Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. "Основной белок миелина диагностике демиелинизирумнциж процессов ЦВСИ
1.1. Структура и функции миелина 7
1.2. Основной белок миелина. Структура, функции, физико-химические свойства. 12
1.3. Биологическая роль ОБМ. 20
1.4. ОБМ в филогенезе и онтогенезе. 22
1.5. Клинико-диагностическое значение ОБМ 24
ГЛАВА 2 Материалы и методы
2.1. Характеристика изучаемого материала . З 3
2.2. Методы очистки антигенов 33
2.3. Получение антисывороток к ОБМ и их анализ. 36
2.4. Методы иммунохимического анализа. 37
2.5. Методы количественного определения белков. 39
2.6. Иммуноферментный анализ. 40
2.7. Иммунофлюоресцентный анализ 52
2.8. Общая клиническая характеристика обследованных детей. 53
ГЛАВА 3 Разработка способа получения обм и изучение его физико-химических свойств .
3.1. Выделение ОБМ 66
3.2. Изучение физико-химических свойств и химической характеристики ОБМ 74
ГЛАВА 4 Получение гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к обм .
4.1 Получение гибридом продуцирующих моноклональные анти-ОБМ- антитела . 77
4.2. Получение моноклональных анти-ОБМ-антител из асцитической 78
жидкости.
ГЛАВА 5 Иммуноферментный анализ обм в биологических жидкостях человека .
5 1. Разработка иммуноферментного анализа ОБМ в биологических жидкостях и экстрактах из тканей человека и животных 86
5.2. Разработка иммуноферментного анализа анти-ОБМ-АТ в биологических жидкостях человека и животных. 89
5.3. Результаты иммунохимического определения ОБМ и антител к нему в сыворотке крови детей с перинатальной патологией ЦНС. 92
ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов. 104
Выводы 114
Практические рекомендации 115
Список литературы 116
- Структура и функции миелина
- Характеристика изучаемого материала
- Выделение ОБМ
- Получение гибридом продуцирующих моноклональные анти-ОБМ- антитела
Структура и функции миелина
Основополагающие исследования, посвященные изучению структуры миелина, были выполнены в 70-80 годы прошлого века [37, 51, 59, 93, 104, 105, 114, 169, 183, 240, 247, 283]. Согласно этим работам, уникальная структура миелина формируется путем спирального обвития аксонов нейронов отростками миелинобразующих клеток [101]. В пределах серого вещества головного мозга определяется крайне незначительное количество миелина. Процесс миелинизации в центральной нервной системе (ЦНС) и периферической нервной системе (ПНС) в целом сходен, однако имеются некоторые различия. В миелинизации нервных проводников в ЦНС принимают участие олигодендроглиоциты, при этом каждый из них может образовывать сегменты миелиновой оболочки сорока и более аксонов[51] В пределах ПНС миелинизация происходит с участием шванновских клеток, при этом каждая миелинобразующая клетка имеет связь только с одним аксоном [107]. Сегменты миелина прерываются на всем протяжении аксона перехватами Ранвье, в области которых происходит непосредственное соприкосновение аксолеммы нервного волокна с внеклеточным пространством. Расстояния между такими перехватами в пределах ЦНС и ПНС различны и составляют 10,7 и 10,9 нм соответственно [101].
Отростки миелинобразующих клеток содержат небольшое количество цитоплазмы, включающей единичные митохондрии и значительное количество микротрубочек. В процессе обвития цитоплазма вытесняется из отростков в тело клетки, приводя к формированию дупликатуры плазматической мембраны. При этом происходит тесное соприкосновение внутренних поверхностей мембран, с образованием так называемой главной плотной линии (major dense line), толщиной 2-3 нм. Наружные поверхности мембраны также соприкасаются и образуют промежуточную линию {interperiod line), толщиной 10 нм [101]. При электронно - микроскопических исследованиях такая периодичность выглядит как чередование светлых и темных полос различной интенсивности
Для миелиновой оболочки ПНС в большей степени, чем для ЦНС характерно наличие так называемых насечек (щелей) Шмидта-Лантермана [107]. Они представляют собой участки, на которых цитоплазматические поверхности мембраны не соприкасаются между собой, образуя своеобразные «карманы» В них содержится цитоплазма и немногочисленные клеточные органеллы. Насечки Шмидта-Лантермана присутствуют в каждом слое миелина. Мембрана миелинобразующих клеток представляет собой бислой, образованный липидами и белками, однако количественный и качественный состав ее компонентов существенно отличается от других мембран. Миелиновая мембрана сильно насыщена водой и характеризуется высоким соотношением липид : белок. Липиды миелина составляют порядка 75-80% его сухой массы, на долю белков приходится всего 25-30%. Миелин спинного мозга имеет более высокое по сравнению с головным мозгом соотношение липид . белок [74, 101].
Среди липидов миелина большую часть (43%) составляют фосфолипиды; галакто-липиды и холестерин представлены приблизительно в равном соотношении - 29 и 28% соответственно [74]. Галактолипиды являются специфичными маркерами миелинобразующих клеток, в то время как фосфолипиды (плазмалоген, фосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидил-серин и инозитфосфатиды), представлены и в других тканях [184].
С возрастом происходит изменение состава миелина [74]. Миелин взрослого человека содержит значительно большее количество галактолипидов и сниженное количество лецитина по сравнению с ранним возрастом. В целом в течение жизни происходит постепенное увеличение количества низкомолекулярных липидов и параллельное снижение содержания высокомолекулярных
В структуре миелиновой мембраны присутствует два вида белков - внутренние (intrinsic proteins) и внешлие (extrinsic proteins) Первые прочно связаны с мембраной, пронизывая ее насквозь, вторые связаны слабее и локализуются на поверхности [47]. Миелиновая мембрана представляет собой асимметричное образование, как по химическому составу, так и по электрическому заряду На ее внеклеточной поверхности располагаются углеводные остатки гликопротеинов и гликолипидов, при этом С-конец гликопротеинов находится на цитоплазматической стороне мембраны, тогда как полисахаридный остаток экспонирован на экстрацеллюлярной поверхности [37, 47, 101].
Основной функцией миелина является обеспечение быстрого проведения нервного импульса по тем аксонам, которые он окружает Мембраны клеток, формирующих миелин, плотно соприкасаются, что создает высокое сопротивление и малую электрическую емкость, обеспечивая, таким образом, эффективную изоляцию аксона и предотвращая продольное распространение импульса Миелин прерывается только в области перехватов Ранвье, расстояние между которыми может варьировать от 0,2 до 1 мм и более в крупных аксонах. В связи с тем, что ионные токи не могут проходить сквозь миелин, вход и выход ионов осуществляется лишь в области перехватов, где расположены кальциевые каналы. Это ведет к увеличению скорости проведения нервного импульса [51]. Известно, что в миелинизированном волокне она пропорционально его диаметру, тогда как в немиелини-зированном — квадратному корню из его диаметра. В целом, по миелинизированным волокнам импульс проводится приблизительно в SO раз быстрее, чем по немиелинизирован-ным [276].
Миелин представляет собой метаболически активную структуру, в которой постоянно происходит синтез и преобразование компонентов. Помимо передачи нервного импульса, он участвует в транспорте ионов, поддержании собственной структуры, питании того нервного волокна, которое он окружает, а также выполняет по отношению к нему структурообразующую и защитную функции [37, 74].
При исследовании синтеза миелина обычно измеряют активность вовлеченных ферментов (в условиях in vitro), а также отслеживают метаболизм меченых предшественников его компонентов in vivo и в клеточных и тканевых культурах [16, 32, 37]. Процесс миелинизации имеет характерные черты, общие для всех видов животных и человека. Он начинается в ПНС, переходя далее на спинной мозг Головной мозг подвергается миелинизации в последнюю очередь [51]. При этом, как в ЦНС, так и на периферии, остается значительное количество немиелинизированных волокон
У человека миелинизация начинается во втором триместре беременности и продолжается на протяжении взрослой жизни Миелинизация ЦНС, особенно переднего мозга, происходит наиболее интенсивно после рождения Процесс миелинизации начинается с быстрой пролиферации глии и ее дифференцировки с выстраиванием вдоль аксонов [48, 49, 111]. Интенсивность молекулярно-биологических и биохимических процессов, сопряженных с интенсивностью процесса миелинизации, отмечаемой на морфологическом уровне, проявляется, в частности, в интенсивности биосинтеза ДНК в клетках, образующих миелин Так, на гестационных сроках около 20-30 недель отмечается своеобразный «взрыв» экспрессии ДНК в олигодендроглиоцитах В период между 40-й неделей гестации и шестью месяцами постнатальной жизни содержание общей ДНК в переднем мозге возрастает вдвое; далее, от шести месяцев до двух лет постнатальной жизни, уровень ДНК в миелин-образующих клетках ЦНС повышается еще на 50 %, после чего биосинтез ДНК в глиальных клетках происходит уже относительно равномерно
Характеристика изучаемого материала
Для приготовления экстракта использовали спинной мозг крупного рогатого скота, забор которого проводился в течение первых 12 часов после забоя Подобное ограничение связано с тем, что по истечении данного промежутка времени активация аутолитических процессов в тканях и клетках приводит к значительной деградации их структур, что критически отражается на состоянии выделяемого нами антигена. Спинной мозг отделяли от твердой и сосудистой оболочек, после чего гомогенизировали на гомогенизаторе «ЕТА0010» (Германия) при 10000 об/мин в дистиллированной воде. Объемное соотношение ткани спинного мозга и дистиллированной воды составляло 1 : 2. Полученный гомогенат использовался в дальнейшей работе. Делипидизация Начальные этапы экстракции ОБМ были связаны с процедурой делипидизации, которая осуществлялась путем троекратного суспендирования гомогената в хлороформ -зтанольной смеси (2 1) Каждый раз проводилось центрифугирование суспензии (5000 g в течение 20 минут) и сбор осадка, содержащего белковую фракцию. Осадок, собранный в результате последнего центрифугирования, суспендировали в ацетоне, охлажденном до -ь4С, а затем центрифугировали (5000 g, в течение 20 минут) с целью отделения белкового осадка от фракции липидов, содержащейся в супернатанте. Полученный осадок тщательно отмывали путем трех кратного ресуспендирования в 20 объемах дистиллированной воды с последующей фильтрацией через бумажный фильтр. Кислотная экстракция На следующем этапе работы проводили кислотную экстракцию ОБМ из делипиди-рованной белковой фракции, полученной на предыдущей стадии. Для этого отфильтрованный осадок суспендировали в дистиллированной воде (объемное соотношение осадок : дистиллированная вода -1:5). При постоянном перемешивании суспензии на магнитной мешалке по каплям добавляли IN HCL до рН 3,0. Суспензию инкубировали на мешалке в течение 60 минут Отделяли осадок центрифугированием при 6000 g в течение 40 минут. Собирали надосадочную фракцию, которую использовали в дальнейшей работе. Ионообменная хроматография
Ионообменная хроматография применялась нами как первый этап очистки белка. В качестве ионообменного носителя мы использовали катионообменник - СМ-52 целлюлозу («Whatman», England) Нами проводилась хроматография по Baumstark, предусматривающая выполнение процедуры в «объеме» Условия проведения работы подробно изложены в главе 3 Гидрофобная хроматография На следующем этапе очистки ОБМ применялась гидрофобная хроматография, основанная на взаимодействии гидрофобных группировок сорбента и соответствующего домена белка [199] В своей работе мы использовали фенил-сефарозу («Pharmacia Biotech», Sweden) Процедура выполнялась с помощью комплекта хроматографической аппаратуры фирмы «LKB», Sweden Условия проведения процедуры изложены в главе 3 Г ел ь-фил ьтрация Основные принципы метода были изложены J Porath и F Flodin в 1959 году [207]. Авторы впервые применили в своей работе сефадексы - гели, разработанные фирмой «Pharmacia Biotech» (Sweden) В своей работе мы применяли гель-фильтрацию как в препаративных, так и в аналитических целях. С помощью данного метода проводился окончательный этап очистки антигена, что дало возможность получения препарата высокой степени чистоты. На данном этапе работы нами также проводилось определение молекулярной массы выделенного ОБМ. В качестве носителя мы использовали Toyopearl HW-50 Fine («TSK», Japan). Калибровка колонки проводилась с помощью белковых стандартов фирмы «Sigma» (USA). Процедура выполнялась в колонке фирмы «LKB» (Sweden). Детекция ОБМ, элюированного с носителя проводилась иммунохимически. Условия проведения процедуры изложены в главе 3. Аффинном хроматография. Метод основан на избирательном взаимодействии белков, подлежащих фракционированию, со специфическими лигандами, иммобилизованными на носителе [8]. Иммуноаффинная хроматография нами проводилась для получения препаратов ан-ти-ОБМ-антител на следующих этапах - получения поликлональных анти-ОБМ-АТ из моноспецифических кроличьих АС; получения моноклональных анти-ОБМ-АТ из асцитической жидкости мышей. получения поликлональных анти-ОБМ-АТ из сыворотки больных рассеянным склерозом, забор которой проводился в стадии обострения. В качестве матрицы применяли активированную бромцианом сефарозу - CNBr-сефарозу 4В («Pharmacia Biotech», Sweden) ОБМ, выделенный согласно приведенному выше протоколу, «сшивали» с носителем по общеизвестной методике Weir D. [280], в модификации Чехонина В.П. [13], подробное изложение процедуры имобилизации приводится в главе 4. Работа, связанная с проведением аффинной хроматографии выполнялась нами с использованием комплекта хроматографической аппаратуры фирмы «LKB», Sweden. Условия ее проведения изложены в главе 4 Диск-электрофорез в полиакрилалшдном геле (ПААГ). Диск - электрофоретический анализ был разработана и детально описана Ornstem L. [201] и Davis В. J. [75]. В своей работе мы применяли аналитический вариант диск-электрофореза в 7,5 % ПААГ Данная методика использовалась нами для оценки степени чистоты препарата ОБМ, получаемого на различных этапах фракционирования. Для определения соответствующих белковых зон столбики геля извлекали из трубочек, фиксировали в течение 30 минут в 12,5 % трихлоруксусной кислоте, а затем окрашивали в 0,2 % растворе Кумасси R-250 в течение 12 часов Отмывку от избытка краски и хранение, полученных образцов проводили в 7 % уксусной кислоте. Для иммунохимической верификации белковые зоны иммунопроявляли. С этой целью столбики геля разрезали в поперечном направлении, получая фрагменты шириной 2 мм каждый. Элюцию белка осуществляли 100 мкл 0,5 М веронал-мединалового буфера, рН 8,6 при 8 С, в течение 24 часов. Иммунохимическая оценка выделенных фракций проводилась с помощью слитного иммуноэлектрофореза с анти-ОБМ-антителами. Диск - электрофорез в ПЛАТ с додецилсульфатом натрия (SDS). Метод был предложен и внедрен в лабораторную практику Shapiro А. и соавт. [235]. Достоинство метода заключается в возможности определения молекулярных масс белков путем электрофореза в ПААГ после их обработки SDS или (З-меркаптоэтанолом. По сравнению с гель-фильтрацией, метод имеет несомненное преимущество, состоящее в высокой точности оценки, особенно для молекул в диапазоне молекулярных масс от 103 до 10s Да. Метод является незаменимым при исследовании субъединичного состава белковых молекул.
Выделение ОБМ
Существование в настояи ий момент значительного количества способов выделения ОБМ из ткани головного и спинного мозга человека и животных обосновано необходимостью получения препарата, отвечающего различным требованиям, касающимся степени его чистоты, сохранности антигенных детерминант, иммуногенности и энцефалитогенно-сти [66, 71, 77, 81, 11, 197, 219] Известные способы получения рекомбинантных препаратов белка, а также определенных его фрагментов, обладающих необходимыми для исследователей свойствами [182], несомненно, являются наиболее совершенными с точки зрения качества препарата, применяемого в аналитических и прикладных аспектах Однако, являясь крайне дорогостоящими, они имеют весьма ограниченное применение В связи с этим, перед нами стояла задача выбора наиболее адекватного способа выделения ОБМ, который бы обеспечил максимальную степень очистки получаемого препарата при оптимизации его потерь и сохранении нативных свойств белка Особое требование, касающееся степени чистоты выделяемого препарата, было продиктовано целью нашей работы, заключающейся в разработке иммуноферментного метода анализа ОБМ в биологических жидкостях человека на основе моноклональных антител
Наиболее приемлемой, максимально отвечающей вышеуказанным требованиям, с нашей точки зрения, явился способ получения ОБМ, предложенный Deibler G.E. и соавт в 1972 году [81] В процессе очистки препарата ОБМ нами была проведена модификация способа [15], позволившая в наибольшей, на наш взгляд, степени обеспечить достижение поставленных перед нами задач
Для получения препарата ОБМ был использована ткань спинного мозга крупного рогатого скота, взятого не позднее 12 часов после забоя Ткань спинного мозга тщательно очищали от сосудистых оболочек, а затем гомогенизировали на гомогенизаторе ЕТА-0010 с дистилированной водой в объмном соотношении I I Схема получения ОБМ, применявшаяся нами представлена на рисунке 5 Переходя к подробному описанию способа выделения ОБМ, необходимо отметить, что все процедуры выполнялись нами в условиях постоянной температуры +4С, поддержание которой обеспечивалось термостатируемым шкафом Coollab («Pharmacia», Sweden Нами использовалась «жесткая» схема очистки ОБМ, подразумевающая тщательную делипидизацию исходного материала с целью получения препарата белка высокой степени чистоты. Подобное требование было продиктовано необходимостью создания тест - системы на основе моноклональных антител для детекции ОБМ в биологических жидко стях, которая бы обладала высокой специфичностью Для чего исходный гомогенат ткани спинного мозга суспендировали в 10 объемах хлороформ - этанольной смеси в течение 30 минут, при соотношении компонентов 2 1 соответственно. Полученную суспензию подвергали центрифугированию при 5000 g в течение 20 минут Собирали осадок, который повторно суспендировали, а затем центрифугировали при тех же условиях. Процедуру повторяли троекратно
Полученный в результате последнего центрифугирования осадок, собирали и суспендировали в течение 30 минут в 10 объемах охлажденного ацетона. После чего проводили центрифугирование при 5000 g в течение 20 минут Осадок собирали и проводили его отмывку путем суспендирования в 20 объемах дистиллированной воды с последующей вакуумной фильтрацией через бумажный фильтр Whatman УЬ 54 Кислотная экстракция
Полученный в результате отмывки осадок суспендировали в 5 объемах дистиллированной воды, после чего доводили рН суспензии до 3,0 путем капельного добавления 1 N НС1 при постоянном помешивании на магнитной мешалке С целью получения гомогенной суспензии выдерживали ее на магнитной мешалке в течение 60 минут Последующее центрифугирование проводили при 6000 g в течение 40 минут Супернатант собирали и использовали для дальнейшей работы Ионообменная хроматография
Ионообменную хроматографию проводили с использованием катионообменной целлюлозы СМ - 52 (Whatman. England) Нами применялся вариант хроматографии в "объеме" без формирования столба носителя в колонке, предложенный ранее Baumstark Носитель уравновешивали рабочим буфером, содержащим 2 М мочевины, 0,02 М NaCl, 0,02 М sodium glycinate, рН 11,2 Непосредственно перед проведением хроматографии элюат, полученный на предыдущей стадии выделения препарата, шщелачивали путем добавления 8 М мочевины в объеме 25 % элюата, после чего проводили его смешивание с носителем Количество используемого носителя соответствовало исходному объему взятого в работу гомогената ткани спинного мозга Смесь инкубировалась на роторной мешалке в течение 15 минут, в процессе чего происходило связывание молекул ОБМ с катионами ионообменника По истечении процесса инкубации, с целью элюции неосновных белков, доводили рН смеси до 11,6 путем медленного капельного добавления 1 N NaOH Вакуумную фильтрацию с использованием бумажного фильтра Whatman Уі 5V, проводили после выдерживания смеси в течение 5 минут на роторной мешалке Полученный в результате фильтрации осадок, ресуспендировали в двух объемах рабочего буфера, после чего фильтровали Процедуру повторяли дважды На следующем этапе проводили отмывку сорбента от мочевины путем суспендиро-вания его в четырех объемах дистиллированной воды с последующей фильтрацией. Отмытый от мочевины сорбент суспендировали в двух объемах дистиллированной воды, после чего доводили рН смеси до 2,5 путем капельного добавления 1 N НС1. Инкубировали смесь на роторной мешалке в течение 5 минут, затем фильтровали. Данная процедура способствует удалению с носителя основных примесных белков, а также продуктов распада ОБМ, которые могут образовываться при условии позднего (более 12 часов после забоя) забора исходного материала Незначительное количество ОБМ также способно подвергаться элюции с носителя на этом этапе Полученный в результате фильтрации осадок, суспендировали в трех объемах 0,1 N НС1, после чего инкубировали на роторной мешалке в течение 10 минут и подвергали повторной фильтрации, отбирая фильтрат Следует отметить, что последовательное проведение двух последних стадий очистки позволяет в значительной степени повысить чистоту препарата, однако потери ОМБ при этом также возрастают на 10-12 % Согласно использованному нами протоколу выделения препарата ОБМ из ткани спинного мозга крупного рогатого скота [81 ], данная схема очистки является адекватной для последующего использования его в иммунологических исследованиях Степень чистоты препарата, полученного в результате проведенных процедур, составила около 80%, что было показано при электрофоретическом исследовании в ПААГ В то эе время следует отметить, что степень чистоты полученного препарата не соответствовала требованиям, предъявляемым нами к препарату, используемому для разработки иммуноферментного анализа В связи с этим нами были проведены дополнительные этапы очистки - гидрофобная хроматография и гель-фильтрация Гидрофобная хроматография на фепи.і-сефароіе
Получение гибридом продуцирующих моноклональные анти-ОБМ- антитела
Полученный нами препарат ОБМ был использован в цикле иммунизации мышей линии Balb/C, схема которой детально описана в главе 2 При обнаружении адекватного титра специфических анти-ОБМ-АТ в АС иммунизированных мышей, проводился забой животных и забор селезенки с целью проведения процедуры слияния
Слияние В-лимфоцитов с предварительно подготовленными плазмоцитомными клетками, наращивание которых проводили в жидкой культуральной среде, проводили в соответствии с методом, разработанной Kohler (Ї. и Milstem С [141] в некоторой нашей модификации [15]. Детальное описание использованного нами метода приведено выше Отбор клеток, обладающих свойствами как плазмоцитомных, так и лимфоидных предшественников, проводился посредством культивирования гибридом на селективных средах
Наращивание клонов гибридных клеток проводилось на полистирольных культу-ральных планшетах фирмы «Costar» (USA) Тестирование супернатантов из лунок проводили в случаях, когда клон состоял не менее чем из 150-200 клеток Отбор секретирующих клонов проводился с помощью иммуноферментного метода В качестве посадочного АГ использовали полученный нами препарат ОБМ в концентрации 10 мкг/мл В качестве вторых AT использовали коммерческий препарат конъюгата AT барана к иммуноглобулинам мыши, меченный пероксидазой хрена («Sigma». USA) Нами проводилось троекратное тестирование Отбирали клоны гибридных клеток, дававшие нарастание титра секреции специфических анти-ОБМ-АТ в динамике В дальнейшем секретирующие клоны рассеивали в лунки планшетов для культивирования с таким расчетом, чтобы добиться нахождения в каждой из них только одной гибридной клетки
Культивирование гибридом проводили под постоянным контролем их секретирую-щей способности методом иммуноферментного метода Для наращивания отбирали клоны, являющиеся потомками одной гибридной летки и обладающие наиболее устойчивой секрецией анти-ОБМ-антител Полученные гибридомы в количестве 10 клеток вводили интраперитонеально самкам мышей линии Balb/C, в возрасте 8 недель Необходимо отметить, что за 3 недели до этого животным интраперитонеально вводили 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраме-тилпентадекан, «Sigma», USA) с целью подавления у них местного иммунного ответа. Остальные гибридные клетки замораживали по аликвотам 5 х 106 кл/мл и хранили в жидком азоте Через 2 недели после интраперитонеального введения гибридных клеток, проводили забор асцитической жидкости у животных, представляющий серозный или серозно-геморрагический выпот Объем полученной асцитической жидкости от одного животного в среднем составлял 10 - 15 мл После сбора асцитическую жидкость центрифугировали в течение 10 минут при 3000g, для отделения от клеток и фибрина Супернатант использовали в дальнейшем в процедуре иммуноаффинной хроматографии на CNBr-сефарозе для выделения моноклональных анти-ОБМ-антител
Приготовление иммуноадсорбента проводили по стандартной методике [13], согласно которой 10 г CNBr-сефарозы 4В («Pharmacia Fine Chemicals») замачивали в 500 мл 0,001М раствора НС1 в течение 20 минут при комнатной температуре, затем отмывали 2 л того же раствора на стеклянном фильтре После этого к активированному таким образом носителю, добавляли препарат ОБМ, предварительно отдиализованный против 0,1М Na-карбонатного буфера, содержащего 0,5М NaCl, рН 8,3 из расчета 5-Ю мг белка на 1мл геля (при этом учитывали, что 1 г сухого порошка носителя при набухании дает 3,5 мл геля) Полученную смесь инкубировали в течение 2 часов на роторной мешалке После чего синтезированный иммуноадсорбент отмывали от избытка белка 4 л 0,1М Na-карбонатного буфера, содержащего 0,5М NaCl, рН 8, Оставшиеся активными имидокарбонатные группы носителя блокировали путем 2 часовой инкубации иммуноадсорбента с 1М раствором глицина Избыток которого отмывали попеременно 0.1М Na- карбонатного буфера, содержащего 0,5М NaCl, рН 8,3 и 0, IM Na- ацетатным буфером, содержащим 0,5М NaCl, рН 4,0 Выделение моноклональных апти-ОБМ-АТ и асцитической .жидкости методом иммуноаффинной хроматографии.
Приготовленный таким образом иммуноадсорбент вносили в колонку 1,5 х 25,0 (LKB, Sweden) Носитель уравновешивали рабочим буфером Процедура проводилась при +4 С Через колонку пропускали 50,0 мл асцита, содержащего моноклональные AT к ОБМ со скоростью 4 мл/час Проток поддерживался перистальтическим насосом «Microperpex S» (LKB, Sweden) Рециркуляцию асцитической жидкости через имуноад-сорбционную колонку проводили в течение 12 часов После нанесения препарата специфических антител на носитель последний отмывали от несвязавшихся белков рабочим буфером со скоростью протока 20 мл/час до достижения оптической плотности раствора на выходе из колонки не более 0,02 Величину оптической плотности контролировали с по мощью проточного спектрофотометра «Uvicord Ш» (LKB, Sweden) при длине волны 280 нм.
Графическое изображение элюцнцнонного профиля моноклоиальных анти-ОБМ-АТ при иммуноаффинной хроматографии. После выхода каждой фракции немедленно проводили ее защелачивание сухим ТРИС до рН 7.0. Наличие моноклоиальных антител во фракциях дополнительно верифицировали иммунохимически путем иммунодиффузионного анализа образцов с коммерческим препаратом антител к иммуноглобулинам мыши («Dako», USA).
Собранные фракции, содержащие моноклональные анти-ОБМ-АТ диализовали против дистиллированной воды в течение 2 часов при комнатной температуре. После чего концентрировали методом ультрафильтрации на мембране ХМ-100A («Amicon», USA) до 2 мл. Отдиализованный препарат лиофилизировали и использовали в дальнейшем для разработки иммуноферментного анализа.
Иммунодиффузионный анализ препарата анти-ОБМ-антител, выделенных их асци-тической жидкости мышей с коммерческими препаратами антител к иммуноглобулинам мыши различных классов и подклассов («Dako», USA), позволил отнести полученный нами препарат анти-ОБМ антител к иммуноглобулинам класса G1. Молекулярная масса полученных антител определялась методами гель-фильтрации и диск-электрофореза в ПААГ с SDS с последующей иммунохимической верификацией. Молекулярная масса моноклоиальных анти-ОБМ-антител равнялась 160 ± 7,8 кДа.
