Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Гликолипиды и гликоконъюгаты как маркеры опухолей человека. Ганглиозид FucGM 1 11
Глава 2. Роль ганглиозидов в межклеточных взаимодействиях 27
2.1. Гликосинапс первого типа 28
2.2 Гликосинапс второго типа 31
2.3 Гликосинапс третьего типа 32
Глава 3. Моноклональные антитела для диагностики опухолей 36
3.1. Опухолеассоциированные антигены в сыворотке 39
3.2. Локализация опухолей и метастазов 42
3.3 Патогистологическая диагностика опухолей 46
3.4. Иммунотерапия опухолей 51
Глава 4. Материалы и методы 55
4.1. Культивирование клеток 55
4.2. Среды и реактивы 55
4.2.2.Антигены и моноспецифические антитела к ним 56
4.2.2.1. FucGM-1 и другие ганглиозиды 56
4.2.2.2. Очистка моноклональных антител 58
4.3. Процедура иммуноферментного анализа (ИФА) 58
4.3.1. Непрямой ИФА 58
4.3.2. Процедура прямого ИФА 61
4.3.3. Процедура "сэндвич" ИФА 61
4.4. Определение константы связывания MAT 61
4 5. Изотипирование MAT 62
4.6. Получение гибридом 63
4.7. Радиоиммунологическое выявление гликолипидного антигена на тонкослойных пластинах 65
4.8. Хромосомный анализ гибридом против FucGM 1 66
4.8.1. Использованные клеточные линии 66
4.8.2. Культивирование клеток 66
4.8.3. Сбор клеток и приготовление хромосомных препаратов 67
4.8.4. Окраска хромосомных препаратов 68
4.9. Иммуноморфологические исследования 68
4.10. Статистическая обработка результатов 69
Глава 5. Получение и исследование МАТ против ганглиозида FucGMl 69
5.1. Тестирование иммунного ответа мышей 69
5.2. Получение гибридом 69
5.3. Тестирование моноклональных антител методом ИФА 72
5.4. Характеристика моноклональных антител 76
5.4.1. Изотипирование МАТ 76
5.4.2. Измерение концентрации МАТ 81
5.4.3. Определение специфичности МАТ против FucGM 1 85
5.5. Хромосомный анализ гибридом 91
Глава 6. Выявление FucGM-1 в сыворотке крови и тканях онкологических больных 98
6.1. Выявление FucGM-1 в опухолях легкого 98
6.1.1. Анализ ганглиозидного состава опухолей легкого 98
6.1.2. Иммунофлуоресцентное исследование опухолей и других FucGM-1 содержащих тканей 103
6.2. Исследование FucGMl в сыворотке больных раком легкого 108
6.2.1. Радиоиммунохроматографическии анализ FucGM-І в сыворотке больных мелкоклеточным раком легких 108
6.2.2. Фукозилтрансферазная активность сывороток больных мелкоклеточным раком легких 109
6.3. Разработка клеточного ИФА с МАТ против ганглиозида FucGM-1. 110
6.3.1. Антилипидные и анти-FucGM-l антитела в сыворотке больных мелкоклеточным раком легкого 112
Обсуждение 118
Выводы 132
Список литературы 134
- Локализация опухолей и метастазов
- Определение константы связывания MAT
- Тестирование моноклональных антител методом ИФА
- Хромосомный анализ гибридом
Введение к работе
Актуальность темы.
В последние годы пристальное внимание исследователей, занимающихся молекулярной диагностикой и терапией различных патологических процессов, привлекает обширный класс химических соединений - гликоконьюгатов. Эти соединения объединяет то, что их молекулы состоят из двух компонентов - углеводного и неуглеводного.
Интерес к этим веществам вызван тем, что показано их присутствие в качестве специфических антигенов в тканях и биологических жидкостях организма животных и человека при ряде заболеваний, в т.ч. онкологических (16), соматических (103). Успешные работы по созданию диагностических систем на основе моноспецифических (11,12,13,36) и моноклональных (126,127,181) антител к гликоконьюгатам и использованию таких антител в клинической практике (26) показали перспективность этого направления исследований.
Наше внимание привлек гликоконьюгат с мало исследованными свойствами - ганглиозид Fuc GM1, обнаруженный в ткани мелкоклеточного рака легкого (118).
Мы предположили, что создание моноклональных антител к этому антигену поможет изучить его свойства и даст возможность исследовать наличие ганглиозида FucGMl и антител к нему в тканях и биологических жидкостях больных мелкоклеточным раком легкого. Цель и Задачи исследований.
Целью исследования являлось иммунохроматографическое и иммунохимическое изучение экспрессии маркерного антигена мелкоклеточного рака легких путем получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к ганглиозиду FucGMl, изучение свойств этих гибридом и продуцируемых ими антител. В связи с этим были определены задачи исследования:
1.Получение гибридом, продуцирующих МАТ к ганглиозиду FucGMl.
2. Цитогенетическая характеристика гибридом и определение свойств моноклональных антител .
3. Разработка на основе полученных моноклональных антител тест-систем для иммунодетекции ганглиозида FucGMl в тканях и биологических жидкостях. Оценка перспективы их применения в клинико-лабораторных исследованиях.
Научная новизна работы.
Впервые получены МАТ к ганглиозиду FucGMl. С их помощью показано наличие FucGMl в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легкого.
Впервые показано наличие антител против FucGMl в сыворотке крови онкологических больных.
Разработана ИФА тест-система для определения AT к FucGMl в сыворотке крови.
Разработана модельная система клеточного ИФА для выявления ганглиозидов и, в частности, FucGMl. Разработан метод иммунофлуоресцентного окрашивания тканей для выявления FucGMl. Показана экспрессия FucGMl з ткани мелкоклеточного рака легкого человека.
Изучен хромосомный состав полученных гибридом. Показана связь сегрегации хромосом с изменением активности продукции моноклональных антител.
Теоретическая и практическая ценность проведенного исследования.
Принципиальное значение имеет обнаруженный факт наличия ганглиозида FucGMl в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легкого. Теоретическая ценность этого наблюдения состоит в том, что до сих пор неизвестны специфические маркеры мелкоклеточного рака легкого в сыворотке крови.
Новым фактом является обнаружение антител к антигенам, содержащим терминальную фукозу, в сыворотке крови 8 5 обследованных онкологических пациентов. Это указывает на связь злокачественной трансформации с аномальным фукозилированием, что в свою очередь может быть обусловлено изменением активности (возможно связанной с мутациями) специфических фукозилтрансфераз.
Практическая ценность работы заключается в получении МАТ против FucGMl, которые могут служить инструментом для создания серологических и иммуноморфологических диагностикумов для выявления мелкоклеточного рака легкого. Разработанный метод идентификации гибридом может быть применен для их паспортизации.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на: Всесоюзном симпозиуме "Клеточные основы противоопухолевого иммунитета. Гибридомы", Москва 1985 ; конференции « Актуальные вопросы современной гистопатологии» Москва, 2004; Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987; Всесоюзной научной конференции «Актуальные вопросы биотехнологии», Ленинград 1987; конференции « Актуальные вопросы современной гистопатологии», Москва, 1988; XVIIIth Meeting of ISOBM, Abstr., Moskow, 1990; Расширенном заседании Ученого совета НИИ МЧ РАМН, 2004 г.
Публикации.
Основные положения диссертации изложены в 12 печатных работах.
Структура диссертации.
Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (3 главы), материал и методы (1 глава), результаты собственных исследований (2 главы), обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Диссертация написана на русском языке, на 156 страницах машинописного текста и иллюстрирована 31 рисунком и 5 таблицами. Указатель литературы содержит 190 источников, из них 10 отечественных и 180 иностранных.
Локализация опухолей и метастазов
В последние годы достигнуты определенные успехи в иммунодетекции опухолей и их метастазов с помощью моноклональных антител, в частности, конъюгированных с радиоизотопами. S.P.Larsson at al., 125 131 используя меченные I и I мышиные моноклональные антитела и их фрагменты, получили четкое изображение крупного метастаза меланомы в печень у 57-летней больной. Антигеном, выявляемым моноклональными антителами, является белок клеточной поверхности р97. У 52-летнего больного меланомои через 48 часов после введения 90 мКи моноклональных атител к р97 был обнаружен метастаз в легкое (69). G.L.Buraggi et al. использовали для определения локализации меланомы и и ее метастазов у 8 больных моноклональные антитела к высокомолекулярному антигену меланом 131 и их Fab фрагменты, меченные I. Для иммуносцинтиграфии оказались предпочтительнее Fab фрагменты,поскольку их применение значительно уменьшало неспецифический радиоактивный фон костного мозга, печени и селезенки (24). ні Меченные In Fab фрагменты мышиных моноклональных антител HMPG-1, реагирующие с различными опухолями эпителиального происхождения, были использованы для иммуносцинтиграфии 14 больных с первичным и метастазирующим немелкоклеточным раком легкого. Количество вводимых моноклональных антител составляло 150-250 мкг, специфическая активность- 5 мКи/мг. Оптимальное время получения изображения - 48-72 часа после введения антител. Четкая локализация первичной опухоли и большинства (80%) метастазов была получена у всех больных. Спустя четыре месяца после инъекции моноклональных антител не отмечалось появления противомышиных антител ни у одного пациента. Неожиданным результатом, сообщенным авторами, явилось то, что в трех случаях из семи радиоизотопная локализация опухоли была достигнута при использовании неспецифических моноклональных антител.
В связи с этим возникает вопрос, лежит ли в основе радиоиммунодетекции опухолей человека специфическое взаимодействие антиген-антитело или она обусловлена неспецифическим накоплением иммуноглобулинов в опухоли. В клинической практике используются радиомеченные моноклональные антитела к РЭА и СА 19-9 для локализации опухолей желудочно - кишечного тракта (39), моноклональные антитела к плацентарной щелочной фосфатазе для детекции опухолей семенника,яичника, шейки матки (36), моноклональные антитела Т 101 для выявления Т-клеточной лимфомы (138) и другие (39). Возможность применения радиомеченных моноклональных антител ограничена рядом трудностей. Одной из наиболее серьезных является накопление изотопа в печени, даже в случае отсутствия в ней опухолевых метастазов. По данным разных авторов поглощение ні печенью меченных In моноклональных антител составляет от 20% до 60 % введенной метки (167). Предполагается ряд механизмов, объясняющих преимущественное накопление метки в in печени - присоединение In к трансферрину за счет трансхелатирования, связывание углеводных цепей антител лектинами печени, присоединение Fc - фрагментов цельных антител к рецепторам гепатоцитов.
Другим ограничением является недостаточное поглощение меченых моноклональных антител опухолью. A.A.Epenetos et al. исследовали накопление метки в опухолях яичника, молочной железы, желудочно-кишечного тракта, удаленных спустя 1-29 дней после внутривенного введения больным I -моноклональных антител к РЭА и СА 19-9. Несмотря на высокий индекс локализации (максимальное соотношение опухоль:кровь = 35.8:1), абсолютное количество радиоактивности в опухоли было небольшим - около 0.035 введенной метки на 1 грамм ткани опухоли. Метастазы в лимфоузлы включали больше метки, чем первичные опухоли. Нормальные лимфоузлы также накапливали относительно высокую радиоактивную метку. Авторы пришли к выводу о невозможности использования исследованных ими моноклональных антител (HMFG2, AuAl, Н317) в клинической практике. Гетерогенность опухолей может обусловливать ложно отрицательные результаты при иммуносцинтиграфии из-за отсутствия или низкой экспрессии антигена, выявляемого меченным моноклональным антителом. Так, в работе J.Y.Douil lard et al., посвященной установлению корреляции между степенью экспрессии опухолеассоциированных антигенов и поглощением опухолью меченных 131 I моноклональных антител РЭА и СА 19-9, было показано отсутствие маркерного антигена СА 19-9 в опухоли толстой кишки у одного из семи исследованных больных. Поэтому опухоль не выявлялась антителами к СА 19-9, но включала антитела к РЭА. Авторы рекомендуют использование "коктейлей" моноклональных антител к разным антигенным детерминантам одной опухоли для решения проблемы ложно-негативных данных. Немеченные моноклональные антитела могут быть использованы для выявления микрометастазов опухоли в костный мозг.
Применение моноклональных антител значительно повышает надежность диагностики, поскольку при обычных цитологических исследованиях ранние микрометастазы опухолей в костный мозг выяыляются менее чем у 1 % больных. Так, моноклональные антитела 12 6 против ганглиозида GD2 нейробластомы человека позволили обнаружить 1 опухолевую клетку на 10000 нормальных клеток костного мозга. С помощью МОС-1 моноклональных антител был проведен скрининг больных в стадии ремиссии, у всех 11 больных микрометастазы отсутствовали. Моноклональные антитела МОС-1 против мелкоклеточного рака легкого показали наличие метастазов в костный мозг у всех 11 исследованных
Определение константы связывания MAT
Прямой ИФА проводили аналогично непрямому ИФА.. Отличие состоит в том, что после второй отмывки (рис.6) следует нанесение КГ и далее реакции проходят идентичные стадии. Первой стадией "сэндвич" ИФА являлось нанесение антител (моноспецифических или моноклональных) в 50мМ карбонатном буфере рН 9,6. Затем следовали отмывка (рис.8.), внесение антигена, вторая отмывка, внесение коньюгата антител (в случае МАТ к другому эпитопу АГ) с пероксидазой хрена. Дальнейшую отмывку и окраску плашки проводили аналогично прямому и непрямому ИФА. константы связывания МАТ проводили по методу Стивенсона, предполагая, что связывание МАТ с АГ - это одноэтапная бимолекулярная реакция. KI, К2 - скорость прямой и обратной реакции соответственно. [МАТ] - начальная концентрация МАТ [АГ] - начальная концентрация МАТ антигена [МАТ х АГ] = [X] - концентрация комплекса р - валентность антител -і -і К=К1 х К2 - константа связывания [К]= М -і -і При равновесии имеем: [К] = [Х] х [рМАТ - х] х [АГ - X] Плашки сенсибилизировали в оптимальной концентрации [АГ1] и в концентрации ниже оптимальной и на них раститровывали МАТ.
Плашки оставляли на ночь при 4С для установления динамического равновесия между АГ, AT и комплексом АГ-АТ. После инкубации проявлями реакцию как описано в 4.3. и получали две кривые (рис.9а.) По ним определяли [МАТІ] и [МАТ2] как концентрацию МАТ при которой половина АГ связана с AT. В этом случае [АГ - Х]= [X] -і -і m = АГ1 х АГ2 = XI х Х2 А1 и А2 - оптические плотности при 100% связывании антигена в концентрации АГ1 и АГ2 соответственно. Изотипирование МАТ проводили методом 4-слойного непрямого твердофазного ИФА (рис. 13) В лунки 96-ти луночных полистироловых плашек вносили смесь FucGMl с лецитином и холестерином, затем производили забивку и отмывку как описано в 4.3. В лунки наносили супернатант исследуемых гибридом, инкубировали 1 час при 37С на шейкере и отмывали как описано в 4.3. Затем наслаивали в дубликатах моноспецифические кроличьи антитела против классов и субклассов иммуноглобулинов мыши (Miles, Великобритания), разведенных 1/100 в отмывочном буфере, и после отмывки, коньюгат козьих AT к АГ кролика (институт иммунологии МЗ СССР), разведенных 1/100 в отмывочном буфере. Далее отмывку, окраску, остановку и учет реакции проводили, как описано в 4.3. Иммунизация. Гибридомы, продуцирующие специфические МАТ против FucGMl получали по модифицированному методу Келлера и Мильштейна (85). Мышей линии Balb/c иммунизировали чистым препаратом FucGMl, выделенным из мозга свиньи и сорбированым на убитых нагреванием клетках Salmonella mynesota. Высокоочищенный препарат FucGMl для иммунизации был любезно предоставлен Н.Ф.Авровой (Институт экспериментальной физиологии им. Сеченова, Санкт-Петербург). Для получения иммунного ответа самкам BALB/c вводили внутривенно конъюгат FucGMl с убитыми клетками Salmonella Mynnesota, полученный 20-ти минутной инкубацией 1мл суспензии бактерий с 10мкг/мл раствора FucGMl в Н2О, . Ex temporo приготовленную суспензию конъюгата в PBS вводили мышам по схеме, представленной на рис.9. Суммарное количество ганглиозида на весь цикл иммунизации составило 11 мкг на мышь. После окончания цикла иммунизации мышей наркотизировали эфиром и забивали методом цервикальной дислокации.
Сразу после забоя извлекали в стерильных условиях селезенку и получали спленоциты, продавливая ткань органа сквозь капроновое ситечко. Гибридизацию проводили по модифицированному Фазекасом (2) методу Келлера и Милыптейна (85). Спленоциты сливали с клетками сингенной несекретирующей миеломы РЗ-ХбЗ-Ад 8.653 в отношении 3:1 с помощью полиэтиленгликоля 4000. Гибридомы выращивали в 96-ти луночных плоскодонных полистироловых платах на фидерном слое сингенных перитонеальных макрофагов в селективной среде HAT. В получении гибридом принимали участие сотрудники Лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ МЧ РАМН РФ к.б.н. М.Н.Болтовская и к.м.н. Н.А.Старосветская. на тонкослойных пластинках методом иммунорадиографии с использованием МАТ проводили, как было описано в работах Маньяни и Фредман с соавторами(22). На тонкослойные пластины высокого разрешения из силикагеля 60 HL,TL, Fertigplatten, Kieselgel-60, Мегк,ФРГ) наносили смесь выделеных моносиалоганглиозидов, а также ди- и полисиалоганглиозидов в количестве 0,15 - 3,0 нмоля НейАц в одну точку. Одновременно на пластинки наносили стандартную смесь ганглиозидов FucGMl, GM1, GM2, GM3, GDla, GDIB, GTIB, CQIB. Ганглиозиды, нанесенные на пластинки, разделяли в системе растворителей хлороформ-метанол-0,25%КС1 (50: 40: 10: по обьему) или хлороформ-метанол-2,5М водный аммиак (50:40:10: по обьему). После разделения ганглиозидов пластинки высушивали и отрезали часть хроматограммы со стандартной смесью ганглиозидов, которую затем проявляли в реактиве
Эрлиха. Ту часть хроматограммы, которая предназначалась для радиоиммунологического выявления антигена пропитывали 0,1% раствором полиизобутилметакрилата в гексане, высушивали, а затем пропитывали трис-HCl, рН 7,8, содержащим 1% раствор сывороточного альбумина и 0,85% NaCl в течение одного часа при комнатной температуре. Затем на пластинку наносили МАТ против FucGMl, инкубировали 3 часа при 4 С и трижды отмывали в PBS. После отмывки пластинки покрывали I 125 - меченными кроличьими AT против Ig мыши. После инкубации в течение 20-ти часов при 4С хроматограммы трижды промывали холодным PBS, высушивали и экспонировали с отечественной рентгеновской пленкой 5-7 суток. Пленку проявляли согласно инструкции для данного типа пленок. 4.8 Хромосомный анализ гибридом против FucGMl 1. Х63-Ад8.653 - миелома;эта линия является 8-азагуанин неустойчивой подлинией плазмацитомы МОРС-21 ( индуцированной у мышей BAIB путем иньекции минерального масла) . 2.Б5-гибридома (ХбЗ-Ад8.653 х лимфоцит от мышей, иммунизированных ганглиозидом FucGMl). 3 F10- гибридома (ХбЗ-Ag 8.653. х лимфоцит от мышей, иммунизированных гинглиозидом FucGMl. 4. В4 - гибридома (Х63-Ад 8.653 х лимфоцит от мышей, иммунизированных ганглиозидом FucGMl). 4.8.2 Культивирование клеток. Клетки культивировали как описано в 4.1 в среде 65
Тестирование моноклональных антител методом ИФА
Этот способ был использован нами в качестве метода тестирования гибридом и исследования МАТ. Его высокая чувствительность, стабильность и низкие фоновые значения можно объяснить образованием лецитином и холестерином липидной пленки, которая заякоривает молекулу ганглиозида на поверхности плат за счет гидрофобной связи с церамидной частью молекулы. Гидрофильная углеводная часть ганглиозида,- на которой располагаются сайты связывания МАТ, выступает из липидного слоя подобно тому, как это происходит в нативных клеточных мембранах. Экспрессия углеводной части ганглиозида, таким образом, имитирует его экспрессию in vivo, что важно для отбора антител, могущих быть использованными для клинических целей. Заякоренный в липидной пленке ганглиозид не отмывается в процессе постановки анализа даже при использовании детергента, что повышает чувствительность реакции, экономит АГ и уменьшает разброс в параллелях.
Постановка метода непрямого твердофазного ИФА описана в главе "Материалы и методы". Коротко: в лунку полистироловой или полихлорвиниловой платы вносили раствор 30 нг ганглиозида, совместно с 50 нг лецитина и 30 нг холестерина в этаноле. Спирт выпаривали под приточной вентиляцией.Места неспецифической сорбции белка на плате блокировали инкубацией с 1% BSA на PBS. Супернатант испытуемой гибридомы вносили в 2 лунки - одну с ганглиозидом, а другую лишь с лецитиново-холестериновой пленкой для исключения неспецифических клонов. После инкубации с супернатантами клонов и отмывки буфером (ОБ) , содержащим BSA и детергент Tween 20, платы инкубировали с раствором антивидового (антимышиного) кг кроличьих AT с пероксидазой хрена. Повторяли процедуру отмывки и добавляли в лунки раствор субстрата - Н2О2 и хромогена - ОПД. После окончания процедуры реакцию фиксировали H2SO4 и учитывали на 96-луночном ридере Multiscan. Клоны, значение оптической плотности которых превышало фоновое не меньше, чем в 4 раза считали позитивными, тестировали повторно и клонировали. Титр МАТ в культуральных супернатантах достигал 1/625 (рис.12). Чувствительность ИФА с полученными клонами составила 0,2 нг\мл (рис.13), что указывает на их высокую аффинность. 5.4. Исследование моноклональных антител. описано в материалах и методах. Был использован четырехслойный непрямой твердофазный ИФА(рис.14). Результаты изотипирования приведены в таблице 2. Все четыре исследованных клона принадлежат к классу IgG3
Схема непрямого четырехслойного ИФА для изотипирования МАТ отмывкг отмывка отмывка отмывка «w окраска і РІ - лецитин -холестериновая пленка s FucGMl - исследуемое MAT - кроличьи AT против МЫШИННЫХ ИЗОТИПОБ - коньюгат козьих AT против Ig кролика с пероксидазой хрена і развившаяся окраска Таблица №2 Изотипирование гибридом против ганглиозида FucGMl в иммуноферментном анализе МАТ IgA IgGIa IgGIb lgG2 lgG3 lgG4 igM D5 - - : - - + - В4 - - - - + - F10 - - : - - + - D12 - - . - - + - гибридом, неочищенных и полуочищенных асцитах проводили в помощью ингибиционного твердофазного ИФА. Для этого сначала проводили прямой твердофазный ИФА, как описано для белковых АГ. Первым слоем наносили Ig мыши в концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере. Затем раститровывали второй слой, в качестве которого использовали КГ AT против Ig мыши с ПХ. Из полученной кривой (рис.15) видно,что использовали разведение Кг, соответствующее середине кривой . Калибровочная кривая ингибиции была получена следующим образом. Ig наносили на плату в концентрации 1 мкг/мл. После часовой инкубации их отмывали, проводили забивку и вновь отмывали(плата А). Параллельно в другой плате, предварительно забитой BSA , Кг против ИГ мыши в разведении, отраженном на кривой (рис.14), инкубировали с серийными разведениями Ig мыши заранее известной концентрации и исследуемыми образцами (супернатанты или асциты) в течение часа (плата В) . После инкубации инкубационную смесь переносили из платы В в плату А и инкубировали еще 1 час. После отмывки производили окрашивание и учет результатов как описано в 4.3.4. Типичная калибровочная кривая,полученная таким способом, представлена на рис.16. На рисунке представлены данные измерения концентрации МАТ асцитной жидкости клона В4. Жидкость разводили в 10 раз, при этом, как видно из рис.16, оптическая
Хромосомный анализ гибридом
Резко возросшее количество стационарных гибридных линий соматических клеток ставит проблему их идентификации. В связи с этим проводили кариологическое изучение трех перевиваемых линий гибридных клеток и сравнение их с родительской линией миеломных клеток при помощи G-метода окраски хромосом как описано в главе "Материалы и методы". Типичные метафазные пластинки для исследованных линий приведены на рис.19. В ходе исследования хромосомных наборов мышиной миеломы Х-бЗ-Ад8.653 (рис.19-1) мы обнаружили редукцию значительной части хромосом с 58 до 40 (т.е. на 16% ) со времени получения и описания этой линии Кэрнеем и др. в 1970 г. Это свидетельствует о том, что несмотря на длительное пассирование и неоднократное реклонирование стабилизации хромосомных наборов миеломы Х-63-Ад8.653 не произошло. Анализ гистограммы распределения клеток по числу хромосом в метафазных пластинках этой линии выявляет соответствие закону нормального распределения (рис. 20) .Это дает нам право предположить достаточную гомогенность популяции этих клеток, и, возможно, свидетельствует о начале стабилизации хромосомных наборов миеломы ХбЗ-Ад8.653.
Анализ кариотипов трех гибридом В4, D5, F10 (рис. 19-2, 19-3, 19-4) проводили на 30-40 метафазных пластинках каждой гибридомы. Теоретически число хромосом в гибридомах, полученных слиянием лимфоцита мыши с клеткой мышиной миеломы X63-Ag8.653, должно было бы равняться суммарному количеству хромосом родителей, т.е. 88. Однако в результате сегрегации части хромосом гибриды приобрели специфические генотипы, отличные от обеих родительских линий. Данные о распределении клеток изученных линий представлены в виде гистограмм на рис.20(б-г). Эти данные свидетельствуют о неоднородности популяций клеток внутри каждой линии. Вариабельность числа хромосом в клетках гибридом значительно выше, чем в клетках родительской линии. Распределение клеток по числу хромосом существенно отличается от нормального, на гистограммах выделяются несколько пиков.
В линии F10 на гистограмме наблюдаются два пика. Используя критерий х 2 мы провели анализ соответствия распределения клеток по числу хромосом закону нормального распределения. Для этого выборку клеток разбивали на две группы вокруг пиков и анализировали каждую группу в отдельности, строя для нее кривую нормального распределения. Сравнивая затем гистограмму распределения всех клеток линии по числу хромосом с суммой нормальных распределенийдля отдельных групп, мы искали такое разделение на группы, при котором соответствие эмпирического закона распределения теоретическому было бы наилучшим. Такие группы мы считали субпопуляциями. Таким образом, для линии F10 нами было выделено две субпопуляции. Модальное число хромосом для первой из них лежит в интервале 62-63 хромосомы, для второй - 68 хромосом (рис.20, б). Различия между двумя субпопуляциями гибридомы F10 достоверны по критериям Стюдента и Фишера. На гистограмме распределения клеток по числу хромосом, построенной для гибридомы В4, четко выделяются три пика. Анализируя данную гистограмму аналогично гистограмме для F10, мы установили наличие трех субпопуляций с модальными числами 76-77, 80 и 85 хромосом, соответственно. Распределение клеток по числу хромосом внутри каждой субпопуляции соответствует , закону нормального распределения (см. рис.20,в). Различия между субпопуляциями статистически достоверны. Анализ данных, полученных для гибридомы D5, позволяет выделить две субпопуляции с модальными числами 80 и 85 хромосом, соответственно. Распределение клеток по числу хромосом внутри субпопуляций также подчиняется закону нормального распределения (см. рис. 20,г). Различия между субпопуляциями статистически достоверны.Частоты встречаемости маркерных хромосом в миеломе Х63-Ад 8.653 и гибридомах F10, В4 и D5, а также схемы исследованных маркерных хромосом приведены на рис.21.
