Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Молекулярио-генетические онкомаркеры и методы их определепия 9
1. 2. Иммунохимичсскис опухолевые маркеры и методы их определения 13
1, 3. Простата - специфический антиген 18
1, 4. Белковые микрочипы 23
1.4.1 Двумерные белковые микрочипы для анализа онкомаркеров 28
1.4.2 Белковые микрочипы на основе гидрогелей 31
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 36
2.1. Белковые микрочипы , 36
2. 1.2. Регистрация сигналов с гелевых ячеек микрочипа 37
2.1.3. Подбор условий иммобилизации белков 38
2.1.4 Выбор состава геля на примере прямого анализа ПСА 44
2.1.5. Сравнение двумерных и трехмерных микрочииов 47
2.1.6. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными па микрочипе мопоклональпыми антителами 49
2.2. Белковый гидрогелевый микрочип для количественного анализа двух форм ПСА 52
2.2.1. Характеристики количественного иммупоанализа ПСА на биочипах 54
2.2.2. Внутренняя калибровочная кривая 57
2.2.3. Определение значений «эффективных» концентраций для внутренней калибровочной кривой 59
2.2.4. Получение результатов иммупоанализа 60
2.2.5. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови 63
2.2,6, Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА 64
ГЛАВА 3, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 66
3.1. Приборы и реактивы 66
3.2. Изготовление белковых микрочипов 67
3.3. Окрашивание белков флуоресцентным красителем Су5 68
3.4. Флуоресцентные и хсмилюминесцептные измерения 69
3.5. Определение степени иммобилизации белков в геле 70
3.6. Определение ферментативной активности белков в растворе 70
3.7. Регистрация ферментативной активности белков па микрочипе 71
3.8. Определение процента сохранения ферментативной активности пероксидазы после иммобилизации на чипе 72
3.9. Прямой анализ пероксидазы на микрочипе с иммобилизованными антителами 73
3.9.1 Сэндвич-иммупоанализ ПСА 74
3.9.2. Кинетические измерения на микрочипах 74
3.10. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моиоклопальными антителами 75
3.11. Твердофазный иммупоферментпый анализ (ELISA) на 96-луночном планшете 78
ВЫВОДЫ 81
БЛАГОДАРНОСТИ 82
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 83
Введение к работе
Злокачественные опухоли являются одними из самых распространенных заболеваний с летальным исходом. Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности от онкологических заболеваний у мужчин. Своевременное распознавание злокачественного процесса является ключевым этапом при лечении рака, поскольку именно этот фактор именно определяет прогноз заболевания и терапию. Поэтому разработка и внедрение в практику быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение.
Для диагностики злокачественных новообразований и контроля за лечением в настоящее время широко используются опухолеассоциированные антигены (онкомаркеры), определяемые в сыворотке крови с помощью специфических моноклональных антител. Их уровень в крови, как правило, коррелирует с размером опухоли или стадией заболевания.
Простатический специфический антиген (ПСА) относится к наиболее эффективным маркерам рака предстательной железы, получившим широкое внедрение в клиническую практику в целях диагностики и мониторинга РПЖ. Однако использование ПСА в ранней диагностике и скрининге РПЖ ограничено в связи с его низкой специфичностью, обусловленной повышением концентрации маркера у больных с незлокачественными заболеваниями ПЖ, а также у здоровых мужчин пожилого возраста. Остро стоящая перед клиницистами проблема дифференциальной диагностики РПЖ и доброкачественных заболеваний ПЖ требует повышения специфичности ПСЛ как опухолевого маркера. Использование для диагностики двух форм ПСА (общей и свободной) позволяет ближе подойти к решению этой проблемы: использование соотношения свободного и общего ПСА способствует значительному увеличению специфичности ПСА как опухолевого маркера в дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных заболеваний ПЖ.
Количественный анализ онкомаркеров проводится иммунохимическими методами (ИФА) в основном на плашках (стрипах). Традиционные иммунологические методы позволяют выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, в то время как для постановки точного диагноза требуется анализ на содержание в крови нескольких онкомаркеров.
Эта проблема решается при помощи метода, представленного в данной диссертационной работе, позволяющего одновременное количественное определение общей и свободной форм ПСА с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов.
Молекулярио-генетические онкомаркеры и методы их определепия
Злокачественная трансформация клеток вызывается нарушениями в генах, отвечающих за регуляцию их деления, дифференцировки и программированной гибели - апоптоза. Мутации генов - явление случайное, но селективный отбор мутантных клеток делает родоначальниками опухоли только те клетки, которые независимы от регуляторных сигналов организма. Для формирования злокачественности необходимо 6-14 генетических событий, хотя общее число мутаций в опухолевых клетках может составлять тысячи [1]. Как правило, вся опухолевая масса является потомками одной клетки, поэтому и мутации передаются всем клеткам-потомкам. Можно рассматривать специфические генетические дефекты как опухолевые маркеры и использовать это обстоятельство в диагностических целях [1,3,19]. Определение мутантных генов и их РНК-продуктов составляет основу молекулярно-генетической диагностики онкологических заболеваний.
Генетические нарушения, имеющиеся в опухолевых клетках, приводят к изменению синтеза белков, в том числе синтезу мутантных форм, нарушениям экспрессии - повышении или снижении синтеза того или иного белка, появлению белков, характерных для эмбрионального периода развития. Качественная и количественная оценка всех этих белковых молекул обычно проводится иммунохимическими методами, где они выступают в качестве антигенов. В классическом понимании онкомаркеры - это антигены, которые могут быть выявлены в опухолевой ткани, и циркулируют в кровотоке онкологических больных. Онкомаркеры, выявляемые иммунохимическими методами, более точно характеризуют нарушения функции того или иного гена.
Белковые микрочипы
В лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Эпгельгардта разрабатываются микрочипы на основе трехмерных гидрогелей.
Микрочип представляет собой подложку (пластик, стекло и др.), на которую нанесены полусферические гелевые элементы (ячейки). Каждый гслевый элемент микрочипа содержит иммобилизованный индивидуальный зонд.
Носителем для иммобилизации гидрогелей являются стеклянные пластинки, обработанные специальным агентом (Bind Silane) для создания непредельной метакрильнои группы на поверхности стекла. Далее на активированное таким образом стекло роботом с пиновой технологией нанесения наносится полимеризационная смесь в виде микрокапель, содержащая иммобилизуемые зонды и гелеобразующие мономеры. Ячейки находятся на гидрофобной поверхности подложки с определенным периодом; число ячеек на микрочипе и их размер определяются задачей и условиями предполагаемого эксперимента.
Ковалентная иммобилизация зондов происходит при облучении микрочипа ультрафиолетовым светом. Иммобилизация протекает одновременно с полимеризацией геля, т.е. происходит ковалентное связывание зонда с компонентами растущей полимерной цепи в ходе фотоиндуцирусмой полимеризации.
Для того чтобы участвовать в реакции фотоиндуцируемой полимеризации, биологические соединения должны содержать активные группы, способные вступать в реакции замещения или присоединения с бифункциональными гелеобразующими мономерами (кросс-линкерами). В качестве таких активных групп могут выступать амино- и сульфгидрильные группы. Биологические соединения, такие как белки, не нуждаются в дополнительной модификации, а олигонуклеотиды, ДНК и сахара перед проведением иммобилизации необходимо модифицировать введением в их структуру амино- либо сульфгидрильных групп. В качестве гелеобразующих соединений в нашей работе использовали производные метакриламида и Т ,1Ч-метиленбисакриламид.
Приборы и реактивы
В работе использовали щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена (RZ 3.0), моноклональные и поликлональные антитела к пероксидазе и человеческий IgG (Sigma, США), хемилюминесцентный субстрат для пероксидазы SuperSignal ELISA Pico Stable Peroxide and Luminol Enhancer Solutions (Pierce, США), флуоресцентный субстрат для щелочной фосфатазы ELF 97 (Invitrogen, США), Bind-Silane (Merck, Германия), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Calbiochem, США); Сефадекс G-25, флуоресцентный краситель Су5 (Amersham Biosciences, США), кислоты, щелочи, соли квалификации осч . Растворы готовили на деионизованной воде MiiliQ.
ПСА («Хема-Медика», Москва), моноклональные антитела PSA-30 против ПСАС„ PSA-36 против ПСАобщ и PSA-66 в качестве проявляющих антител (CanAg, Швеция); образцы сывороток крови были предоставлены лабораторией клинической иммунологии и урологическим отделением ГУ РОНЦ РАМН.
Очистку белков при необходимости проводили на хроматографических колонках Micro ВІо-Spin Laboratories (Bio-rad, Франция); в качестве подложки биочипов использовали стеклянные слайды Corning 2947 Micro Slides (Corning Glass Works, США). Прозрачные камеры объемами 25 и 100 мкл использовали для проведения анализа на микрочипах Eppendorf in situ frames (Eppendorf Scientific, Германия).
Химические реактивы, приобретенные из коммерческих источников, использовали без предварительной очистки.
Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре фирмы Jasco (США), колометрические измерения - на микропалншетном ридере Anthos 2020 (Австрия).
