Введение к работе
Актуальность проблемы. Тиреоглобулин (ТГ) - йодированный гликопротеин с молекулярной массой 660 кДа, синтезируемый клетками фолликулярного эпителия щитовидной железы (Dunn, 1970; Vali et al., 2000). Он является предшественником тиреоидных гормонов, играющих ведущую роль в регуляции развития, дифференцировки и метаболизма тканей и органов позвоночных животных (Dumont et al., 2003).
Молекулы ТГ человека и ряда млекопитающих представляют собой димеры, построенные из идентичных полипептидных цепей длиной 2760-2770 аминокислотных остатков (Malthiery, Lissitzky, 1987). В составе цепей обнаружены повторяющиеся последовательности, образующие домены трех типов. Гомология аминокислотных последовательностей ТГ животных разных видов достигает 70-80% (Caturegli et al., 1997; Ramos et al., 2002). Следствием структурного подобия является перекрестное взаимодействие антител, полученных против ТГ одного из видов животных, с ТГ других видов (Stylos, Rose, 1968; Bresler et al., 1990). Определенным участкам первичной структуры ТГ свойственна также высокая степень гомологии с другими известными белками, в том числе ацетилхолинэстеразой (АХЭ) (Takagi et al., 1991).
После синтеза полипептидных цепей ТГ молекулы претерпевают множественные посттрансляционные модификации (присоединение углеводных, сульфатных, фосфатных групп и атомов йода) и транслокации (экспорт из тиреоцитов, включение в состав коллоида, импорт в тиреоциты и трансцитоз), взаимодействуя при этом с рядом рецепторов, транспортных белков и ферментов. Участки молекулы ТГ, обеспечивающие эти взаимодействия, до сих пор не идентифицированы.
Одним из подходов к выявлению функциональных сайтов ТГ является изучение его антигенных детерминант (эпитопов) с помощью моноклональных антител (МКАТ). Главное преимущество МКАТ состоит в том, что они распознают отдельные эпитопы (участки поверхности) антигенов. Эти участки могут находиться вблизи функциональных сайтов молекулы или топографически совпадать с ними, что позволяет исследовать связи между структурой и функциями молекул и проводить детальное картирование их антигенных детерминант (Абелев, Карамова, 1996).
Панели МКАТ против ТГ человека и животных получены в нескольких лабораториях (Zanetti et al., 1983; Kodama et al., 1984; Kondo, Kondo, 1984; Sikorska et al., 1986; Chan et al., 1987;.De Baets et al., 1987; Heilig et al., 1987; Ruf et al., 1987; Bresler et al., 1990; Saboori et al., 1994; 1998; Erregragui et al., 1997). Число антител, включенных в такие панели, обычно не превышает двадцати. Все эти МКАТ созданы на основе иммунных лимфоцитов мышей линии BALB/c (H-2d), следовательно, спектр распознаваемых ими эпитопов ТГ ограничен репертуаром иммунного ответа мышей указанной линии.
В лаборатории гибридомной технологии ЦНИРРИ создана уникальная панель из 52 МКАТ против ТГ человека. Основное отличие этой панели от описанных ранее состоит в том, что донорами иммунных лимфоцитов при получении гибридом служили мыши линии SJL/J, отличающиеся от BALB/c главным локусом гистосовместимости (H-2s) и репертуаром иммунного ответа. Очевидно, полученная совокупность МКАТ распознает иной спектр антигенных детерминант ТГ и требует специального изучения.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении свойств МКАТ и исследовании природы распознаваемых ими антигенных детерминант ТГ у представителей разных таксонов позвоночных животных.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Охарактеризовать полученные МКАТ по антиген-связывающей
активности и изотипической принадлежности.
2. Изучить перекрестную реактивность МКАТ с ТГ животных разных
видов и установить, какие из эпитопов ТГ человека являются
видоспецифическими, а какие - эволюционно консервативными.
Исследовать взаимодействие МКАТ с тиреодными гормонами и АХЭ.
Исследовать эпитопную специфичность МКАТ.
Классифицировать распознаваемые МКАТ антигенные детерминанты ТГ человека по их зависимости от конформации молекулы.
Основные положения, выносимые на защиту.
Панель из 52 МКАТ позволяет выявить на молекуле ТГ человека 41 эпитоп, 15 из которых являются линейными, остальные 26 - конформационно зависимыми.
Распознаваемые МКАТ эпитопы не относятся к числу гормоногенных.
На молекуле ТГ человека, наряду с видоспецифическими эпитопами, выявлены эволюционно консервативные антигенные детерминанты, представленные также на ТГ млекопитающих, птиц и амфибий.
На молекуле ТГ человека выявлены эпитопы, общие с АХЭ, что указывает на их локализацию в С-концевой части молекулы ТГ.
Видоспецифические эпитопы ТГ человека являются конформационно зависимыми. Все линейные эпитопы молекулы ТГ человека относятся к числу эволюционно консервативных.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что на молекуле ТГ человека присутствуют более 40 антигенных детерминант, выявляемых МКАТ.
Показано, что структура и состав антигенных детерминант ТГ может различаться у близкородственных видов млекопитающих и быть сходной у животных, относящихся к разным таксономическим группам.
Впервые с помощью МКАТ исследованы антигенные детерминанты молекул ТГ птиц и амфибий; показано, что состав эпитопов ТГ амфибий существенно отличается от такового у млекопитающих.
Впервые для анализа эпитопной специфичности МКАТ против ТГ применен сравнительно-биологический подход, основанный на сопоставлении групп взаимного ингибирования МКАТ и спектров эпитопов ТГ животных разных видов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявление линейных эпитопов молекулы ТГ позволяет в дальнейшем идентифицировать образующие их последовательности аминокислотных остатков и, таким образом, картировать ряд антигенных детерминант ТГ человека и животных.
Данные о топографической удаленности эпитопов ТГ являются основанием для отбора МКАТ при конструировании двухдетерминантных систем детекции и количественного определения ТГ человека и животных.
Найдены оптимальные условия для выявления ТГ на препаратах ткани щитовидной железы иммуногистохимическими методами.
МКАТ, распознающие эпитопы ТГ животных, могут использоваться в экспериментальных и сравнительно-биологических исследованиях развития, структуры и функции щитовидной железы млекопитающих, птиц и амфибий.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на XII
Международном Совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург,
2001), Пироговской студенческой научной конференции-2002 (Москва, 2002),
VI, VII, IX и X Всероссийских научных форумах с международным участием
"Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002, 2003, 2005,
2006), Международной научно-практической школе-конференции "Цитокины.
Воспаление. Иммунитет" (Санкт-Петербург, 2002), 6-ой (Пущино, 2002) и 7-ой
(Москва, 2005) Школах Джона Хамфри по иммунологии, 5-ом Конгрессе
"Современные проблемы аллергологии, иммунологии и
иммунофармакологии" (Москва, 2002), научно-практической конференции "Современные технологии в клинической медицине" (Санкт-Петербург, 2003), 1-ом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), III Съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004) и Школе DAAD "Current Trends in Comparative Immunology. The Interface Between Immunology and Medicine" (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работы состоит из введения; обзора литературы; экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования; обсуждения; выводов; списка литературы, состоящего из 303 источников; приложения. Работа изложена на 142 страницах и содержит 23 рисунка и 19 таблиц.
