Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 27
1.1. Белки BRCA1 и BRCA2 27
1.1.1. История открытия 27
1.1.2. Структурно-функциональная организация белка, кодируемого геном BRCA1 28
1.1.3. Структурно-функциональная организация белка, кодируемого геном BRCA2 37
1.2. Наследственные формы РМЖ, не связанные с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 42
1.2.1. Вклад мутаций в гене CHEK2 в формирование наследственных форм РМЖ 42
1.2.2. Наследственные формы РМЖ, не связанные с мутациями в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2 46
1.3. Методы анализа мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 52
1.4. Необходимость анализа мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 для ранней диагностики и выбора корректного лечения 59
1.5. Молекулярно-генетический анализ в онкологии с использованием массового параллельного секвенирования 66
1.6. «Молекулярные портреты» опухолей при РМЖ 70
1.7. Амплификация генов при РМЖ 76
1.8. Воздействие химиотерапевтических препаратов на опухоли с гиперэкспрессией HER2/neu 83
1.9. Новые препараты, используемые для лечения пациентов с HER2-позитивным РМЖ 89
1.9.1. Лапатиниб 89
1.9.2. Разработка новых препаратов, направленных на лечение HER2-позитивного РМЖ
1.10. Технологии анализа HER2 статуса опухоли 92
1.10.1. Метод иммуногистохимического анализа (IHC) 92
1.10.2. Метод флуоресцентной гибридизации (FISH) 95
1.10.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 97
ГЛАВА 2. Материалы 100
2.1. Образцы, используемые в исследовании 100
2.1.1. Популяционная выборка 100
2.1.2. Выборка пациентов с диагнозом «РМЖ» 100
2.1.3. Образцы опухолей 101
2.2. Реактивы 102
2.3. Плазмидные ДНК, штаммы E. сoli 104
ГЛАВА 3. Методы 105
3.1. Выделение геномной ДНК 105
3.2. Выделение ДНК из архивных и свежезамороженных образцов ткани опухоли РМЖ 105
3.3. Приготовление пулов ДНК 106
3.4. ПЦР в режиме реального времени 106
3.5. Определение концентрации растворов ДНК с помощью калибровочной прямой с использованием ПЦР в режиме реального времени... 107
3.6. Обработка результатов 108
3.7. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности 109
3.8. Аллель-специфичная ПЦР в режиме реального времени 110
3.9. Вставка чужеродных фрагментов ДНК в ген щелочной фосфатазы E. сoli между кодонами Gln253 и Lys254 112
3.10. Вставка чужеродных фрагментов ДНК в ген щелочной фосфатазы E. coli между кодонами Ala218 и Gly219 113
3.11. Конструирование плазмиды pPhoA-frame 115
3.12. Трансформация и анализ рекомбинантных плазмидных ДНК 116
3.13. Трансформация, выделение и анализ плазмидных ДНК 117
3.14. Амплификация фрагментов гена BRCA1 118
3.15. Клонирование амплифицированных фрагментов гена BRCA1 119
3.16. Определение бета-галактозидазной активности 119
3.17. Определение активности щелочной фосфатазы in situ 120
3.18. Статистическая обработка данных 120
Глава 4. Результаты и обсуждение 122
4.1. Разработка методов анализа мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 123
4.1.1. Разработка метода анализа целостности рамки трансляции с использованием клонирования исследуемого фрагмента в рамку с геном-репортером LacZ' 123
4.1.2. Анализ возможности встройки чужеродных полипептидов в молекулу щелочной фосфатазы E. coli 134
4.1.2.1. Встройка чужеродных пептидов после Ala218 щелочной фосфатазы 147
4.1.2.2. Оценка ферментативной активности модифицированных щелочных фосфатаз 150
4.1.3. Конструирование плазмиды pPhoA-frame 152
4.2. Разработка метода анализа мутаций с использованием пулированных образцов 162
4.3. Частоты встречаемости мутаций в популяции и среди больных РМЖ 170
4.4. Молекулярно-генетический анализ опухолевых клеток при РМЖ 177
4.4.1. Разработка метода анализа амплификации гена HER2/neu с использованием ПЦР в режиме реального времени 180
4.4.2. Сравнение результатов определения дозы гена HER2/neu предложенным протоколом TaqMan ПЦР в реальном времени с результатами ИГХ и FISH определения HER2-статуса опухолей РМЖ 185
4.4.3. Выявление вариантов HER2/neu-содержащих ампликонов в клетках опухолей при РМЖ методом ПЦР в реальном времени .188
4.4.4. Анализ флексибильности ДНК в районе MED1 – HER2/neu – TOP2A .191
4.4.5. Флексибильные последовательности в генах IKZF3 и RARA, способные формировать устойчивые вторичные структуры 193
4.4.6. Различный уровень амплификации вокруг сайтов высокой флексибильности FlexIKZF3-1082 и FlexIKZF3-225 и FlexRARA 195
4.4.7. Обсуждение результатов анализа амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген HER2/neu 197
Заключение 202
Выводы 206
Список литературы 209
- Структурно-функциональная организация белка, кодируемого геном BRCA1
- Выборка пациентов с диагнозом «РМЖ»
- Выделение ДНК из архивных и свежезамороженных образцов ткани опухоли РМЖ
- Встройка чужеродных пептидов после Ala218 щелочной фосфатазы
Структурно-функциональная организация белка, кодируемого геном BRCA1
Ген BRCA1 человека состоит из 24 экзонов, кодирует белок, состоящий из 1863 аминокислот. Гомология с соответствующими белками других млекопитающих достаточно слабая за исключением N- и C-концевых доменов белка. Более 60% белка BRCA1 кодируется экзоном 11, гомологичные экзону 11 гена BRCA1 обнаруживаются у позвоночных, но отсутствуют у низших эукариот [Boulton S.J., 2004].
N-концевая часть белка содержит достаточно консервативный RING (Really Interesting New Gene) домен, который был обнаружен у многих других белков прямо или опосредованно взаимодействующих с ДНК. 109 аминокислот RING домена BRCA1 содержат высококонсервативную (коровую) структуру из 50 аминокислот, включающих семь цистеиновых остатков и один гистидин, способных формировать структуру, которая координационными связями может удерживать два иона цинка [Brzovic P.S., 2001]. В отличие от многих других белков, содержащих RING – домены, BRCA1 не связывается непосредственно с ДНК, а формируют поверхность, которая обеспечивает формирование гетеродимера с белком BARD1 (BRCA1 – Associated Ring Domain) [Wu L.C., 1996].
BRCA1 взаимодействует со многими белками, детали взаимодействия часто до конца не изучены, однако взаимодействие BRCA1-BARD1 не вызывает сомнений, это взаимодействие неоднократно подтверждено исследованиями in vitro и in vivo. Оба белка колокализуются в клетке, белки действуют совместно при повреждениях ДНК [Scully R., 1997].
В ряде исследований было продемонстрировано, что клетки с дефектными генами BRCA1 и BARD1 имеют идентичный фенотип, более того, даже мыши с делетированными генами BRCA1 и BARD1 неразличимы фенотипически [Shen S.X., 1998; McCarthy E.E., 2003].
Структурные исследования комплекса BRCA1/BARD1 выявили, что белки взаимодействуют с вовлечением альфа-спиралей, ограничивающих RING домен белка BRCA1 (аминокислоты 24–64) [Meza J.E., 1999].
Миссенс мутации были найдены в пяти критических позициях, кодирующих аминокислоты, координирующие ионы цинка в RING домене, такие мутации, с одной стороны, уменьшают способность BRCA1 связываться с BARD1, а с другой стороны, эти же мутации связаны с формированием семейных форм рака [Jasin M., 2002].
В целом, множество исследований свидетельствуют, с одной стороны, в пользу того факта, что BRCA1 функционирует только как гетеродимер с BARD1 с вовлечением RING домена, а с другой – подтверждают существенность структурной целостности RING домена для функционирования BRCA1 как онкосупрессора.
Сегмент белка BRCA1, кодируемый экзоном 11 гена BRCA1, в целом представляет собой слабо структурированный район. Аминокислотные замены в данном районе в большинстве случаев не приводят к нарушению функциональной активности белка. Район содержит сайты для зо фосфорилирования киназами ATM и CHEK2, фосфорилирование происходит в ответ на повреждение ДНК [Matsuoka S., 2007].
Между фрагментом белка, кодируемым экзоном 11 и C-концевым BRCT-доменом, находится сравнительно недавно описанный домен CCD, обеспечивающий взаимодействие BRCA1 с белком PALB2 (Partner And Localizer of Brca2) [Sy S.M., 2009].
Исходно PALB2 был описан как BRCA2-взаимодействующий белок, необходимый для локализации BRCA2 в хроматине и на двуцепочечных разрывах ДНК [Xia B., 2006].
Белок PALB2 задействует две различные поверхности для поддержания взаимодействия BRCA1 и BRCA2, соединяя в комплекс два наиболее существенных онкосупрессора, нарушение которых связано с формированием рака яичников и РМЖ.
Неудивительно, что мутации в гене PALB2 были обнаружены при семейных формах РМЖ, рака простаты, яичников, поджелудочной железы [Jones S., 2009; Walsh T., 2011; Rahman N., 2007].
Безусловно, важным районом белка BRCA1, является BRCT-мотив в С-концевой части белка. Судя по тому, что миссенс-мутации в этом районе приводят к формированию предрасположенности к РМЖ, этот район критичен для функционирования BRCA1 как онкосупрессора. BRCT-мотив можно обнаружить в целом ряде белков, которые участвуют в формировании ответа на повреждение ДНК, включая такие белки как XRCC, PARP1, 53BP1, NBS1, DNA pol //, DNA pol X [Leung C.C., 2011].
Структурный анализ белка BRCA1 выявил две аминокислотные последовательности с BRCT-мотивами, миссенс мутации в этих последовательностях, приводящие к дестабилизации BRCT структур, также являются и мутациями, приводящими к формированию наследственных форм рака [Williams R.S., 2001].
Целый ряд белков взаимодействуют с BRCT-доменом белка BRCA1, в частности это CtIP (Cerminal Interacting Protein), p300, BRIP (BRCA Interacting Protein) и ряд других. В ряде исследований было показано, что BRCT является сайтом для связывания в основном фосфорилированных белков, что делает взаимодействие крайне значимым для регуляторных функций белка [MankeI A., 2003; Yu X., 2003].
Судя по всему, BRCT домен белка BRCA1 может рассматриваться как многофункциональный модуль для обеспечения белок-белкового взаимодействия. С этим модулем могут взаимодействовать самые разные по функциям белки – онкосупрессоры, онкогены, транскрипционные активаторы и репрессоры, белки, участвующие в формировании ответа на повреждение ДНК, регуляторы клеточного цикла, факторы убиквитинилирования. Описано более 30 различных белков, которые могут взаимодействовать с BRCA1, подробно изучены четыре макромолекулярных комплекса, которые формируются с участием BRCA1 [Cantor S.B., 2001; Williams R.S., 2001; Bochar D.A., 2000].
BRCA1 в кооперации с белком BARD1 демонстрируют убиквитин лигазную активность. Было показано, что с комплексом BRCA1/BARD1 взаимодействуют ферменты UbcH5c и UbcH7, однако только UbcH5c обеспечивает убиквитин-лигазную активность комплекса. BRCA1 опосредованная убиквитин-лигазная активность комплекса зависит от целостности RING – домена BRCA1, мутации в этом домене (C24A, C39A, C44A, и C61G) полностью блокируют убиквитин-лигазную активность комплекса. Структура макромолекулярного комплекса BRCA1/BARD1/UbcH5c изучена в деталях [Brzovic P.S., 2003]. Не вызывает сомнения, что BRCA1-опосредованная убиквитин-лигазная активность – важнейший элемент регуляции на посттрансляционном уровне. По мнению ряда авторов, именно через убиквитинилирование этим комплексом осуществляется BRCA1-зависимая репарация ДНК, передается сигнал о задержке клеточного цикла и изменении динамики хроматина [Polanowska J., 2006; Morris J.R., 2004].
Выборка пациентов с диагнозом «РМЖ»
Начиная со времени обнаружения связи мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 с наследственными формами РМЖ и рака яичников начались попытки активного внедрения анализа мутаций в этих генах в онкологическую практику. С 1996 г. тестирование мутаций стало доступным для жителей США, Канады, Великобритании. Разнообразие мутаций, отсутствие ярко выраженных «горячих точек» в самых первых исследованиях мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 привели научное и медицинское сообщество в конце 90-х гг. к консенсусу, который заключался в осознании необходимости проводить полное секвенирование кодирующей части генов BRCA1 и BRCA2. Учитывая высокую стоимость процедуры полного секвенирования генов, было предложено проводить анализ только у пациентов, имеющих двух или более родственников с диагнозом «РМЖ» или «рак яичников» в анамнезе. В ряде стран такого рода анализ полностью компенсирует медицинская страховка, однако вопросы, связанные с критериями необходимости тестирования решаются локально даже внутри одной страны – от полного отсутствия компенсации тестирования (Arizona s Medicaid, США) до компенсации тестирования для всех желающих (частные страховые программы) или только для пациентов, имеющих хотя бы одного родственника больного РМЖ (Medicare, США) [Wang G., 2011].
Сам факт наличия родственников с онкологическим заболеванием является для многих достаточно сильным фактором беспокойства, даже финансовая сторона вопроса не всегда становилась решающей при принятии решения о необходимости генетической диагностики для родственников больных. Так, в США процент пациентов с высоким риском наследственного РМЖ, желающих пройти генетическое тестирование, одинаков среди имеющих страховую компенсацию и среди не имеющих страховки вовсе [Olaya W., 2009].
При наличии страховой компенсации и без таковой примерно половина всех пациентов с высоким риском наследственных форм рака в устных опросах заявляли о желании пройти тестирование.
Очевидно, что ситуация с выбором критериев необходимости проведения анализа начинает меняться вместе с накоплением данных о специфике распространенности мутаций в популяциях, связи наличия мутации со специфическими формами опухоли, гистологическими характеристиками, с возрастом. Так, в странах, где ярко выражен «эффект основателя» (Исландия, Кипр, Польша, Литва, Израиль и др.), совершенно логично проводят двустадийный анализ наличия мутаций – исходный анализ на наличие наиболее распространенных в данной популяции мутаций, а при отсутствии этих мутаций - анализ полный структуры ДНК кодирующей части генов BRCA1 и BRCA2. Более того, именно возможность анализировать ограниченный спектр мутаций стимулировала начало внедрения такого тестирования в онкологическую практику Восточной Европы [Janaviius R., 2010].
В целом, очевидна практика смягчения изначально обязательного требования проводить анализ только у пациентов с семейной историей заболевания. Более того, намечается тенденция проводить анализ без семейной истории у всех женщин моложе 50 лет [Kwon J.S., 2010]. Продемонстрирована даже экономическая целесообразность анализа BRCA1 мутаций у женщин моложе 50 лет при наличии трижды негативного РМЖ без учета семейной истории [Hutchinson L., 2010].
Изменяется и сам подход к мониторингу носителей мутаций. Действительно, в конце 90-х годов рекомендации для носителей мутаций были достаточно общие и в основном заключались в необходимости регулярного наблюдения у врача-онколога. Даже проведение регулярных маммографий было под вопросом, так как существовало опасение, что рентгеновское облучение маммографа может стимулировать развитие опухоли. Что касается активных профилактических действий, то единственное, что можно было предложить носителям мутации – это профилактическая мастэктомия или оварэктомия. Профилактические операции значительно шире распространены в Северной Америке по сравнению с Европейскими странами [Metcalfe K.A., 2008]. Единственным «европейским» исключением можно считать Нидерланды, где мастэктомия распространена достаточно широко [Heemskerk-Gerritsen B.A., 2007], однако есть все основания полагать, что в последнее время все больше носителей мутаций в гене BRCA1 начинают использовать мастэктомию как профилактическое средство [Koskenvuo L., 2014]. В США контрлатеральной мастэктомии подвергаются почти 50% больных РМЖ–носителей мутаций в генах BRCA1 или BRCA2 [Metcalfe K.A., 2008]. В 2011 г. Российский Онкологический Научный Центр (г. Москва) зарегистрировал Медицинскую технологию и получил разрешение министерства здравоохранения на проведение контрлатеральной мастэктомии для больных РМЖ – носителей мутаций в генах BRCA1 или BRCA2 [Соболевский В.А., 2010, Будик Ю.А., 2012].
Проведение профилактических операций все-таки остается (и скорее всего, останется в ближайшие годы) мало приемлемой альтернативой для носителей мутаций в России за исключением контрлатеральной мастэктомии у больных РМЖ – носителей мутации. Большая часть носителей мутаций будут явно предпочитать консервативное наблюдение у врача с использованием инструментальных методов. Корректный выбор инструментальных методов наблюдения за носителями мутаций – это, безусловно, задача онкологов, работающих с генетически отягощенными пациентами. За прошедшие годы появились исследования, где достоверно показан более высокий процент выявляемости опухолей на ранних стадиях у носителей мутации с использованием магнитно-резонансной томографии по сравнению с маммографическими исследованиями [Samphao S., 2009; Kriege M., 2004]. Все больше исследователей делают вывод о необходимости использования именно томографии как единственного и наиболее чувствительного метода при выявлении опухолей у носителей мутаций в гене BRCA1 [Obdeijn I.M., 2014]. В то же время вопрос вряд ли можно считать до конца решенным, так, по мнению ряда исследователей ультразвуковое исследование может вносить существенное улучшение в раннюю диагностику опухоли у носителей мутации в гене BRCA1 [Bosse K., 2014].
Выделение ДНК из архивных и свежезамороженных образцов ткани опухоли РМЖ
Несмотря на многочисленные работы, посвященные разработкам методов анализа мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 (см. гл. 1 «Литературный обзор»), «золотым стандартом» анализа мутаций по-прежнему является определение полной нуклеотидной последовательности кодирующей части генов с использованием прямого секвенирования. В первую очередь это связано с большим количеством мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 без преобладания частот встречаемости одной или нескольких мутаций во многих популяциях. Безусловно, использование секвенирования дает исчерпывающую информацию о наличии (отсутствии мутаций) в кодирующей части генов, но высокая стоимость такого анализа (около 3000 Евро в Германии и ряде других стран) не позволяет широко внедрять подобного рода исследование в практику. Лишь наиболее развитые страны могут позволить себе включить такой анализ в социальную медицинскую страховку, причем только в случае ярко выраженной семейной истории больного РМЖ.
Попытки удешевления анализа в основном были ориентированы на использование: а) информации о повышенной частоте встречаемости определенных мутаций в данной конкретной популяции; б) предварительных исследований, позволяющих выявить нуклеотидные замены в последовательности гена. Если варианты (а) безусловно оправданы и позволяют избежать секвенирования генов для значительной части пациентов, то варианты (б) не позволяют дифференцировать нейтральные замены и значимые мутации, в основном требуют дополнительной валидации результатов и не удешевляют процедуру анализа мутаций.
Учитывая, что более 80% мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 - это мутации, приводящие к предварительной терминации трансляции, нами были выполнены исследования, направленные на разработку недорогой технологии, позволяющей выявлять мутации, обуславливающие преждевременную терминацию трансляции. Такая технология могла бы позволить без полного секвенирования обнаруживать значимые мутации, что значительно снизит стоимость анализа.
Для выявления мутации преждевременной терминации трансляции нами изначально был предложен следующий подход: амплификация исследуемого фрагмента ДНК с одновременным введением сайтов, позволяющих клонировать фрагмент в плазмиде в единой рамке считывания с альфа-пептидом бета-галактозидазы; предполагалось, что при отсутствии преждевременной терминации трансляции в исследуемом фрагменте плазмида с фрагментом, клонированным в единой рамке считывания с 125 пептидом -галактозидазы, обеспечит формирование синих колоний E. coli (М15 -gal) при высеве на индикаторную среду; предполагалось, что при наличии мутации, приводящей к преждевременной терминации трансляции в исследуемом фрагменте плазмида с фрагментом, клонированным в единой рамке считывания с альфа-пептидом бета-галактозидазы, обеспечит формирование колоний E. coli (М15 -gal) при высеве на индикаторную среду, однако эти колонии не будут окрашены.
Таким образом, если предлагаемая система будет работать по предложенной схеме, то амплификация фрагмента гена и последующее клонирование ПЦР-фрагмента в соответствующей плазмиде позволят по цвету колоний E. coli на индикаторной среде сделать заключение о наличии/отсутствии мутаций преждевременной терминации трансляции в исследуемом фрагменте. Общая схема данного подхода представлена на рисунке 5.
Для проверки гипотезы нами проведена амплификация полноразмерной копии экзона 11 гена BRCA1 (общая длина ампликона -2998 п.н.). При конструировании праймеров для амплификации экзона 11 в структуру праймеров были введены сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции XhoI и HindIII. Согласно анализу последовательности ДНК экзона 11, сайты узнавания для этих эндонуклеаз отсутствуют в исследуемой последовательности, следовательно, могут быть использованы для последующего клонирования полноразмерного фрагмента в плазмиде pGEM7Zf так, что сохранится единая рамка трансляции «экзон 11 - альфа пептид бета галактозидазы E. сoli». Анализ фенотипа колоний клеток E. coli, содержащих рекомбинантную плазмиду, показал, что в клетках синтезируется -пептид, способный формировать комплекс с Д-M15-галактозидазой.
Сравнение бета-галактозидазной активности клеток E. coli А-M15, содержащих плазмиду pGem7, с активностью клеток, содержащих вновь полученную плазмиду, позволило сделать предварительный вывод о незначительном влиянии дополнительных аминокислот, кодируемых экзоном 11, на функциональную активность альфа-пептида бета-галактозидазы. Действительно, анализ активности бета-галактозидазы в культурах клеток E. coli, несущих плазмиды, «экзон 11 - альфа пептид бета галактозидазы E. сoli» и «экзон 20 - альфа пептид бета галактозидазы E. сoli», в которых экзоны были проклонированны в единой трансляционной рамке с альфа пептидом бета галактозидазы E. coli, продемонстрировал, что активность фермента в этих клетках снижена незначительно (рисунок 6).
Этот факт позволил надеяться на возможность эффективной детекции мутаций преждевременной терминации трансляции в тестируемых фрагментах ДНК, клонированных подобным образом. Для проверки гипотезы о возможности детекции мутаций с использованием подобных слитых белков нами получена серия делеционных вариантов рекомбинантной плазмиды «экзон 11 - а-пептид /?-галактозидазы E. сoli».
Делеции вводили в последовательность, соответствующую экзону 11. Структура полученных плазмид подтверждена с помощью анализа эндонуклеазами рестрикции. Во всех трех делеционных вариантах была сбита рамка трансляции таким образом, что трансляция терминировалась внутри экзона 11 (рисунок 7, А-В).
Оказалось, что несмотря на сбой рамки трансляции, плазмиды Б и В приводят к формированию Lac+ фенотипа клеток E. coli и лишь делеция PstI/PstI в плазмиде А ведет к неспособности плазмиды придавать клеткам Lac+ фенотип.
Делеции обозначены на рисунке 7 штриховой линией, зелеными треугольниками (ini I, ini II, ini III) - сайты с высокой гомологией к сайтам инициации трансляции E. coli, голубыми полосами - возможные сайты инициации трансляции E. coli. Внутри последовательности экзона 11 (фрагмент Eco RI - AsuNHI) приведена нумерация, соответствующая нумерации нуклеотидов в экзоне 11 гена BRCA1, вне фрагмента -нумерация, соответствующая принятой нумерации нуклеотидов для нуклеотидов а-пептида /?-галактозидазыE.coli.
Формирование Lac+ фенотипа клеток E.coli делеционными вариантами плазмид, в которых рамка трансляции встроенного фрагмента была терминирована (в результате делеции), оказалось достаточно неожиданным. Одним из объяснений этого феномена могла стать реинициация трансляции после терминации, вызванной делецией. Для проверки гипотезы о реинициации трансляции на основе плазмиды pUC19 нами сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент ВssNAI/Acc113I с потенциальными сайтами реинициации. Фрагмент проклонирован так, что рамка трансляции альфа-пептида сбивалась при клонировании в сайте BssNAI, но в то же время восстанавливалась в сайте Acc113 I. Фенотип колоний, содержащих рекомбинантную плазмиду, был Lac+, что полностью подтверждало гипотезу о реинициации трансляции.
На рисунке 7 приведены все исследованные варианты делеций, полученных внутри фрагмента, соответствующего экзону 11 гена BRCA1 с обозначением сформированных в результате делеций терминирующих кодонов. Все эти делеции нарушают рамку трансляции, но тем не менее фенотип колоний клеток E. coli остается Lac+ во всех случаях, кроме случая PstI - PstI делеции, при которой оставшийся фрагмент гена BRCA1 составляет менее 70 нуклеотидных пар (рисунок 8).
Встройка чужеродных пептидов после Ala218 щелочной фосфатазы
Чтобы определить воспроизводимость результатов измерения дозы гена HER2/neu в опухолевой ткани молочной железы человека мы определили значение Nher2 для пяти образцов здоровой ткани молочной железы человека. Для этого проводили ПЦР начального количества ДНК 4,5; 9; 18 и 36 нг с использованием праймеров HER2/neu и ubc (в разных пробирках) для всех пяти образцов. Каждая точка повторена трижды внутри одного эксперимента. По полученным данных находили отношение Nher2 для всех точек, где в качестве контроля была принята ДНК образца № G3. Так как отношение находилось в интервале 0,73-1,08 (среднее значение (M) – 0,95, стандартное отклонение (SD) – 0,14), то значение больше 1,37 считали увеличением дозы гена HER2/neu (по формуле M + 3 SD).
Таким образом, был разработан метод анализа дозы гена HER2/neu в опухолевых клетках. В дальнейшем подобный анализ использовался и для анализа дозы других генов, которые могут коамплифицироваться с HER2/neu (рисунок 19).
Для сопоставления результатов анализа методом иммунногистохимии, FISH и ПЦР в режиме реального времени определение дозы гена HER2/neu методом TaqMan ПЦР в реальном времени проводили для 34 образцов с диагнозом РМЖ с известными результатами FISH и ИГХ определения HER2-статуса опухолей РМЖ. Образцы с известными результатами FISH и
ИГХ были любезно предоставлены прфессором М.И. Дубина (Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова). Сравнение полученных результатов представлено в таблице 10.
Таблица 10. Сравнение результатов определения HER2-статуса опухолей РМЖ методом TaqMan ПЦР в реальном времени с результатами ИГХ и FISH диагностики HER2-статуса опухолей РМЖ
Доза гена HER2/neuпо данным ПЦР врежиме реальноговремени Уровень экспрессии HER2/neu по данным ИГХ (в скобках - доза гена по данным FISH – анализа) ИГХ 3+ ИГХ 2+ ИГХ 1+ ИГХ 0 Увеличенная 9 4 (3) 2 2 Не увеличенная 0 6 (7) 3 8 Из таблицы видно, что увеличение дозы гена HER2/neu было показано для всех девяти образцов опухоли РМЖ со статусом ИГХ (3+). Следует отметить, что в клинической практике, при статусе опухоли ИГХ (3+), дополнительная FISH диагностика не проводится. Для десяти образцов со статусом ИГХ (2+) увеличение дозы гена HER2/neu было выявлено в четырех образцах (40%), в то время как FISH диагностика зарегистрировала увеличение дозы гена HER2/neu только в трех образцах (30%).
Для данной группы больных выявлена высокая степень корреляции результатов измерения дозы гена HER2/neu с помощью TaqMan ПЦР в реальном времени и FISH-методов (r = 0,8, p 0,005). При анализе образцов со статусом опухоли ИГХ (1+) TaqMan ПЦР в реальном времени анализ выявил амплификацию в двух случаях из пяти (40%). При анализе опухолей со статусом ИГХ (0), отсутствие амплификации подтверждено для восьми образцов. У двух образцов было зарегистрировано увеличение дозы гена HER2/neu. В данном исследовании результаты анализа образцов с 3+ уровнем экспрессии по ИГХ полностью соответствовали результатам анализа с помощью ПЦР в режиме реального времени, результаты FISH-анализа образцов с 3+ уровнем экспрессии по ИГХ соответствовали результатам ПЦР анализа за исключением одного образца.
В то же время достаточно неожиданным было выявление амплификации в двух образцах из пяти, охарактеризованных по ИГХ с 2+ уровнем экспрессии, и особенно двух образцов из восьми с уровнем экспрессии по ИГХ «0». Вполне возможно, что эти факты могут объясняться амплификацией гена с последующей частичной деградацией внеклеточной части рецептора HER2/neu. Варианты белка с частичной деградацией внеклеточной части известны довольно давно и вполне вероятно, что такие белки не будут выявляться при иммунногистохимическом способе детекции [Scott G.K., 1993].
Данные о дискордантности между иммунногистохимическим анализом и анализом копийности гена HER2/neu были описаны ранее, выдвинуто предположение, что результаты анализа (0 и 1+) при иммунногистохимии и ПЦР в режиме реального времени отличаются из-за более высокой чувствительности ПЦР [Kim Y.R., 2002]. Если это действительно так, то можно предположить, что часть больных, клетки опухолей которых типированы как HER2/neu – негативные вполне могут отвечать на лечение Герцептином, т. е. недостаточная чувствительность ИГХ методов может приводить к некорректным результатам.
Таким образом, в данном разделе работы показано, что определение дозы гена HER2/neu с помощью предложенного протокола TaqMan ПЦР в реальном времени обладает хорошей корреляцией с результатами FISH-метода диагностики HER2-статуса опухолей РМЖ, используемого сегодня в клинической практике для верификации иммунногистохимического анализа
Выявление вариантов HER2/neu-содержащих ампликонов в клетках опухолей при РМЖ методом ПЦР в реальном времени
Методом ПЦР в реальном времени увеличение дозы гена HER2/neu было выявлено в 49 из 162 образцов (30,2%) опухолей РМЖ (NHER2/neu 1,5).Для оценки минимального района амплификации хромосомы вокруг HER2/neu были выбраны смежные гены MED1, STARD3, IKZF3, GSDML, PSMD3, THRA, CASC3, RARA, располагающиеся на протяжении 1015 т.п.н. (рис. 20).
В случае увеличенной дозы двух смежных генов считали, что район, фланкированный данными генами, также амплифицирован. В качестве границы амплификации района хромосомы принимали точку между смежными генами с увеличенной и неувеличенной дозой. Было выявлено несколько групп ампликонов, отличающихся по структуре (рисунок 20).
Увеличение дозы только гена HER2/neu без амплификации окружающих генов было показано для 2/49 (4,0%) образцов. Это свидетельствует о том, что амплификация единственного гена является достаточно редким событием в геноме опухолевых клеток. В 6/49 (1,2%) образцах граница HER2/neu-содержащего ампликона, расположенная ближе к теломере, находилась между генами HER2/neu и IKZF3, в 12/49 (24,4%) образцах – между генами IKZF3 и GSDML, в 10/49 (20,4%) образцах – между генами CASC3 и RARA и в 2/49 (4,0%) теломернее гена TOP2A.
В 12 образцах (24,5%) в районе MED1 – HER2/neu– TOP2A фрагмент последовательности, содержащий гены GSDML, PSMD3 и THRA, имел не увеличенную дозу либо был делетирован, в то время как фланкирующие гены MED1, STARD3, IKZF3, CASC3, RARA и TOP2A имели увеличенную дозу. Граница ампликона, расположенная ближе к центромере, лежала за геном MED1 в 24/49 (48,9%) образцах и между HER2/neu и STARD3 в 6/49 (12,2%) образцах. Увеличение дозы всех генов в районе MED1 – HER2/neu – TOP2A было показано для 17/49 (34,6%) образцов. Поскольку границы амплификации у образцов из этой группы выходили за пределы изучаемого района, мы исключили их из дальнейшего анализа. Возможно, что амплификация такого протяженного района может объясняться анеуплоидией.
