Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1.1 Предшественник бета-амилоида (ПБА) 8
1.2 Бета-амилоид 9
1.3 Металлсвязывающий фрагмент бета амилоида человека и крысы 11
1.4 Нейротоксичность бета-амилоида 16
1.5 Амилоидные фибриллы 18
Промежуточные продукты процесса фибриллообразования 18
Процесс агрегации Ар 22
Условия агрегации in vitro и in vivo 24
1.6 Методы определения структуры белка 25
1.7 Определение структуры белка методом спектроскопии ЯМР 25
Пробоподготовка 26
Измерение спектров ЯМР 27
Отнесение сигналов 27
Получение структурных ограничений 30
Расчет и оптимизация структуры 31
II. Экспериментальная часть 37
2.1 Приготовление образцов 37
2.2 Измерение спектров ЯМР 38
2.3 Отнесение сигналов и получение ограничений 39
2.4 Расчет структур 45
Оптимизация протокола для программы GROMACS 48
Уточнение координат репрезентативной структуры методом ММ/КМ 56
Визуализация и оценка качества получаемых структур 57
III. Результаты и их обсуждение 58
3.1 Отнесение сигналов 58
3.2 Ограничения на межъядерные расстояния и диэдральные углы
3.3.1 Оптимизация протокола для программы GROMACS 59
3.3.2 Расчет структур пептида Rat АР(1-16) в свободном состоянии и в комплексе с цинком 70
3.3.3 Расчет структур пептида Ар (1-16) в комплексе с цинком 79
3.3.5 Изучение взаимодействия Ар 1S0(1-16) с ионами Zn + 90
Выводы 96
Список литературы
- Металлсвязывающий фрагмент бета амилоида человека и крысы
- Определение структуры белка методом спектроскопии ЯМР
- Отнесение сигналов и получение ограничений
- Оптимизация протокола для программы GROMACS
Металлсвязывающий фрагмент бета амилоида человека и крысы
При неамилоидогенном пути ПБА разрезается а-секретазой по положению между Lys687 и Leu688 освобождая растворимый N-терминальный фрагмент рПБАа. Оставшийся связанным с мембраной С-терминальный фрагмент далее разрезается у-секретазой по положению Val711/Ile712 или Ala713/Thr714 образуя АР(17-40) или Ар (17-42) [29-32]. При амилоидогенном пути первоначальное разрезание ПБА осуществляется Р-секретазой в положении Met671/Asp672 освобождая растворимый фрагмент рПБАр. Далее, оставшийся связанным с мембраной фрагмент разрезается у-секретазой образуя АР(1-40) (-90%) и АР(1-42) (-10%) [23, 24, 33]. Пептид АР(1-42) считается основной патогенной формой Ар поскольку является более гидрофобным, проявляет повышенную склонность к агрегированию и является основной формой пептида, обнаруженной в амилоидных бляшках [34, 35]. Также следует отметить что мутации в гене кодирующем ПБА, ответственные за наследственную форму БА, как правило приводят к увеличению синтеза АР(1-42) относительно АР(1-40) [36]. Бета-амилоид встречается у всех млекопитающих, но аминокислотная последовательность у разных видов может различаться.
До недавнего времени физиологическая роль бета-амилоида была неизвестна и он считался биологическим «мусором». Однако в недавних работах [7-9] было показано, что Ар участвует в системе врожденного иммунитета, обладая сильной антимикробной активностью, подобно другим схожим по структуре пептидам LL-7 и лактоферину. От антител (лежащих в основе приобретённого, или специфического, иммунитета) их выгодно отличает то, что они могут действовать в нервной ткани и в ткани мозга, куда антитела не попадают. Это защищает человека от таких заболеваний, как менингит и нейрокандидоз. Помимо этого, было показано, что концентрация Ар связанна с синаптической активностью. В частности фармакологические препараты, увеличивающие нейронную активность, стимулируют производство Ар, в то время как препараты, снижающие нейронную активность, уменьшают уровень Ар [10]. С физиологической важностью Ар также согласуется тот факт, что ингибирование секреции этого пептида приводит к смерти нейронной клетки. Обработка нейронных клеток ингибиторами а- и у-секретаз снижает их выживаемость, в то время как добавление АР(1-40) предотвращает токсичность этих секретаз. Эти факты однозначно указывают на роль Ар в поддержании нейронных клеток в жизнеспособном состоянии. Следует заметить, что аналогичная обработка других типов клеток, не имеющих отношения к нейронам, не влияет на их выживаемость [37]. В нормальных условиях, уровень всех пептидов определяется балансом между их анаболизмом и катаболизмом. Бета-амилоид не является исключением, и расщепляется различными пептидазами (в частности, инсулин-расщепляющим ферментом, неприлизином и др.) [38]. Ряд исследований, проведенных на трансгенных мышах и пациентах страдающих болезнью Альцгеймера, показали, что уровень Ар-деградирующих ферментов уменьшается с прогрессированием заболевания [39].
Трехмерную структуру Ар в растворе методами ЯМР не удается получить ввиду его высокой конформационной подвижности и плохой растворимости пептида в воде. В то же время, оказалось невозможным получить кристаллы Ар, что в свою очередь необходимо для определения структуры пептида методом рентгеновской кристаллографии. Была, однако определена структура фибриллярных образований бета-амилоида, полученных in vitro, которые структурно подобны агрегатам амилоидных бляшек, образующихся в человеческом мозгу при болезни Альцгеймера [40]. Трехмерная структура фибрилл Ар была определена методом ЯМР твердого тела. Пептид Ар состоит из двух фрагментов: гидрофильного 1-16 и гидрофобного 17-42. Гидрофобные участки молекул пептида, для которых удалось получить структурные данные, соединены между собой водородными связями в форме бета листов (рис.2), образуя гидрофобное ядро. Предполагается, что гидрофильные фрагменты 1-16 направлены наружу, не участвуя в стабилизации структуры фибриллы.
Строение гидрофобного ядра фибриллярных образований бета-амилоида. Вместе с тем, усеченная форма 17-42 Ар теряет способность к образованию фибрилл, что указывает на важную роль фрагмента 1-16 в процессах формирования бляшек in vivo. 1.3 Металлсвязывающий фрагмент бета амилоида человека и крысы
Как уже отмечалось выше, процесс образования амилоидных агрегатов связан с хелатированием фрагмента 1-16 бета-амилоида ионами переходных металлов. Этот процесс предваряет, а, возможно, и обуславливает, последующую олигомеризацию пептида и дальнейшее образование гидрофобного фибриллярного ядра [34, 41-45]. Это, в частности, подтверждается и повышенным содержанием ионов переходных металлов в амилоидных отложениях. Так, концентрация ионов цинка в амилоидных бляшках составляет 1 мМ, меди 400дМ, а трехвалентного железа 1 мМ [46, 47], в то время как внутриклеточеая концентрация указанных свободных металлов в мозгу не превышает 10" М [48]. Однако концентрация ионов металлов в синаптической щели значительно выше и составляет 15-250дМ для ионов меди [49] и 100-ЗООдМ для ионов цинка [50]. Была измерена константа диссоциации для комплекса АР(1-16) с цинком, она составляет 100 дМ [51]. Последующие исследования показали, что в качестве лигандов, хелатирующих ионы переходных металлов, выступают аминокислотные остатки гистидина (His6, Hiso, Hisi4) [52-54]. Исследование комплекса АР(1-16) с ионами цинка, проведенное с помощью масс-спектроскопии с ионизацией методом электрораспыления в газовой фазе, позволило предположить, что четвертым лигандом является аминокислотный остаток аргинина в пятом положении [55]. Позже методом ЯМР была определена структура АР(1-16) человека и его комплекса с цинком (рис. 3) в растворе [22]. В этой работе было установлено, что четвертым лигандом, хелатирующим ион цинка, является аминокислотный остаток глутамата в одиннадцатом положении, что опровергает ранее полученные данные (рис. 4).
Определение структуры белка методом спектроскопии ЯМР
Определение структуры глобулярных белков методом ЯМР, является сложной, но отлаженной задачей (см. Литературный обзор). При расчете структуры белка используют методы поиска минимума энергии, основанные на молекулярной динамике и алгоритме «моделированного отжига». При этом, как правило, для расчета используют силовые поля, не учитывающие потенциал электростатических взаимодействий, поскольку их корректный учет возможет только в водном окружении, а энергия электростатических взаимодействий может приводить к нестабильности системы в процессе молекулярной динамики при высоких температурах. Сложнее обстоит дело с определением структуры небольших, конформационно подвижных пептидов. В этом случае число экспериментально определенных ограничений на межатомные расстояния и диэдральные углы сравнительно невелико, и для получения надежных структурных данных в расчете необходимо учитывать электростатические взаимодействия между заряженными группами пептида.
В арсенале экспериментаторов имеется ряд программных пакетов для расчета структур биомолекул по данным ЯМР. Программные пакеты CNS и X-PLOR широко используются для расчета структур без использования потенциала электростатических взаимодействий. Модификация программы CNS с модулем ARIA [192] для автоматического отнесения сигналов ядерного эффекта Оверхаузера (ЯОЭ) предполагает совместное использование двух методов: расчет структуры биомолекулы в вакууме с помощью стандартного протокола CNS и последующая оптимизация полученных структур с помощью расчета короткой траектории в водном окружении, что предполагает использование потенциала электростатических взаимодействий. В этом случае используется модель, так называемого, тонкого слоя растворителя. Стабильность траектории при введении зарядов в молекулу обеспечивается за счет низкой температуры молекулярной динамики и использовании структуры биомолекулы, уже сформированной в первом приближении в процессе моделированного отжига в вакууме.
Программа CYANA позволяет проводить расчет структуры белка в вакууме и только во внутренних координатах (пространстве торсионных углов). Другой программный пакет ICMD, использует силовое поле AMBER [193] и также работает в пространстве торсионных углов в вакууме, однако включает модельный потенциал зарядовых взаимодействий с первого этапа расчета. При этом проблема, связанная с нестабильностью траектории при введении такого потенциала решается путем масштабирования весов экспериментальных ограничений ЯМР в течение высокотемпературной стадии МД.
В последнее время все чаще потенциал Кулоновских взаимодействий и водное окружение вводятся в расчет структуры белка на завершающей стадии, после того как закончен алгоритм моделированного отжига. Однако, отсутствуют алгоритмы, позволяющие проводить весь процесс расчета биомолекулы в декартовых координатах в водном окружении с представлением молекул воды в явном виде. Такой алгоритм мог бы дать наиболее реалистичные результаты, хотя он и требует значительных вычислительных затрат. Для реализации этого алгоритма перспективным представляется использование программного пакета GROMACS, имеющего открытый код. В настоящей работе проведена модификация этой программы и разработан алгоритм, позволяющий проводить расчет структуры небольших пептидов в водном окружении в декартовых координатах с использованием потенциала электростатических взаимодействий с первых этапов расчета. Протокол расчета протестирован на модельном пептиде с известной структурой и использован для расчета структур исследуемых пептидов. Все вычисления проводились с использованием силового поля AMBER-03 [194].
Расчеты выполнялись на суперкомпьютерах СКИФ МГУ «Чебышев» и «Ломоносов» [195] и 64-битных двухпроцессорных станциях (Opteron), работающих под управлением операционной системы Linux.
В качестве стартовых координат во всех расчетах использовали вытянутые цепочки пептидов (extended chain) сгенерированные программой CNS. Перед началом расчетов траекторий МД с помощью инструментария программного пакета GROMACS подготавливали начальную систему следующим образом:
Конвертировали исходный файл (pdb), содержащий координаты атомов пептида в рабочий файл топологии GROMACS (top), содержащий информацию обо всех взаимодействиях в молекуле пептида (программа pdb2gmx). - Генерировали кубическую ячейку вокруг исходной молекулы (программа genbox). - Заполнили ячейку, содержащую пептид, молекулами воды модели SPC/E [196] (программа editconj). - Далее нейтрализовали общий заряд системы путем замены части молекул растворителя на необходимое количество ионов (программа geniori).
После помещения молекулы пептида в ячейку с водой и ионами система пребывает в энергетически невыгодном состоянии. Поэтому проводили минимизацию энергии полученной молекулярной системы в два этапа. На первом этапе проводили минимизацию энергии по алгоритму наискорейшего спуска до достижения сходимости. Далее рассчитывали короткую траекторию МД (длительностью 20 пс) с ограниченными позициями всех атомов пептида (position restrained). Эта процедура помогает убрать запрещенные контакты в белке, молекулы воды при этом равномерно распределяются по системе.
Подготовленную таким образом систему использовали в качестве начальной при расчете структур методом «моделированного отжига» (см. раздел П.4.5) с наложением ограничений на межъядерные расстояния и диэдральные углы, полученные из ЯМР экспериментов.
Пакет программ GROMACS обычно используют для расчета длинных траекторий динамики белков. Нам не известно описания протокола для расчета структур белков с использованием метода моделированного отжига (simulated annealing) на основе данных экспериментов ЯМР. Для отладки такого протокола использовали небольшой модельный пептид, структура которого была ранее решена методом ЯМР в растворе (код структуры в банке белковых структур PDB ID91L, рис. 28) [197].
Отнесение сигналов и получение ограничений
Существуют две возможные ориентации цепей димера - параллельная и антипараллельная. Установлено, что только параллельная ориентация соответствует экспериментально полученным ограничениям ЯМР (рис. 40, А). При расчете структуры с антипараллельной ориентацией цепей обнаруживается гораздо большее количество нарушений ограничений ЯМР (рис. 45). Кроме того, при антипараллельной ориентации в спектрах NOESY должны были бы наблюдаться эффекты Оверхаузера, соответствующие межцепочечным контактам, однако таких сигналов обнаружено не было. На рис. 44 А представлено семейство из 20 структур димера RatAP(l-16) /Zn . СКО координат тяжелых атомов основной цепи (С, Са, N и О) димера составляет 1.46±0.48 А, а при суперпозировонии каждой цепи по отдельности СКО составляет 1.13±0.59 А (цепь А) и 1.06±0.27 А (цепь В). Рассчитанное семейство было депонировано в базу данных белковых структур (PDB), идентификационный код 2LI9. Результаты отнесения сигналов в спектрах ЯМР депонированы в Biological Magnetic Resonance Bank, идентификационный номер 17884. Репрезентативная структура семейства была дополнительно минимизирована КМ/ММ методом для уточнения координат окружения иона цинка (рис. 44 В). Рисунок 44. Структура димера А(3(1-16) крысы/Zn в растворе (20 ЯМР депонированных в банке данных PDB, код 2LI9). Показаны только атомы основной цепи (Са, С and N) и боковых цепей остатков гистидина. Цепи А и В димера окрашены в красный и синий цвет соответственно. Отмечены N и С концы цепей. А. Семейство из 20-ти ЯМР структур. В. Координация иона цинка в репрезентативной структуре после дополнительной КМ/ММ оптимизации геометрии. Среднее расстояние между атомами азота остатков гистидина(К51 и Ne2) и ионом цинка 2.07 ± 0.05 А.
Как уже отмечалось, пептидные цепи димера RatAP(l-16) /Zn уложены параллельно, при этом N-терминальные участки расположены близко друг к другу, а С-терминальные участки направлены в противоположные стороны относительно друг друга. Следует заметить, что в координации иона цинка участвует только остатки гистидина, хотя пептид содержит несколько других остатков способных хелатировать ион цинка (Asp, Glu). Это отличает пептид АР(1-16) крысы от его человеческого аналога, где координационную сферу иона цинка образуют остатки His-6, Glu-11, His-13 и His-14 [22].
Уширение сигналов ЯМР при добавлении ионов цинка (рис. 39) указывает на наличие минорных форм пептида со структурой отличной от конформера с наибольшей населенностью. При изучении ансамбля конформеров, каждый из них вносит вклад в параметры ЯМР и ИКТ с весом, пропорциональным населенности. В этой связи следует отметить, что измеренная стехиометрия взаимодействия RatAP(l-16) с ионами цинка составило 0.6±0.06 что несколько выше ожидаемого для димера значения (0.5). Это может указывать на наличие небольшой популяции конформера, находящегося в мономерном состоянии.
Согласно литературным данным, образованию нерастворимых фибрилл предшествует взаимодействие металлсвязывающих доменов Ар. Это взаимодействие индуцирует благоприятное взаимное расположение гидрофобных участков (17-42), после чего становится возможным их агрегирование [204, 205]. Можно предположить, что противоположная ориентация С-концов в димере АР(1-16) крысы препятствует сборке димеров в олигомеры (рис. 46), поскольку участки 17-42 соседних цепей не могут быть сближены. С другой стороны конформация АР(1-16) человека благоприятна для олигомеризации с образованием упорядоченных фибриллярных агрегатов [204]. EVHH фрагмент Ар человека (остатки 11-14) является основным цинк-связывающим участком пептида [56]. Этот участок содержит три аминокислотных остатка способных хелатировать ион цинка в отличие от аналогичного участка Ар крысы (EVRH), который содержит только два таких остатка. Было высказано предположение что эта дополнительная хелатирующая группа (His 13) в Ар человека может быть ответственна за взаимодействие мономеров друг с другом [206]. В результате отсутствия этого аминокислотного остатка в Ар крысы энергетически выгодная координация иона цинка достигается только при образовании димера, что препятствует дальнейшей олигомеризации полноразмерного Ар крысы. Это может являться еще одной причиной устойчивости крыс к болезни.
Металсвязывающий фрагмент английской мутантной формы Ар человека, содержащей аргинин вместо гистидина в шестом положении Ар (1-16), в растворе существует в мономерной форме. Об этом свидетельствуют узкие сигналы в спектрах ЯМР свободного пептида (рис. 47 А). Как и в случае металлсвязывающего фрагмента Ар крысы, добавление ионов Zn приводит к существенному уширению сигналов вследствие появления нескольких конформационных состояний комплекса пептида с ионами цинка и установления равновесия между ними (рис. 47 В). Следует отметить, что в отличие от АР(1-16) крысы, кроме уширения сигналов, вызванного добавлением ионов Zn , в спектрах ЯМР пептида Ар (1-16) после добавления цинка появляется двойной набор сигналов. Например, кроме сигналов при 0.75 и 0.85 м.д., соответствующих метальным группам остатка Vall2, появляется новый сигнал при 0.2 м.д., принадлежащий одной из метильных групп Vall2. Это указывает на существование двух сравнительно стабильных структурных форм пептида в растворе при добавлении ионов цинка. Существование двух резонансных положений одной и той же группы свидетельствует о медленном (в шкале времени ЯМР) обмене между этими двумя формами. Дальнейшие исследования показали, что при добавлении ионов цинка наблюдается два процесса -образование мономерного комплекса пептида с ионом цинка и дальнейшее его превращение в стабильный димер, состоящий из двух молекул пептида и одной молекулы иона цинка. При этом, две наблюдаемые формы в спектрах ЯМР соответствуют мономеру и димеру.
Изменение химических сдвигов сигналов Ар (1-16) при добавлении ионов цинка свидетельствует о существовании равновесия между свободным пептидом и комплексом. В случае быстрого обмена (в шкале времени ЯМР), соответствующего процессу образования мономерного комплекса, химические сдвиги принимают значения, усредненные между значениями химических сдвигов свободного и связанного пептида. Обмен между мономерным PZn и димерным PZnP комплексами оказывается более медленным процессом, и в этом случае в спектрах ЯМР наблюдаются отдельный набор сигналов для каждого из этих комплексов.
Существование равновесия между мономерным и димерным комплексами прямо подтверждается с помощью двумерных спектров ROESY. На этих спектрах кросс пики, возникающие в результате ЯЭО (диполь-дипольное взаимодействия ядер через пространство) имеют отрицательные значения интенсивности, а кросс-пики, возникающие в результате химического обмена, имеют положительную интенсивность. Так, например, обменные кросс пики с положительными значениями наблюдаются между сигналами Hyl Val-12 (рис. 48), сигналами Нр Val-12 (не показано на рис. 48), и многими другими сигналами.
Оптимизация протокола для программы GROMACS
Однако, при добавлении двукратного молярного избытка ионов цинка к раствору пептида в концентрации от 3 мМ и выше, при нейтральных значениях рН наблюдается выпадение белого осадка вследствие цинк-индуцируемой агрегации Ар 1S0(1-16). Такие процессы не наблюдались в случае Ар (1-16) или Rat АР(1-16). Жидкость над осадком практически не содержала растворенной формы пептида. Спектры ЯМР-Ш, измеренные после добавления ионов цинка (рис. 55В) свидетельствуют о практически полном исчезновении пептида из раствора. Даже увеличение температуры до 25С (рис. 51) не привело к появлению сигналов, принадлежащих растворенной форме пептида. Процесс агрегации Ар 1S0(1-16) при добавлении ионов цинка был исследован в диапазоне рН среды от 4 до 7. Установлено, что пептид остается в растворе лишь при значениях рН меньше 5. Осадок, выпавший при добавлении ионов цинка, растворялся лишь при понижении рН до 4-5. Повторное увеличение рН до 5.5 вновь приводило к образованию нерастворимого осадка.
Для подавления процессов агрегации пептида, были исследованы более разбавленные растворы. Так, после добавления двукратного молярного избытка ZnCb к раствору пептида в концентрации 0.75 мМ при рН=7.2 и 5С, наблюдается лишь небольшое помутнение раствора без образования осадка. В спектрах ЯМР при этом наблюдаются сигналы пептида (рис. 56В). При этом происходит существенное уширение сигналов, характерное для образования комплекса пептида с Zn , аналогичное уширению, наблюдаемому и в случаях Ар (1-16) и Rat АР(1-16). Интенсивность сигналов в измеренных спектрах оказалась значительно ниже ожидаемой. Вероятно, концентрация растворенного пептида уменьшилось вследствие агрегационных процессов. Для оценки реальной концентрации растворенного пептида был проведен сравнительный анализ полученных спектров и спектров пептидов с близкой молекулярной массой. В результате было выявлено, что концентрация растворенной доли Ар 1S0(1-16) в присутствии Zn составила приблизительно 0.2 мМ. 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 ppm
ЯМР спектроскопия является относительно низко чувствительным методом, вследствие чего концентрация образца играет крайне важную роль. Сравнительно низкая концентрация пептида не позволяет получить 2D спектры NOESY с содержанием значительного количества малоинтенсивных кросс-пиков, возникающих при взаимодействии протонов, принадлежащих аминокислотным остаткам далеко отстающим друг от друга по белковой цепи. Вследствие этого определить структуру комплекса Ар 1S0(1-16) с Zn не представляется возможным. Однако удалось получить практически полное отнесение сигналов (табл. П7).
Анализ измеренных ЯМР спектров пептида Ар 1S0(1-16) в присутствие Zn позволил установить определенное сходство со спектрами Ар (1-16) в присутствие Zn . После добавления хлорида цинка в обоих случаях наблюдается появление сигнала метильной группы остатка Vall2 при 0.2 м.д, что на 0.7 м.д. меньше химического сдвига сигнала той же группы свободного пептида (рис. 57,58). Мономер
Сравнение фрагмента 2D спектра ROESY ABH6R(1-16) (А) и фрагмента 2D спектра NOESY ABD7lS0(l-16) (В) присутствии Zn2+. Наблюдается также и удвоение сигналов остатка ThrlO, аналогичное наблюдаемому в случае Ар (1-16). Однако в отличие от Ар (1-16), где содержание димерной формы, которой принадлежат указанные сигналы, достигает 30-35%, в случае ApD7lS0(l-16) содержание димерной формы оказывается невелико (менее 5%). В значительной степени это может быть обусловлено низкой концентрацией пептида. Вместе с тем, сходство химических сдвигов наблюдаемых сигналов с сигналами димерной формы Ар (1-16) позволяет предположить, что связывание Zn с пептидом Ар 1S0(1-16) также приводит к образованию димера с конформацией схожей для этих двух пептидов. Однако, в случае Ар (1-16) других центров хелатирования ионов цинка, кроме фрагмента EVHH нет, в то время как в случае Ар 1S0(1-16) второй центр хелатирования, сформированный остатками His6 и, вероятно, isoAsp7 приводит к цинк-зависимой олигомеризации пептида.
Таким образом, при низкой концентрации Ар 1S0(1-16) межмолекулярное взаимодействие молекул пептида индуцированное связыванием ионов цинка, может останавливаться на стадии образования димера. Однако при повышении концентрации Ар 1S0(1-16) происходят процессы цинк-зависимой олигомеризации с образованием агрегатов, нерастворимых в воде. По всей видимости, константы связывания двух молекул Ар 1S0(1-16) друг с другом и молекулы Ар 1S0(1-16) с уже образованным олигомером различаются таким образом, что афинность пептида по отношению к олигомеру существенно возрастает. Именно этим может объясняться факт отсутствия в растворе сколько-нибудь заметной концентрации комплекса пептида с ионами цинка в мономерном или димерном состоянии в том случае, когда начальная концентрация пептида в растворе была достаточно высокой (больше 1-2 мМ).
Для того, чтобы представить строение возможных олигомеров Ар 1S0(1-16) в присутствии ионов цинка было проведено моделирование. При этом предполагалось, что одним центром связывания может быть фрагмент EVHH (т.е. остатки Glull и Hisl4, формирующие интерфейс димеризации пептида Ар (1-16)), а вторым центром связывния могут быть остатки His6 и карбоксильная группа изоаспартата 1S0Asp7. На рисунке 59 представлены наиболее вероятные модели цинк индуцированных олигомеров Ар 1S0(1-16). При моделировании олигомеров Ар 1S0(1-16) был использован структурный мотив комплекса Ар (1-16) с ионами цинка.
