 и 5, между обсуждаемыми величинами в лог-фазе роста культуры наблюдается в большинстве случаев достоверная положительная линейная корреляция для Р=0,95. Только в одном случае эта корреляция переходит в отрицательную в стац-фазе роста /см. табл.4/, что, по-видимому, можно объяснить отмиранием значительного числа клеток. Очевидно, наличие больших количеств отмерших клеток способно за счет уменьшения отношения fi+CMU г-Сми приводить к существенному искажению изучаемой зависимости [l28j. В таких случаях вряд ли имеет смысл вычислять общий коэффициент линейной корреляции или регрессии, поскольку эти коэффициенты, очевидно, различаются для высокого уровня достоверности.
В эксперименте с культурой ff vafiavtcvs вычисляли линейные регрессионные уравнения для лог- и стац-фаз роста культуры между BMU/P-CMU и ПДл.а на основе результатов, приводимых в табл.7.
