Введение к работе
Актуальность темы исследования. Поликистозная болезнь почек (ПБП) врождённое заболевание человека, характеризующееся образованием и ростом множественных кист в обеих почках. ПБП связана с нарушением дифференцировки и пролиферации эпителиальных клеток в собирательных канальцах почек. В норме эпителий канальцев почек относится к типу медленно обновляющихся клеточных популяций, характеризующихся очень низким темпом пролиферации, и представленных долгоживущими клетками, участвующими преимущественно в реабсорбции питательных веществ во внутриканальцевые капилляры. При ПБП начинается неконтролируемая пролиферация эпителия собирательных канальцев почек, сопровождающаяся утратой клетками поляризации и нарушением дифференцировки, что неизбежно приводит к формированию кист. Молекулярный механизм таких нарушений дифференцировки и как следствие формирования кист во многом не изучен, и в настоящее время лечение ПБП остается только симптоматическим, заключающимся в коррекции проявлений болезни (Игнатова М.С. и др., 1996, Harris P. et al., 2009, Igarashi P. et al., 2002).
ПБП развивается в случаях появления инактивирующих мутаций в генах PKD1 или PKD2, кодирующих трансмембранные белки полицистин-1 и полицистин-2, соответственно. Полицистин-1 является интегральным мембранным белком, который связывается с кальциевым каналом, сформированным из шести субъединиц белка полицистина-2, образуя комплекс, контролирующий дифференцировку и пролиферацию клеток почечного эпителия в сенсорном сигнальном пути (Harwood L et al., 2004). Показано, что комплекс полицистина-1 и полицистина-2 локализуется в плазмолемме первичных ресничек (Bae Y. et al., 2006). Неподвижная первичная ресничка представляет собой выдающеюся в просвет канальца покрытую цитоплазматической мембранной органеллу. В ее основании находится базальное тело, а собственно ресничка образована девятью дуплетами периферических микротрубочек без двух центральных (в отличие от классической реснички, у которой обязательно присутствует центральный дуплет). Есть все основания полагать, что первичные реснички, находящееся на поверхности почечных эпителиальных клеток, являются механосенсорными органеллами, которые инициируют широкий спектр передачи Са2+-опосредованных регуляторных сигналов, причем в данном случае реснички «отслеживают» скорость тока мочи через канальцы и собирательные трубочки. В результате воздействия на первичную ресничку механических стимулов происходит инициация входа Са2+ в цитоплазму, что запускает каскад сигналов, регулирующих пролиферацию клеток (Nauli S. et al., 2004). При вступлении клетки в митоз происходит потеря первичной реснички благодаря тому, что базальное тело, находящееся в ее основании, учавствует в формировании центросомы (диплосомы) (Marshall W. et al., 2008). Было показано, что одним из признаков опухолевых или трансформированных клеток как раз является потеря первичной реснички. Эти и другие данные, демонстрирующие, что в первичной ресничке локализовано большое количество таких митотических белков, как семейство NEK-киназ, участвующих в регуляции митоза, позволяет предположить, что первичная ресничка играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Более того, полученные в последние годы данные указывают, что развитие ПБП часто сопровождается утратой первичной реснички почечным эпителием (Plotnikova O. et al., 2008).
Таким образом, нарушение функционирования или полная потеря первичной реснички, сопровождающаяся нарушением восприимчивости почечного эпителия к току мочи и нарушением гомеостаза Са2+, способствует расстройству регуляции клеточного цикла, что ведет к неконтролируемой пролиферации клеток и формированию кист. Хотя этапы гистогенеза кист изучены достаточно подробно, остаются неясными вопросы, связанные с механизмом нарушения контроля пролиферации и дифференцировки эпителия почечных канальцев. В настоящее время картина молекулярных механизмов, контролирующих функции дифференцированных клеток в почке постепенно проясняется. Интересно, что Aurora A (AurA) хорошо изученная как митотическая киназа, располагающаяся на полюсах веретена деления начиная с профазы и до окончания телофазы и участвующая в регуляции клеточного цикла (Bolanos-Garcia V. et al, 2005) может являться одним из ведущих белков, контролирующих пролиферацию почечного эпителия. Ген АurA картируется в областях хромосом, часто нарушаемых при опухолях (например, 20q13.2–q.13.3) и избыточно экспрессируется во многих первичных опухолях. Избыточная экспрессия или несвоевременная активация киназы AurA вызывает нарушение регуляции прохождения клетки по клеточному циклу, что сопровождается увеличением количества центросом и анеуплоидией, в отдельных случаях ведущих к трансформации клеток млекопитающих (Katayama H. еt al., 2003). Следует отметить, что одним из начальных этапов развития кист является как раз нарушение в регуляции нормальной пролиферации клеток с появлением мультицентросомных клеток с последующим изменением их структуры (Burtey S. et al., 2008), что, скорее всего, может свидетельствовать о существенной роли киназы AurA в этих процессах. Недавно было обнаружено, что киназа AurA локализована в базальном теле первичной реснички и была показана ее ключевая роль в инициации разборки и последующей потери клеткой этой структуры (Pugacheva E. et al., 2007). Выше описанная роль киназы AurA в инициации разборки первичной реснички и регуляции клеточного цикла позволяет нам рассматривать киназу AurA как новый маркер ПБП, которая, безусловно вовлечена в патогенез ПБП.
Цель исследования:
Изучение роли митотической киназы Аurora А в нарушении пролиферации клеток почечного эпителия при развитии наследственной поликистозной болезни почек человека.
Задачи исследования:
-
Продемонстрировать локализацию киназы AurA в нормальной почечной ткани и изучить возможность гиперактивации киназы AurA у больных поликистозной болезнью почек с использованием иммуногистохимических методов.
-
Выбрать модель, позволяющую изучать роль киназы AurA в регуляции полицистинов, белков, мутированных при ПБП, с применением биохимических методов, и приемлемую для дальнейших функциональных исследований.
-
Ответить на вопросы: взаимодействует ли киназа AurA с полицистином-1 и полицистином-2 и регулирует ли их активность путем фосфорилирования?
-
Оценить функциональную значимость взаимодействия AurA с полицистинами и показать роль ингибитора AurA в регуляции этих белков.
Научная новизна работы
Работа содержит новые данные о роли киназы AurA в ПБП. AurА известна как киназа, участвующая в регуляции митоза и прохождения клеткой через G2/M фазы клеточного цикла. Ранее не было известно о локализации киназы AurA в клетках почечного эпителия и, тем более, не была изучена роль этой киназы в ПБП. В данной работе впервые показано, что уровень активированной путем фофсорилирования киназы AurA повышен в эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП в отличие от интактного эпителия. Выявлен механизм участия киназы AurA в нарушении регуляции пролиферации почечного эпителия, что является одной из первичных причин формирования кист при ПБП.
В данном исследовании было обнаружено, что AurA может рассматриваться как один из ключевых белков, вовлеченных в патогенез ПБП, ингибирование этой киназы может являться потенциальным и эффективным терапевтическим подходом в лечении ПБП.
Практическая значимость диссертации
При отсутствии терапевтических средств для лечения ПБП, в настоящее время активно ведется поиск и изучение белков, вовлеченных в процесс нарушения клеточной пролиферации при формировании кист у больных ПБП. В данной работе была установлена новая роль киназы AurA в развитии данной патологии и показано, что в эпителии кист уровень фосфорилирования киназы AurA повышен у больных ПБП. Также было продемонстрировано, что использование ингибиторов AurA ведет к восстановлению нарушенного гомеостаза кальция при ПБП, что может способствовать ингибированию пролиферации кистозного эпителия. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о потенциальной возможности использования ингибиторов киназы AurA в качестве терапевтических агентов в лечении ПБП.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований и ряд примененных в работе методов внедрены в учебный процесс на кафедре молекулярной биологии и биотехнологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Апробация результатов диссертационной работы
Результаты работы были представлены на международных конференциях: “13th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference” (Филадельфия, США, 2008), “Forefronts Symposium on Polycystic Kidney Disease” (Монреаль, Канада, 2008), “The American Society for Cell Biology, 48th Annual Meeting” (Сан-Франциско, США 2008), “14th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference” (Филадельфия, США, 2009), II Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз Россия 2009” (Пермь, 2009), 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «биология – наука XXI века» (Пущино, 2009), “The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting” (Сан-Диего, США 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 171 источник (6 отечественных и 165 зарубежных). Работа содержит 43 рисунка.
