Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Общие закономерности канцерогенеза 9
1.1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста 12
1.2. Современные подходы к поиску новых «онкозначимых» генов 17
1.2.1. Основные подходы к анализу генетического полиморфизма генов в эпителиальных опухолях
1.2.2. Подходы к анализу метилирования промоторных районов генов в эпителиальных опухолях
1.2.3 Комплексные подходы 26
1.3. Роль генных полиморфизмов в формировании онкологического риска... 28
1.3.1. Полиморфные маркеры генов глутатион-8-трансфераз в патогенезе онкологических заболеваний
1.3.2. Ген ТР53 и его регулятор MDM2 - связь с формированием и развитием рака
1.4. Роль метилирования ДНК в канцерогенезе 35
1.5. Гены многоуровневой системы «клеточной защиты» организма, вовлечённые в патогенез немелкоклеточного рака легкого и рака молочной 40
железы
1.5.1. Гены биотрансформации ксенобиотиков - GSTM1, GSTT1 и GSTP1
1.5.2. Гены системы репарации, пролиферации, клеточного цикла и апоптоза
1.5.2.1. Ген ТР53 и функционально связанный с ним ген MDM2 45
1.5.2.2. Ген RASSF1A 48
1.5.2.3. Ген MGMT. 50
2. Материалы и методы 54
2.1. Реактивы, ферменты и буферные растворы 54
2.2. Материалы исследования 54
2.3. Выделение геномной ДНК из крови и ткани 55
2.4. ПЦР-ПДРФ 56
2.5. Бисульфитная конверсия ДНК 59
2.6. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР) 61
2.7. Статистическая обработка результатов 61
2.7.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерий Фишера. Поправка Бонферрони
2.7.2. Оценка относительного риска. Odds ratio. Доверительный интервал... 62
2.7.3. Критерий согласия Пирсона у2 63
3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Ассоциация полиморфных маркеров генов биотрансформации с риском развития немелкоклеточного рака лёгкого и рака молочной железы. Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли
3.2. Ассоциация полиморфных маркеров генов пролиферации клеточного
цикла и апоптоза с риском развития немелкоклеточного рака лёгкого и рака молочной железы. Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли
3.3. Изменение профиля метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT при немелкоклеточном раке лёгкого и раке молочной железы; связь с прогрессией рака
3.4. Сравнительный анализ исследованных генов и их комбинаций у больных с немелкоклеточным раком легкого и раком молочной железы
3.5 Заключение и дальнейшие перспективы 91
Выводы 94
Список литературы
- Основные подходы к анализу генетического полиморфизма генов в эпителиальных опухолях
- Выделение геномной ДНК из крови и ткани
- Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерий Фишера. Поправка Бонферрони
- Изменение профиля метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT при немелкоклеточном раке лёгкого и раке молочной железы; связь с прогрессией рака
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет. Ежегодно более 10 млн. человек во всем мире заболевают раком и около 6 млн. человек умирают от рака ежегодно, что составляет 12% от умерших во всем мире. Только 5-10% случаев рака являются наследственными, а остальные случаи рака являются результатом генетических и эпигенетических повреждений, возникающих в течение жизни в соматических клетках. Повреждения могут происходить либо вследствие воздействия внешних факторов (курения, радиации, алкоголя), либо внутренних (гормоны, иммунная система).
В структуре онкологической заболеваемости на рак легкого, в том числе и немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), приходится около 13% и показатели 5-летней выживаемости очень плохие, даже в странах с высоким уровнем здравоохранения они составляют всего 15% (Jemal et al., 2010). В России ежегодно от НМРЛ погибает около 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей. Считается, что причиной этих новообразований является курение (Имянитов, 2006).
В развитых странах рак молочной железы (РМЖ) выявляется у каждой десятой женщины, смертность при этом доходит до 40%. В отличие от рака легкого, для рака молочной железы не удалось убедительно выявить факторы риска окружающей среды. Предполагается, что в этом случае на первый план выходят факторы, участвующие в поддержании геномной стабильности (Imyanitov et al., 2004).
Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют не только генетические факторы, определяющие индивидуальные различия ферментных систем (Ревазова и др, 2006), но и эпигенетические факторы – метилирование промоторных районов генов (Ходырев и др., 2011). Изменение статуса метилирования промоторных районов генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза. Изменения в уровне метилирования промоторных районов генов MGMT и RASSF1A показаны для рака молочной железы, легкого и опухолей других локализаций.
Генетические и эпигенетические факторы предрасположенности к развитию онкологических заболеваний связаны с несколькими уровнями системы клеточной защиты. К первому уровню можно отнести гены биотрансформации ксенобиотиков, главным образом, гены глутатион-S-трансфераз T1, M1, P1 (GSTT1, GSTM1, GSTP1) (Мартов и др., 2010; Корчагина и др., 2011). Следующий уровень клеточной защиты связан с механизмами прямой репарации повреждения ДНК и на этом уровне важным геном является О(6)-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (MGMT) (Степанов и др., 2010; Пономарева и др., 2011). Третий уровень связан с генами, осуществляющими контроль за пролиферацией и дифференцировкой клеток, к ним относятся ген TP53 со своим регуляторным геном MDM2 (Желтухин и др., 2010), а также ген-супрессор опухолевого роста RASSF1A.
В данном исследовании сделана попытка объединить два аспекта в изучении проблемы повреждения генома человека - нарушение статуса метилирования генов RASSF1A и MGMT и генетический полиморфизм систем клеточного контроля и детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты этих систем - GSTT1, GSTM1, GSTP1, TP53 и MDM2. При этом, чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах, были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии – немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы.
Цель исследования: Изучить вклад метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT, а также полиморфных маркеров генов GSTP1, GSTT1, GSTM1, TP53 и MDM2 в патогенез немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.
Задачи исследования:
-
-
Оценить распределение генотипов полиморфных маркеров генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1, GSTP1) и генов контроля пролиферации клеточного цикла и апоптоза (TP53, MDM2) у больных злокачественными новообразованиями разных локализаций (немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы).
-
Провести сравнительный анализ комбинаций генотипов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, TP53, MDM2 у всех обследованных больных и выявить специфичные сочетания, предрасполагающие к развитию немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.
-
Определить профили метилирования промоторных областей генов RASSF1A, MGMT в эпителиальных опухолях молочной железы и легкого. Выявить возможные корреляции между уровнем метилирования этих генов и прогрессией опухоли.
-
Подобрать информативные системы маркеров, оптимальные для выявления данных видов опухолей.
Научная новизна: В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование ассоциации генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации ДНК и регуляции клеточного цикла и апоптоза с патогенезом онкологических заболеваний различных локализаций и выявлена связь неблагоприятных сочетаний генотипов с риском развития опухоли определенной локализации, ее клинико-гистологическими особенностями. Также впервые получены данные об уровне ассоциации комбинаций генотипов генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков и гена белка-онкосупрессора р53 с развитием злокачественных новообразований. Получены новые данные об ассоциации глутатион-S-трансфераз и генов ТР53 и MDM2 с патогенезом НМРЛ и РМЖ. Впервые выявлена ассоциация предрасполагающих генотипов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, ТР53 и MDM2 и их сочетания с гистологичесим типом опухоли. Впервые получены данные об ассоциации сочетанных предрасполагающих генотипов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, ТР53, RASSF1A и MGMT с патогенезом РМЖ. Впервые обосновано, что суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов глутатион-S-трансфераз Т1, М1, Р1 и предрасполагающих генотипов генов ТР53 и MDM2 превышает эффект индивидуальных генотипов. Проведен анализ молекулярно-генетических нарушений, определяющих различия молекулярного патогенеза НМРЛ и РМЖ.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные по итогам проведенного исследования данные фундаментального характера об ассоциации полиморфных маркеров генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1, GSTP1), и генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и апоптоза (ТР53 и MDM2), а также анализ сочетанных предрасполагающих генотипов этих генов в эпителиальных опухолях, существенно расширяют имеющиеся представления о молекулярно-генетических механизмах возникновения и развития злокачественных новообразований.
Установление роли исследованных генов в развитии злокачественных опухолей обосновывает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых патогенетически оправданных подходов к профилактике и ранней диагностике онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачественных опухолей.
Апробация работы. Аппробация диссертационной работы состоялась на заседании Секции молекулярной биологии Учёного совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 22 мая 2013 года. Результаты настоящей работы были представлены на конференциях: «4th International Conference for Young Scientists 2011 “Molecular biology: advances and prospectives”» (Ukraine, Kiev, 2011), «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011), XV Российский онкологический конгресс (Москва, 2011), «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012), «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 7 материалов конференций и конгрессов, 1 статья в зарубежном сборнике.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 325 источников. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 25 рисунками.
Основные подходы к анализу генетического полиморфизма генов в эпителиальных опухолях
Одним из старейших методов анализа метилирования является Саузерн-блот-гибридизация (Issa et al, 1994). Этому методу свойственны определенные ограничения: 1) требуется большое количество высокомолекулярной ДНК, что невозможно, например, при использовании парафинированных образцов; 2) недостаточная чувствительность при поиске метилирования в гетерогенных образцах, таких как биопсия, в которых кроме опухолевых клеток значительную долю составляют нормальные клетки; 3) метод дает информацию о метилировании только тех CpG-динуклеотидов, которые относятся к участкам узнавания соответствующих рестриктаз.
Анализ метилирования фрагментов ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз (МЧРА).
Этот метод основан на комбинировании метилчувствительных рестриктаз и ПЦР (Логинов и др., 2004). Продукт ПЦР виден только в тех случаях, когда расщепление геномной ДНК рестриктазой было запрещено метилированием. Чувствительность метода выше, чем при гибридизации по Саузерну. Этот подход позволяет анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей дикого типа, но он не лишен ряда минусов: 1) исследуется метилирование только тех CpG-динуклеотидов, которые входят в состав участков узнавания метилчувствительных рестриктаз; 2) зависит от полноты расщепления рестриктазами геномной ДНК; 3) недостаточная очистка ДНК от белка может приводить к ложно-положительным результатам.
Метилспецифический фингерпринтинг (МСФ).
Этот метод направлен на выявление аномального метилирования новых генов, вовлеченных в канцерогенез, в различных формах опухолей или на разных стадиях злокачественного процесса (Залетаев и др., 2004). Сначала проводится гидролиз геномной ДНК с использованием двух ферментов рестрикции, один из которых является метилчувствительным. В первом варианте метода олигонуклеотидные праймеры для ПЦР являются неспецифическими, содеожащими только цитозин и гуанин, что характерно для CpG-островков промоторных областей генов. Во втором варианте метода используются наборы специфических праймеров для CpG-островков определенных генов. В результате неспецифической амплификации наблюдается набор полос различной молекулярной массы. Сравнение картины амплификации, полученной на образцах ДНК из нормальных тканей и опухолевого материала, позволяют определить необычные фрагменты, которые могут свидетельствовать об аномальном метилировании какого-либо гена при заболевании.
Бисульфитный сиквенс.
Этот метод (Frommer et al, 1992) основан на модификации ДНК, в результате которой все цитозины переходят в урацил, в отличие от метилированных 5 -метилцитозинов. Модифицированные образцы должны быть амплифицированы и секвенированы. В некоторых случаях (гетерогенность материала) требуется предварительное клонирование ПЦР-продуктов. Основными проблемами данной методики является ее трудоемкость и непригодность к быстрому скринингу больших выборок образцов. Но в то же время она позволяет наиболее точно исследовать уровень метилирования гена в опухолях и оценить степень гетерогенности материала.
Метилспецифичная ПЦР (МС-ПЦР). МС-ПЦР основана на бисульфитной конверсии метилированной или неметилированной нуклеотидной последовательности ДНК с последующей ПЦР {Herman et al, 1996).
Преимуществами МС-ПЦР являются: 1) отсутствие необходимости применения рестриктаз и как следствие отсутствие проблем с неполной рестрикцией; 2) возможность анализа метилирования CpG-динуклеотидов независимо от наличия участков рестрикции. 3) метод позволяет работать с архивными образцами.
Чувствительность метода МС-ПЦР для разных генов сильно различается и колеблется от 10" до 10" {Herman et al, 1996). Высокая эффективность метода подтвердилась при исследовании пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи, было показано почти 100% метилирование промоторных районов генов RASSF1A и MGMT {Koutsimpelas et al, 2012).
Комбинированный бисульфит-рестриктазный анализ (КОБРА).
Метод основан на стандартной процедуре модификации ДНК бисульфитом с последующим расщеплением продуктов ПЦР рестриктазами и количественным анализом (Bubnov et al, 2012). Праймеры для ПЦР не содержат в своем составе CpG-динуклеотидов, для того чтобы не зависеть от статуса метилирования исследуемого образца. При анализе продуктов ПЦР из гетерогенной популяции, результат будет отражать процентное соотношение метилированных аллелей на данном участке ДНК.
Бисульфитная ПЦР-SSCP (BiPS).
Разработан метод, основанный на бисульфитной обработке ДНК с последующим SSCP анализом продуктов ПЦР (Nomoto et al, 2002). Праймеры подобраны таким образом, чтобы они работали независимо от статуса метилирования исходной последовательности ДНК. BiPS позволяет легко оценить уровень метилирования фрагмента ДНК и соотношение метилированных аллелей. Если все сайты в данном фрагменте в исследуемом образце метилированы, то на геле будет видна одна полоса. Однако иногда продукт виден в виде двух полос или смазан, что обусловлено неоднородностью метилирования и гетерогенностью исходного материала, и не подходит для количественного анализа.
Модификация ДІЖ бисульфитом в комбинации с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ПЦР-РВ).
На первом этапе проводится стандартная обработка геномной ДНК бисульфитом, на втором - гибридизация с пробой, содержащей на 5 - конце флуоресцентный краситель (FAM) и на 3 - гаситель (TAMRA) (Ohshima et al, 2012). К преимуществам такой комбинации методов относятся, в первую очередь, повышение чувствительности и получение количественной характеристики степени метилирования гена в образце, например, возможность оценить долю клеток, в которых ген метилирован.
Метод метилспецифичных микропанелей.
На первом этапе проводится стандартная обработка геномной ДНК бисульфитом с последующей ПЦР. Праймеры для ПЦР не содержат в своем составе CpG-динуклеотидов. На следующем этапе проводится гибридизация ПЦР-продукта с олигонуклеотидными ДНК-мишенями, прикрепленными 5 -концом к подложке (например, предметному стеклу) и мечеными флюоресцентным красителем на 3 -конце (Су5 или СуЗ). Условия гибридизации подбираются так, чтобы не происходила одновременная гибридизация метилированного и неметилированного аллелей (Hayashi et al, 2007). Метод позволяет анализировать, как единичные CpG-динуклеотиды, так и несколько CpG, расположенных рядом в GC-богатых генах, и проводить одновременный анализ метилирования промоторных районов нескольких генов.
Выделение геномной ДНК из крови и ткани
Накоплены данные, свидетельствующие о том, что снижение экспрессии гена RASSF1A связано с метилированием промоторного района этого гена (Lorente et al, 2009; Onay et al, 2009; Karray-Chouayekh et al, 2010), под действием 5-аза-2-дизоксицитидина происходило возобнавление экспрессии гена, что в свою очередь приводило к остановке роста клеточных линий (Koutsimpelas et al, 2012). Метилирование промоторного района гена RASSF1A отмечено в эпителиальных опухолях разных локализаций (Juhlin et al., 2010; Daniunaite et al., 2011; Fernandes et al., 2013; Bondurant et al, 2011). Также метилирование гена RASSF1A найдено с частотой 30-60% при немелкоколеточном раке легкого и раке молочной железы (Wang et al, 2011; Kioulafa et al, 2009; Karray-Chouayekh et al, 2010; Sebova et al, 2011-2012). В ряде работ отмечена связь метилирования данного гена с неблагоприятными прогностическими признаками, такими как низкая степень дифференцировки (Choi et al, 2005; Ко et al, 2013), возраст, в котором пациент начал курить (Kim et al, 2003), образование метастазов (Choi et al, 2005; Yanagawa et al, 2007), иммуно-гистохимический стутус опухоли при раке молочной железы (Sunami et al, 2008). Во многих исследованиях показано, что метилирование RASSF1A является плохим прогностическим признаком и связано с низком порогом выживаемости (Karray-Chouayekh et al, 2010; Wang et al, 2011; Xu et al, 2012; Jiang et al, 2012). Метилирование гена RASSF1A может служить и диагностическим признаком, так как выявляется уже на ранней стадии онкокенеза (Kioulafa et al, 2009). В некоторых работах был показан синергизм между метилированием промоторного района гена RASSF1A и аллельными делециями, что указывает на "двухударный" механизм инактивации этого гена (Логинов и др., 2009). В последних работах по исследованию механизмов инактивации данного гена, показано, что при связывании белка р53 с его промоторным районом, происходит снижение экспресиии гена RASSF1A (Tian et al, 2011).
Ген MGMT (Об-methylguanine-DNA-methyltransfrase) расположенный в области 10q26 и содержащий 5 экзонов (Рис. 11), кодирует ядерный белок, играющий ключевую роль в репарации повреждений в ДНК, вызываемых алкилирующими агентами (Лихтенштейн и Киселева, 2001). Белок Mgmt катализирует реакцию нуклеофильного присоединения алкильных и метальных групп с 06-позиции гуанина к собственному остатку цистеина в своем активном центре, после чего инактивируется, при этом не вызывая разрывов в молекуле ДНК (Kaina et al, 2007). О-6-метилгуанин и 0-6-алкилгуанин образуются в результате действия на ДНК алкилирующих метаболитов таких канцерогенов, как N-нитрозоалкилмочевина, этил- и метилметансульфат, N-метил-Ы-нитронитрозогуанин (Esteller et al, 2001). О-6-метилгуанин способен образовывать водородные связи с тимином, что приводит после репликации ДНК к замене пары G:C на А:Т. О-6-алкилгуанин может образовывать сшивки с цитозином в противоположной цепи ДНК, блокируя репликацию (Рис. 12). Несмотря на минорность таких повреждений ДНК в клетке, они имеют значительное цитотоксическое, мутагенное и канцерогенное воздействие на клетки (Juillerat et al, 2007). Мыши, нокаутные по гену MGMT жизнеспособны, но у них резко повышено количество спонтанно возникающих опухолей и они чувствительны к действию алкилирующих агентов. Напротив, у мышей с гиперэкспрессией MGMT спонтанные опухоли развиваются значительно реже, чем у контрольных (Ishikawa et al, 2004). MGMT был первым геном млекопитающих, у которого была показана экспрессия, индуцированная действием генотоксического стресса и глюкокортикоидов, приводящая к адаптивному ответу клетки на мутагенное и токсическое действие простых алкилирующих агентов. Таким образом, ген MGMT обеспечивает защиту клеток от негативного влияния алкилирования ДНК, однако, экспрессируясь в опухолевых клетках, ген MGMT ограничивает эффективность химиотерапии с использования алкилирующих соединений.
Показано, что экспрессия гена и активность фермента Mgmt варьирует в широких пределах (Margison et al, 2007). Алкилирование белка Mgmt человека является его основной модификацией, которая связана с его репаративной функцией, и после присоединения алкильных групп Mgmt деградирует за счет протеолиза (Verbeek et al, 2008). В опухолях, где экспрессия гена MGMT снижена, как правило, отсутствуют, как белок, так и мРНК, а делеции и точечные мутации гена встречаются крайне редко, что указывает на эпигенетическую природу регуляции экспрессии этого гена (Christmann et al, 2011). Экспрессия MGMT регулируется метилированием как самого гена, так и его промотора, причем метилирование промотора приводит к ее ингибированию, а метилирование самого гена к повышению экспрессии MGMT. Большинство таких опухолей приходится на злокачественные глиомы, меланому, нейроэндокринные опухоли брюшной полости, колоректальный рак, рак шейки матки, мочевого пузыря, плоскоклеточный рак головы и шеи и некоторые гемобластозы (Arnold et al, 2007; Jarmalaite et al, 2008; Hiopoulos et al, 2009; Carvalho et al, 2011; Cesinaro et al, 2012; Nehru et al, 2012; Mokarram et al, 2013). Описано использование гиперметилированного варианта гена MGMT в качестве маркера для неинвазивного мониторинга опухолевого присутствия (Sun et al, 2012). Прогностическое значение инактивации гена MGMT до конца не выяснено. Однако показано, что эта инактивация ассоциирована с потенциальной чувствительностью опухолевых клеток к простым алкилирующим агентам - как метилирующим, так и этилирующим. MGMT
Схематическое изображение механизма деметилирования ДНК белковым продуктом гена MGMT. Соответствующие данные были получены для злокачественных глиом, неироэндокринных опухолей, и в самое последнее время - для колоректального рака (Christians et al, 2012; Hammel et al, 2012; Amatu et al, 2013). Было установлено, что метилирование промотора MGMT в глиобластоме связано с более длительным сроком жизни, повышенной эффективностью лечения алкилирующими химиопрепаратами (Christians et al., 2012).
Также метилирование MGMT найдено при немелкоколеточном раке легкого и раке молочной железы с частотой 8-64% (Землякова и др., 2003; Ekim et al, 2011; Tserga et al, 2012). Показано что частота метилирования промоторного района гена MGMT, при аденокарциноме легкого выше, чем в других гистологических типах НМРЛ, а также возрастает в низко дифференцированных опухолях (Wolfet al, 2001). В ряде работ отмечена связь метилирования данного гена с неблагоприятными прогностическими признаками, такими как низкая степень дифференцировки (Tserga et al, 2012), возрастом, в котором пациент начал курить (Ekim et al, 2011), иммуно-гистохимическим стутусом опухоли при раке молочной железы (Fumagalli et al, 2012). В некоторых исследованиях показано, что метилирование MGMT является плохим прогностическим признаком и связано с низким порогом выживаемости (Botana-Rial et al, 2012). Опухоли легкого, в которых не экспрессируется MGMT, характеризуются повышенной частотой точечных мутаций в гене, кодирующем белок р53 (Lai et al, 2008). Группой ученых из Калифорнийского университета было показано, что полиморфный маркер Rel05Val гена GSTP1 ассоциирован с абберантным метилированием гена-супрессора р16, ингибитора киназ клеточного цикла и гена MGMT, участвующего в репарации ДНК (Gilliland et al, 2002).
Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерий Фишера. Поправка Бонферрони
Значительный интерес представляет изучение сочетаний генотипов изученных полиморфных маркеров. Следует отметить, что в зарубежной практике исследования о влиянии сочетанных генотипов на развитие заболевания и его прогрессию проводят не часто. В основном это работы, основанные на популяционных исследованиях азиатских учёных (Sreeja et al, 2008; Naushad et al, 2011). Для пациентов московского региона подобный анализ проводился впервые.
Мы показали, что "нулевой" сочетанный генотип (-/-) генов GSTM1 и GSTT1 в 2,6 раза чаще встречается у больных НМРЛ - 27,3 против 10,6% в группе контроля (%2 = 11,4) (Рис. 22). Относительный риск развития НМРЛ для данного сочетания генотипов составил 3,15 (СІ95% = 1,59 - 6,27, р = 0,003). Была обнаружена высокодостоверная ассоциация сочетанного генотипа (Val/Val)/(-/-) генов GSTP1 и GSTT1 мы выявили, что частота встречаемости такого сочетанного генотипа в 3 раза выше у больных НМРЛ -11,4 против 3,8% в группе контроля (х2 = 5,45).
Распределение частот сочетанных генотипов генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 в контрольной группе и группе больных с НМРЛ: А. «нулевых» генотипов генов GSTM1 и GSTT1; Б. генотипа (-/-)/(Val/Vat) генов GSTT1 и GSTP1. А. в контрольной группе и группе больных НМРЛ; Б. в группах больных АК и ПРЛ.
Распределение частот сочетанных генотипов генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 в контрольной группе и группе больных с РМЖ: А. «нулевых» генотипов генов GSTM1 и GSTT1; Б. генотипа (-/-)/(Val/Val) генов GSTT1 и GSTP1. составил 3,29 (СІ95% = 1,15 -9,39, р = 0,02). Наши данные согласуются с данными исследования зарубежных учёных (Sreeja et al, 2008; Sobti et al, 2008).
Проведенный анализ показал, что в группах больных РМЖ сочетанный генотип GSTM1 (-/-)/GSTTl(-/-) встречается в 2,2 раза чаще, чем в контрольной группе (45,7% против 21%; х2 19,05). Относительный риск развития РМЖ при носительстве данного сочетанного генотипа составляет 3,17 (СІ95%=1,87-5,36, р=7,0хЮ 5). Сочетанный генотип GSTTl(-/-)/GSTM(-/-)/GSTPl(Val/Val) встречается у больных РМЖ в 2,3 раза чаще, чем в контрольной группе: 42,1% против 18,1% (jl= 19,03). При этом относительный риск развития составляет 3,29 (СІ95%= 1,90-5,69, /?=8,0х10"5) (Рис. 23). Сходные данные получены в исследованиях в других популяциях (Saxena et al, 2009; Ramalhinho et al, 2011).
Также интерес представляют результаты, полученные при изучении распределения частот сочетанных генотипов изученных полиморфных маркеров для генов ТР53 и MDM2. Так, частота сочетанного генотипа {Pro/Pro)/{TG) генов ТР53 и MDM2 в группе больных НМРЛ составила 9,1% (%2 = 9,02, р = 0,01, OR = 7,90, С195% = 1,64 - 38,07), статистически значимо превышая этот показатель в контроле 1,3 % (Рис. 24 А). Следует отметить увеличение частоты встречаемости сочетанного генотипа (Pro/Pro)/(TG) генов ТР53 и MDM2 и в группе больных с АК и в группе больных с ПРЛ в 7-8 раз по сравнению с контрольной группой (%2 = 7,88 и у2 = 8,82, соответственно) (Рис. 24 Б). При этом относительный риск развития АК составил 9,12 (СІ95% = 1,45 - 57,21, р = 0,02), а ПРЛ - 8,59 (СІ95% = 1,61 - 45,73, р = 0,01). Полученные нами результаты согласуются с данными зарубежных авторов (Wilkening et al., 2007: Lang et al, 2009; Chua et al, 2010). Следует отметить, что частота сочетанного генотипа Pro/Pro + TG генов ТР53 и MDM2 в группе больных РМЖ составила 33,3%, что статистически значимо превышает этот показатель в контрольной группе (2,7%) (р = 0,0016). При рассмотрении сочетания генотипов изученных полиморфных маркеров генов ТР53 и MDM2 в гистологических подтипах РМЖ, было отмечено увеличение частоты встречаемости генотипа Pro/Pro + TG в группе больных ипРМЖ в 14 раз (р = 0,0007) (Рис. 25). TP53 + MDM2
Распределение частот сочетанных генотипов генов ТР53 и MDM2, в контрольной группе и группе больных РМЖ и ипРМЖ Нами также было проанализировано сочетание генотипов полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53 и генов II фазы биотрансформации (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) с риском развития НМРЛ и РМЖ. Все группы обследованных пациентов были разделены на 2 подгруппы: 1- лица, имеющие Arg/Arg-теяотші полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53, 2- лица, имеющие Arg/Pro- и Pro/Pro-генотипы полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53. Анализ полученных результатов по распределению сочетанных генотипов исследованных генов II фазы биотрансформации у онкологических больных и здоровых доноров позволил установить, что общей характеристикой для НМРЛ и РМЖ, имеющих в генотипе Pro-аллель полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53, явилось увеличение частоты патологических генотипов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 по сравнению с лицами, несущими Arg-аллель полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53 в гомозиготном состоянии. Результаты для НМРЛ и РМЖ представлены в таблицах 11 и 12. Риск развития немелкоклеточного рака легкого при неблагоприятном сочетании Рго-аллеля полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53 и функционально неполноценного GSTT1 составил 4,62 (СІ95%=1,75 - 12,18). У больных НМРЛ с Рго-аллелем полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53 была установлена статистически более высокая частота функционально неполноценного генотипа гена GSTP1 по сравнению со здоровыми лицами, имеющими Pro-аллель р53 (87,3 и 53,2%, соответственно, при р=0,0007), при этом риск развития НМРЛ возрастает в 6,03 раза (СІ95%=2,27 - 16,05). Важно отметить, что при анализе комбинации двух или более нефункциональных генотипов генов II фазы биотрансформации и Рго-аллеля полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53 показано, что частота таких «дефектных» генотипов увеличивается почти в 2 раза в группах больных относительно контроля (59,5% против 28,2% для GSTT1/GSTM1 и 66,7% против 33,3% для GSTT/GSTM1/GSTP1), при этом риск развития НМРЛ составил 3,73 (С195%= 1,43 - 9,73) и 4,00 (СІ95%= 1,44 - 11,13), соответственно.
Важно отметить, что с относительным риском развития РМЖ ассоциирован только сочетанный генотип генов ТР53 и GSTM1 (OR = 4,73, р - 0,03), ничего не показавший для НМРЛ (табл. 11 и 12).
На основании полученных нами данных можно предположить, что экспозиция мутагенов внешней среды является важным фактором индукции мутационных процессов посредством негативного влияния на белковые компоненты репарационной системы, стресс-активации транскрипционной активности гена ТР53 в патогенезе НМРЛ,
Изменение профиля метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT при немелкоклеточном раке лёгкого и раке молочной железы; связь с прогрессией рака
В настоящей работе изучено распределение генотипов полиморфных маркеров генов II фазы биотрансформации ксенобиотиков - GSTT1, GSTM1, GSTP1 при немелкоклеточном раке легкого и раке молочной железы. Нами показана высокая частота предрасполагающих генотипов генов GSTT1 и GSTP1 у больных с НМРЛ и РМЖ по сравнению с группой здоровых лиц, что может свидетельствовать о том, что полиморфные маркеры этих генов вовлечены в патогенез этих заболеваний. Установлено, что в обследованных группах больных носительство нулевого генотипа гена GSTM1 не имеет рисковой значимости для НМРЛ, однако при раке молочной железы данный полиморфный маркер связан с высоким риском развития заболевания. При анализе ассоциаций изученных полиморфных маркеров с патофизиологическими характеристиками опухолевого процеса, а также рядом факторов внешней среды было показано, что нулевой генотип гена GSTT1 ассоциирован с прогрессией НМРЛ. В то же время в группе больных с РМЖ ассоциация полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 выявляется только на ранних стадиях. Наиболее значимым для генетических и биомедицинских исследований является «нулевой» вариант GSTT1 (-) и такой генетический вариант снижает чувствительность индивидов к канцерогенам, токсинам и некоторым лекарственным веществам {Bolt et al, 2006). Мы установили, что частота встречаемости данного генотипа в опухолях НМРЛ и РМЖ составляет 34% и 44% соответственно, что в 2-2,5 раза выше чем в популяции русского населения европейской части России (Хрунин и др, 2008; Корчагина и др., 2011).
Так же нами было изучено распределение частот генотипов полиморфных маркеров Arg72Pro гена-онкосупрессора ТР53 и T309G гена MDM2 при немелкоклеточном раке лёгкого и раке молочной железы. Обнаружена повышенная частота предрасполагающего генотипа гена ТР53 у больных с НМРЛ, РМЖ и их гистологическими подтипами (АК, ПРЛ и идРМЖ, ипРМЖ), что может свидетельствовать о том, что носительство предрасполагающих аллелей гена ТР53 играет существенную роль в формировании данных эпителиальных опухолей. Для полиморфного маркера гена MDM2 обнаружена ассоциация с риском развития НМРЛ и его гистотипов, тогда как для РМЖ ассоциация показаеа только для самого заболевания. При анализе полученных данных с учетом клинико-гистологических параметров опухолевого процесса, было показано, что предрасполагающие генотипы Pro/Pro и TG полиморфных маркеров генов ТР53 и MDM2 ассоциированы прогрессией немелкоклеточного рака лёгкого. Также было показано, что генотип Pro/Pro полиморфного маркера гена ТР53 ассоциирован с риском развития НМРЛ в группе курящих больных. При анализе групп больных разного возраста была показана ассоциация предрасполагающих генотипов Pro/Pro и TG полиморфных маркеров генов ТР53 и MDM2 с развитием НМРЛ у пациентов старше 60 лет, а с развитием РМЖ у пациентов моложе 53.
Нами также было исследовано метилирование промоторных районов генов-супрессоров опухолей (MGMT и RASSF1A) у пациентов с НМРЛ и РМЖ. Показана связь метилирования этих генов с прогрессией и неблагоприятным прогнозом исследованных форм рака.
Важно подчеркнуть, что само наличие неблагоприятного аллеля не позволяет судить ни о времени начала заболевания, ни о его тяжести, ни даже с уверенностью говорить о том, что тестируемый наверняка заболеет именно этой болезнью. Генетическое тестирование в досимптоматический период дает возможность выявить существующие пока только в геноме наследственные тенденции к развитию будущих болезней и, исходя из современного врачебного опыта, наметить пути их ранней профилактики.
В целом, полученные нами результаты свидетельствуют об общности некоторых аспектов канцерогенеза, а также о том, что свойства факторов риска проявляют: для немелкоклеточного рака легкого - нулевой генотип GSTT1, Val-аллель гена GSTP1, Pro/Pro и T/G генотипы генов ТР53 и MDM2, а также метилирование промоторных районов генов RASSF1A и MGMT; для рака молочной железы - нулевые генотипы GSTT1 и GSTM1, Val-аллель гена GSTP1; про-аллель р53; метилирование промоторных районов генов RASSF1A и MGMT.
Помимо свойства факторов предрасположенности к онкологическим заболеваниям патологические аллели и генотипы исследованных генов играют, по-видимому, патогенетическую роль в развитии злокачественного процесса, формировании его клинико-морфологических особенностей. Степень риска возникновения рака и развития его клинических особенностей, связанная с изученными генами, зависит также от комбинации генотипов. Для онкологических заболеваний исследованных локализаций выявлены предрасполагающие варианты генотипов.
Значение подобных исследований заключается в том, что на их основе можно ранжировать популяции по уровням риска развития мультифакториальных заболеваний и более эффективно организовать профилактические мероприятия, поскольку масштабы воздействия факторов окружающей среды на человеческую популяцию неизмеримо велики. Такой подход сделает возможным выделение в популяциях или производственных контингентах с вредными условиями труда групп повышенного риска для организации профилактических мероприятий.
Помимо генотипирования полиморфных вариантов генов с целью выявления лиц с высоким онкологическим риском следует также проводить анализ аномального метилирования, который может использоваться в ранней неинвазивной диагностике злокачественных новообразований. Метилирование, являясь эпигенетической модификацией ДНК, может в случае нарушения приводить к генетическим изменениям, делая очевидной взаимосвязь между генетическими и эпигенетическими процессами при возникновении и развитии опухоли. Нарушение паттерна метилирования проявляется на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток млекопитающих. С медицинской точки зрения, это открывает возможности для ранней диагностики онкологического заболевания. В связи с этим анализ гиперметилирования генов-супрессоров опухолевого роста (RASSF1A), генов репарации ДНК (MGMT) и генотипирование генов апаптоза (ТР53 и MDM2) и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) являются перспективными направлениями профилактики и ранней диагностики злокачественных новообразований.
Похожие диссертации на Роль генетических и эпигенетических факторов в развитии рака молочной железы и немелкоклеточного рака лёгкого
-
