Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1. Изготовление микрочипов 8
1.2 Иммобилизация белков 10
1.2.1 Адсорбционная иммобилизация 11
1.2.2 Химическая (ковалентная) иммобилизация белков 13
1.2.2.1 Иммобилизация по аминогруппам белка 14
1.2.2.2 Иммобилизация по сульфгидрильным группам белка 15
1.2.2.3 Иммобилизация через декстрановые спейсеры 16
1.2.3 Иммобилизация за счет комплексообразования 17
1.2.4 Иммобилизация в пористых средах 18
1.2.5 Иммобилизация белков на трехмерных гидрофильных носителях 19
1.2.6 Иммобилизация на полимерных носителях 19
1.2.7 Иммобилизация в полиакриламидном геле 20
1.3 Применение микрочипов 22
1.3.1 Аналитические микрочипы 25
1.3.2 Функциональные микрочипы 29
1.3.2.1 Белок-белковые взаимодействия 29
1.3.2.2 Белок-липидные взаимодействия 31
1.3.2.3 Белок-ДНК - взаимодействия 31
1.4 Модельные белки 33
1.4.1 Барназа 33
1.4.2 Раково-эмбриональный антиген (РЭА) 35
1.5 Методы ускорения анализа на микрочипах 38
ГЛАВА 2 Экспериментальная часть 44
2.1 Приборы и реактивы 44
2.2 Изготовление белковых микрочипов 45
2.3 Окрашивание белков флуоресцентными красителями 46
2.4 Флуоресцентные измерения на чипах 46
2.5 Введение метакрильных групп в белок 47
2.6 Оценка эффективности иммобилизации барназы на микрочипе. 48
2.7 Оценка сохранения биологической активности модифицированной барназы на примере взаимодействия с барстаром 48
2.8 Модификация белка мономерами геля 49
2.9 Исследование ферментативной активности иммобилизованной
на микрочипе барназы методом MALDI-TOF MS 49
2.10 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах 50
2.11 Определение содержания рекомбинантного барстара в лизатах клеткок 51
2.12 Сэндвич-иммуноанализ РЭА 51
2.13 Кинетические измерения на микрочипах 52
ГЛАВА 2 Результаты и их обсуждение 54
3.1 Белковые микрочипы 54
3.2 Изготовление гелевых микрочипов 55
3.3 Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа 56
3.4 Введение в молекулу барназы непредельных групп 57
3.5 Оценка эффективности иммобилизации 58
3.6 Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности 60
3.7 Метод полимеризационной иммобилизации 62
3.8 Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы 67
3.9 Количественный флуориметрический анализ барстара на 69 микрочипах
3.10 Определение содержания рекомбинатного барстара в л изатах клеток 72
3.11 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах 73
3.12 Разработка процедуры сэндвич-иммуноанализа на белковых микрочипах (на примере РЭА) 74
3.13 Подбор условий проведения иммуноанализа 78
3.14 Одностадийный сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах... 79
3.15 Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови 80
3.16 Ускорение иммуноанализа на микрочипе с помощью механического перемешивания образца 82
3.17 Зависимость интенсивности сигнала и времени выхода на насыщение кинетической кривой от скорости перемешивания на перистальтическом насосе 84
3.18 Получение калибровочных кривых при проведении анализа с механическим перемешиванием образца 87
Выводы 89
Благодарности 90
Список литературы
- Химическая (ковалентная) иммобилизация белков
- Белок-белковые взаимодействия
- Флуоресцентные измерения на чипах
- Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности
Введение к работе
В настоящее время белковые микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Для закрепления белков на матрице (микрочипе) используются различные носители, такие как стекло, пластик, мембраны, золото, и др. Для иммобилизации белковых молекул на носителях применяют различные способы: белки могут быть адсорбированы на носителе (физическая иммобилизация) или ковалентно связаны с носителем (химическая иммобилизация). В большинстве случаев, основной проблемой при создании белковых микрочипов является тот факт, что для сохранения структуры и биологических функций молекулы белков нуждаются в гидрофильном окружении, максимально приближенном к естественным условиям их функционирования. Поэтому, несмотря на большое количество разработанных способов иммобилизации и предлагаемых для изготовления микрочипов носителей, это ограничение создает большие сложности для создания устойчиво работающих и долго хранящихся двумерных белковых микрочипов.
Трехмерные гидрогелевые микрочипы, разрабатываемые в Институте молекулярной биологии РАН, обладают существенными преимуществами по сравнению с микрочипами на основе двумерных поверхностей, в особенности для иммобилизации белков. Использование трехмерного геля в качестве носителя при иммобилизации позволяет увеличить количество
иммобилизуемого зонда и достичь его равномерного распределения в объеме ячеек. Известно также, что иммобилизация белков в гидрогеле способствует их стабилизации, это справедливо и в отношении гидрогелевых микрочипов. В данной работе предложен новый метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий значительно упростить технологическую процедуру изготовления микрочипов. В результате проведенных исследований показано, что микрочипы, полученные с помощью предлагаемого метода, обеспечивают оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков и сохранение ими исходной биологической активности. Белковые микрочипы, изготовленные методом полимеризационной иммобилизации, позволяют проводить многопараметрический анализ образца и могут найти применение как в клинической практике, так и в области научных исследований.
Химическая (ковалентная) иммобилизация белков
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации белков является то, что путем химического воздействия на поверхность носителя или непосредственно на структуру белка, вводятся дополнительные реакционноспособные группы, с помощью которых затем образуются ковалентные связи между белком и носителем. Основное преимущество данного метода - высокая прочность связи белка с носителем, а также возможность введения спейсера, обеспечивающего необходимую дистанцию между поверхностью носителя и молекулой белка. При изготовлении микрочипов, как правило, используют химическую иммобилизацию молекулярных зондов, в том числе белков. Химическую иммобилизацию белковых молекул проводят чаще всего по свободным аминогруппам, реже - по альдегидным или по сульфгидрильным группам, находящимся на поверхности белковой глобулы. В зависимости от структуры белка и аминокислотного состава его активного центра, а именно, от присутствия остатков лизина или цистеина в активном центре, выбирают тот или иной способ химической иммобилизации.
Иммобилизация по аминогруппам белка
Первичные а- и е-аминогруппы белков могут быть трансформированы во вторичные в реакциях алкилирования, арилирования, а также путем восстановления азометиновых связей (оснований Шиффа). В этих случаях между иммобилизованным белком и носителем образуются прочные негидролизуемые азот-углеродные связи, причем получаемая вторичная аминогруппа легко протонируется и несет на себе положительный заряд так же, как исходная аминогруппа.
Большинство подложек, используемых для изготовления микрочипов, содержат гидроксильные группы: стекло, кремний, окисленные поверхности металлов. Такие материалы обрабатывают бифункциональными агентами -производными силана, способными взаимодействовать с гидроксильными группами: у-аминопропил-триэтоксисиланом [21, 22], у-эпоксисиланом [23], тетраэтоксисиланом [24] с последующей активацией либо карбодиимидами или изотиоцианатами [25], либо введением альдегидных групп [26] с помощью глутарового альдегида [27]. В результате на поверхности подложки образуются активные группы, способные к взаимодействию с аминогруппами белка.
Присоединение белковой молекулы к альдегидной группе происходит за счет образования довольно лабильного основания Шиффа. После восстановления двойной связи (например, борогидридом натрия) достигается прочная иммобилизация, не лишающая, однако, белковую молекулу конформационной подвижности. Некоторые фирмы-производители выпускают пред-активированные глутаровым альдегидом стекла, т.н. альдегидные стекла.
Этот метод иммобилизации белков является наиболее часто используемым. К недостаткам следует отнести частичную денатурацию белковой молекулы, которая приводит к нарушению нативности белка, находящейся близко к твердой поверхности, конформационные затруднения, которые легко устраняются при введении спейсера. Для иммобилизации белковых молекул через сульфгидрильные группы используют подложку, состоящую из слоя золота на стекле или другом материале. Преимущество данного метода связано с химической стабильностью золотого покрытия и простотой его получения.
Иммобилизации на нем белковых молекул происходит за счет образования связей Au-S, природа которых до конца не изучена [28]. Цистеин содержащие белки могут связываться с золотой поверхностью без предварительной активации. Близость поверхности часто отрицательно сказывается на сохранении белками своей биологической активности, поэтому многие исследователи иммобилизуют белки через спейсеры, содержащие с одной стороны сульфгидрильную группу, а на другом конце желаемую активную группу [29], для последующего взаимодействия с белком. Если иммобилизуемый белок содержит в активном центре сульфгидрильную группу, то он может потерять активность из-за ее включения в химическую связь, обеспечивающую иммобилизацию.
Белок-белковые взаимодействия
Zhu et al. [85] продемонстрировали возможность применения белковых микрочипов в протеомных исследованиях. После выделения и очистки 5800 различных индивидуальных рекомбинантных белков из дрожжей S.cerevisiae, авторы создали чип, содержащий более 90% белков организма. Используя биотинилированный кальмодулин в качестве модели для анализа на микрочипах, они не только подтвердили уже известные взаимодействия, но и обнаружили ряд новых кальмодулин-связывающих белков.
Zhu et al. [86] создали микрочип, содержащий белки всех короновирусов человека, а так же белки короновирусов, потенциально инфекционно опасных для человека. После инкубации микрочипа с сыворотками человека и его проявления с помощыо меченых антител против IgG и IgM человека, получили профиль иммунного ответа, позволяющий быстро и точно определить стадию иммунного ответа при острой респираторной инфекции. С помощыо таких микрочипов удалось различить недавно инфицированных больных и больных, обладающих устойчивым иммунитетом к возбудителю инфекции.
Важным типом белковых микрочипов для исследования белок-белковых взаимодействий в протеомике являются микрочипы, полученные с помощью библиотек кДНК. Для изготовления микрочипов на основе библиотек кДНК используют следующую методику. Сначала конструируют библиотеку клонов, а затем с помощью робота каждый клон наносят на мембрану в виде отдельной точки. После роста клеток и экспрессии белка, клетки разрушаются, а экспрессированные белки сорбируются на мембрану. Таким образом, каждый элемент получившегося микрочипа содержит клетки с индивидуальным рекомбинантным белком. После роста клеток и активации экспрессии белков, клетки лизируют, и рекомбинантные белки иммобилизуются на мембране. Подобным образом можно иммобилизовать тысячи рекомбинантных белков без их выделения и индивидуального нанесения на мембрану. Такой микрочип позволяет быстро и легко просматривать и характеризовать множество функционально различных белков [87].
Salamat-Miller et al. [88] сделали первый шаг в понимании белок-полианионных взаимодействий. Известно, что полианионы включены во внутри- и внеклеточный транспорт, а так же в стабилизацию белковых структур, стимулируя фолдинг белков (сворачивание вновь синтезированных белков в процессе формирования третичной структуры), подобно шаперонам (специальным белкам, катализирующим сборку и укладку полипептидов для достижения стабильной нативной структуры). Для того чтобы обнаружить белки, связывающиеся с полианионами, авторы использовали микрочип, содержащий почти все белки дрожжей. Используя биотинилированные полианионы (актин, тубулин, гепарин, гепаран и др.), они обнаружили белки, взаимодействующие с полианионами.
Известно, что некоторые фосфолипиды являются вторичными сигнальными молекулами клеточного ответа. Для исследования известных и обнаружения новых белок-липидных взаимодействий авторы [85] использовали микрочип, содержащий 90% белков из дрожжей. Для взаимодействия с белковым микрочипом были использованы различные биотинилированные везикулы, содержащие более 150 интересующих фосфолипидов. В экспериментах были подтверждены уже известные факты и обнаружено много новых фосфолипидов, связывающихся с белками.
Белок-ДНК - взаимодействия чрезвычайно важны для понимания таких внутри-клеточных процессов, как транскрипция и репликация. Для изучения белок-ДНК - взаимодействий Kersten et al. использовали технологию белковых микрочипов с MALDI TOF масс-спектральной детекцией [89]. В качестве модели авторы использовали взаимодействие бактериальных инициаторов репликации ДНК с родственной связывающей областью ДНК. На микрочипах были охарактеризованы процессы связывания специфической области ДНК А4 с высокоспецифическим ДНК-связывающим белковым сайтом R4 и с низкоспецифическим ДНК-связывающим белковым сайтом R3. Так же на микрочипах провели исследование взаимодействия мутантнои области ДНК А4 - A440V. В нативной ДНК был обнаружен фрагмент, состоящий из 6 аминокислотных остатков, отвечающий за связывание ДНК, который отсутствовал в мутантнои ДНК.
Считается, что экспрессия в эукариотах контролируется регуляторами транскрипции, которые активируют гены, кодирующие структурные белки и ферменты. Hall et al. [90] использовали белковый микрочип, содержащий более 90% белков дрожжей, для изучения новых ДНК-связывающих белков. На микрочип наносились пробы, содержащие ДНК, и было обнаружено, что фермент Arg 5,6, включенный в цепочку синтеза аргинина, взаимодействует со специфическими областями ядерной и митохондриальной ДНК. Удаление Arg 5,6 вызывает снижение уровня транскрипции выбранных генов - как ядерных, так и митохондриальных ДНК. Таким образом, было показано, что ферменты метаболизма могут напрямую регулировать экспрессию генов эукариот.
Флуоресцентные измерения на чипах
Введение в белок флуоресцентной метки осуществляли по аминогруппам белков. Для этого к 10 мкл раствора N-гидрокси-сукцинимидного эфира флуоресцентного красителя в диметилсульфоксиде добавляли 100 мкл раствора белка (5мг/мл) в 0,01М бикарбонатном буфере (рН 9,5), соотношение белок: краситель = 1:5, реакцию проводили 1 ч при температуре 20С и перемешивании. Белок с флуоресцентной меткой очищали от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией на Micro Bio-Spin колонке, заполненной сефадексом G-25 и уравновешенной PBS буфером. Количество молекул красителя, введенных в молекулу белка, определяли спектрофотометрически по поглощению при длине волны 650 нм для Су5, 595 нм для Texas Red и 280 нм для белка. Методика окрашивания подобрана таким образом, чтобы молярное соотношение белок: флуоресцентный краситель составляло 1:1.
Количественные измерения флуоресценции проводили на анализаторе биочипов (ИМБ РАН), снабженном охлаждаемой CCD-камерой, термостатированным столиком и компьютером с программным обеспечением для регистрации флуоресцентного сигнала с каждого гелевого элемента в реальном времени и обсчета данных.
Измерения на красителе Су5 и Texas Red проводили на фильтре с длинами волн 650/670нм и 580/630 возбуждение/эмиссия соответственно. В качестве источника света использовали ксеноновую лампу. Флуоресцентный сигнал от каждого гелевого элемента обрабатывался с использованием программы ImaGel (ИМБ, Москва).
Вычисление интенсивности флуоресценции с гелевого элемента микрочипа производили следующим образом: изображение каждой ячейки окружалось концентрической окружностью. Флуоресцентный сигнал определялся согласно формуле м-Нг- (2Л) "r.g. Dd.c. где С - флуоресцентный сигнал, рассчитанный для участка изображения внутри концентрической окружности. Для того чтобы учесть пространственную неоднородность интенсивности источника излучения, микрочип заменяли красным стеклом с такими же геометрическими размерами. Получали фоновый сигнал от участков, соответствующих участкам изображения внутри концентрических окружностей (Brg). Для учета шумов микроскопа, корректировали фоновый сигнал шумовым сигналом Bdc.
Раствор белка (100 мкл, 20 мкМ) в 0.01 М боратном буфере, рН 9.3 смешивали с 20 мкл 0.1-20 мМ раствора N-гидроксисукцинимидного эфира 6-метакриламиногексановой кислоты в диметилформамиде. Реакцию проводили при перемешивании от 0,5 до 2 часов, при температуре 24С. Молярное отношение белка к модификатору в различных экспериментах составляло от 1/1 до 1/10. Модифицированные белки очищали на сефадексе G-25. Количество введенных метакрильных групп оценивали с помощью MALDI TOF MS.
Количественный способ оценки степени иммобилизации барназы включает введение в белок флуоресцентной метки. Изготавливали микрочипы с иммобилизованной барназой, модифицированной различным количеством метакрильных групп и содержащей флуоресцентную метку Texas Red. После полимеризации с микрочипа до его отмывки снимали флуоресцентный сигнал, соответствующий полному количеству белка, находящегося в ячейке микрочипа, принимая его за 100% (So) , а затем начинали отмывать микрочип буфером PBST до тех пор, пока сигнал, получаемый с помощью флуоресцентного микроскопа, не перестанет изменяться. Конечный сигнал (Sk) в этом случае будет отвечать количеству белка, иммобилизованного на микрочипе. Сравнивая конечный сигнал с начальным определяли эффективность иммобилизации барназы на микрочипе по формуле: степень иммобилизации = S /So.
Микрочипы, в ячейках которых была иммобилизована барназа, содержащая различное количество непредельных групп, отмывали 20 мин в PBST. Наносили раствор конъюгата барстара с красителем Texas Red в PBS, в концентрации 1мкг/мл. Реакцию проводили 1 час при температуре 24С.
После взаимодействия отмывали микрочипы 20 мин в PBST. Результаты анализа регистрировали на флуоресцентном микроскопе.
Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности
В клинической практике и научных исследованиях количественное определение многих белков выполняется с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на использовании специфических к исследуемому белку антител. Для практических целей представлялось важным разработать процедуру проведения иммуноанализа на белковых микрочипах. Известно, что наиболее чувствительным из возможных типов иммуноанализа является сэндвич-иммуноанализ с использованием антител, специфичных к разным эпитопам белковой молекулы. В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда (образец) содержит антиген, и на первой стадии происходит образование специфического бинарного комплекса антиген иммобилизованное антитело. После завершения инкубации с антигеном и отмывки микрочипа от неспецифически связавшегося белка микрочип обрабатывают проявляющими флуоресцентно мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антигена. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше регистрируемый флуоресцентный сигнал. В результате получают график зависимости флуоресцентного сигнала с гелевых элементов, содержащих антитела, от концентрации антигена в растворе (калибровочную кривую), по которой далее определяют неизвестную концентрацию антигена в исследуемом образце.
В качестве объекта для разработки иммуноанализа на микрочипах был выбран широко используемый серологический онкомаркер - раковый эмбриональный антиген (РЭА).
Чтобы осуществить иммуноанализ на микрочипе, необходимо было выбрать пару специфических моноклональных антител к различным эпитопам РЭА, и определить, какие именно антитела должны быть иммобилизованы на микрочипе, а какие - выступать в качестве проявляющих. Для работы использовали пару моноклональных антител СЕА-1 и СЕА-10 (CanAg, Швеция), рекомендованную к использованию в стандартном варианте твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетах. Обычно для иммобилизации применяют антитела с большей константой ассоциации, а для проявления антитела с меньшей константой связывания.
Были изготовлены микрочипы, содержащие ячейки с иммобилизованными антителами СЕА-1, СЕА-10 в равных концентрациях, и ячейки, не содержащие иммобилизованных белков для контроля неспецифических взаимодействий. На микрочипе проводили кинетические измерения взаимодействия флуоресцентно меченого красителем Су5 антигена РЭА (концентрация 200 нг/мл) с иммобилизованными антителами. Как видно из кинетических кривых (рис. 14), образование бинарного комплекса РЭА-Су5 с иммобилизованными антителами СЕА-1 происходит значительно быстрее (интенсивность флуоресцентного сигнала прямо пропорциональна концентрации белкового комплекса), чем с иммобилизованными антителами СЕ А-10. время, ч Рис. 14. Кинетические кривые взаимодействия иммобилизованных антител с флуоресцентно-меченным антигеном: (1) иммобилизованы антитела СЕА-1; (2) иммобилизованы антитела СЕА-10. Поскольку концентрации иммобилизованных антител СЕА-1 и СЕА-10 одинаковы, то из формулы [АВ] = Kass[A][B], где концентрация комплекса пропорциональна флуоресцентному сигналу, видно, что антитела СЕА-1 обладают большей аффинностью к антигену, чем антитела СЕА-10. Поэтому в качестве антител для иммобилизации были выбраны СЕА-1, а в качестве проявляющих антител были выбраны СЕА-10.
Для подтверждения правильности выбора пары антител был проведен также сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах с иммобилизованными антителами СЕА-1 и СЕА-10 в равных концентрациях. В качестве проявляющих антител использовали СЕА-10-Су5 и СЕА-1-Су5 также в равных концентрациях. Полученные калибровочные кривые подтвердили правильность выбора пары антител для проведения сэндвич-иммуноанализа РЭА (рис. 15).
