Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Строение молекул антител. Структура генов иммуноглобулинов 9
1.2 Проблемы экспрессии моноклональных антител в гетерологичных системах. Инженерия антител 13
1.3 Трансгенные растения как продуценты рекомбинантных белков 19
1.4 Внутриклеточная сортировка белков. Роль эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи в посттрансляционной модификации белков. Механизмы секреции белков 21
1.5 Получение антител в трансгенных растениях 30
1.5.1 Стратегии обеспечения экспрессии и сборки молекул полноразмерных антител в клетках растений 32
1.5.2 Экспрессия scFv - фрагментов антител в различных компартментах растительной клетки 42
1.5.3 Биотехнологические аспекты производства антител в растительных системах 49
1.6 Использование бактериальных белков барназы и барстара в
молекулярной биологии и физиологии растений 54
2 Материалы и методы 62
2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды 62
2.1.1 Условия культивирования бактерий 62
2.2 Растения 63
2.2.2 Условия культивирования растений 63
2.3Растворы, использованные в работе 64
2.4 Ферменты, использованные в работе 65
2.5 Другие растворы и буферы 66
2.6 Другие реактивы и материалы 67
2.7 Основное обрудование 68
2.8 Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК 69
2.9 Конструирование плазмид для трансформации растений 69
2.10 Введение метки в ДНК 71
2.11 Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах 71
2.12 Перенос ДНК на фильтры по Саузерну 72
2.13 Гибридизация на фильтрах по Саузерну 73
2.14 Трансформация листовых дисков табака 73
2.15 Выделение суммарной растительной ДНК 74
2.16 ПЦР-анализ трансгенных растений 75
2.17 Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола 75
2.18 РНК-ДНК гибридизация 76
2.19 Получение и анализ белковых экстрактов трансгенных растений и клеточных культур 77
2.20 Аффинная очистка scFvFllbarstar 79
2.21 Определение функциональной активности рекомбинантных антител 80
2.22 Иммунофлуоресцентная микроскопия 81
2.23 Получение суспензионной клеточной культуры 82
3. Результаты и их обсуждение 84
3.1 Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFllbarstar 84
3.1.1 Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFllbarstar под контролем двойного промотора 35SCaMV 84
3.1.2 Агробактериальная трансформация растений Nicotiana tabacum конструкциями на основе гена scFvFl lbarstar 94
3.2 Молекулярно-генетический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена scFvFl lbarstar 95
3.3 Иммунохимический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена scFvFllbarstar 99
3.4 Иммуновизуализация scFvFl lbarstar в тканях листа 104
3.5 Анализ поколения F1 растений, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFl lbarstar 106
3.6 Аффинная очистка scFvFllbarstar из трансгенных растений и определение функциональной активности очищеных антител 110
3.7 Характеристика суспензионной клеточной культуры Nicotiana tabacco-продуцента мини-антител 117
Заключение 123
Выводы 125
Список литературы
- Проблемы экспрессии моноклональных антител в гетерологичных системах. Инженерия антител
- Стратегии обеспечения экспрессии и сборки молекул полноразмерных антител в клетках растений
- Условия культивирования бактерий
- Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFllbarstar под контролем двойного промотора 35SCaMV
Введение к работе
Современные методы генетической инженерии растений позволяют экспрессировать рекомбинантные гены в клетках трансгенных растений и получать культуры, продуцирующие ценные для терапии и диагностики белки. Достижение высокого уровня продукции чужеродных белков в клетках растений зависит от многих факторов, главными из которых являются эффективность экспрессии перенесенных генов и стабильность полученного белка в клетке. Вместе с тем, работы по экспрессии таких молекул в растениях вносят существенный вклад в изучение физиологических аспектов функционирования трансгенной растительной клетки, поскольку условия получения чужеродных белков в клетках растений требуют оптимизации в каждом отдельном случае.
К настоящему времени накоплено много примеров успешного получения в клетках растений полноразмерных антител и их фрагментов (Fischer et al., 1999d). Было показано, что клетки растений способны к правильной трансляции и различным видам посттрансляционных модификаций полипептидных цепей иммуноглобулинов. Оказалось также, что использование растительных продуцентов позволяет преодолеть проблемы, возникающие при экспрессии генов антител в гетерологичных системах (гибридомных культурах и клетках прокариот). Использование эффективных генетических конструкций и систем экспрессии, а также последовательностей, обеспечивающих направление белка в различные клеточные компартменты, делают возможным достижение высокого уровня синтеза антител в растениях и позволяет решать многие задачи, такие как: защита растений от патогенов, регуляция метаболических реакций в самой растительной клетке, а также производить антитела для медицинского применения.
В качестве объекта для исследования условий экспрессии рекомбинантных антител в растительных клетках были выбраны мини-антитела к ферритину селезенки человека. Ферритин является раковоассоциированным антигеном чешуеклеточного рака головы и шеи, гепатоклеточного рака, лимфогрануломатоза и других злокачественных новообразований и представляет большую ценность для терапии и диагностики. Меченные изотопами антитела к ферритину применяются для лечения карциномы печени, а также при болезни Ходжкина (Беспалов и др., 1993). Однако использование для этих целей нативных моноклональных антител мыши ограничено из-за их иммуногенности для человека. Осуществление синтеза фрагментов антител (мини-антител), обладающих меньшей иммуногенностью, возможно в бактериальных клетках, однако это сопряжено с необходимостью проведения денатурации и ренатурации образующихся нерастворимых белковых телец включения. В этом случае использование для биосинтеза антител растительных продуцентов является оптимальным решением проблемы. Для экспрессии антител в растительных клетках были сконструированы три варианта генов слитого белка, составленного из двух доменов антиферритинового мини-антитела и бактериального белка барстара (Hartley, 1989). Введение в состав конструкций гена внутриклеточного ингибитора бактериальной рибонуклеазы барназы из Bacillus amyloliquefaciens - белка барстара дает возможность использовать двухкомпонентную систему, включающую антитело, слитое с барстаром, и меченую барназу для целей медицинской диагностики.
Целью данного исследования являлось осуществление биосинтеза в растительных продуцентах вариабельных доменов антител (мини-антител), специфичных к ферритину селезенки человека.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: получение генетических конструкций для экспрессии мини-антител к ферритину в различных компартментах растительной клетки и трансформация растений Nicotiana tabacum; изучение физиологических характеристик трансгенных растений и накопления целевого белка в клетках трансгенных растений табака, суспензионных клеточных культур и растениях первого поколения; - выделение мини-антител из растительного сырья при помощи аффинной хроматографии.
Проблемы экспрессии моноклональных антител в гетерологичных системах. Инженерия антител
В 1975 году Дж.Келлером и Ц. Мильштейном был разработан метод, позволяющий получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие гомогенную популяцию антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью (Kohler & Milstein, 1975). Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей.
Сейчас моноклональные антитела являются незаменимым инструментом в медицине, биологии и биотехнологии. Доменная структура иммуноглобулинов делает их чрезвычайно удобными для молекулярной инженерии, позволяя как создавать рекомбинантные белки как на основе фрагментов антител, так и манипулировать с полноразмеными молекулами. Источниками генов антител служат библиотеки геномных ДНК (Oi et al., 1983) и кДНК (Neuberger, 1983; Larrick et al., 1989).
На основе иммуноглобулинов получены конъюгаты с различными функциональными соединениями - токсинами, ферментами, а также с магнитными частицами, радиоактивными или рентгеноконтрастными атомами (Leung et al., 1995; Reitera & Pastan,1998) и т.п. Также находят применение антитела, обладающие каталитической активностью, так называемые абзимы (от англ. antibody и enzyme) (Bagshawe,1995). В настоящее время стало возможным осуществлять направленное воздействие на свойства самих иммуноглобулинов: изменение периода полужизни молекул, увеличение аффинности или авидности, а также осуществлять слияние генов иммуноглобулинов для получения бифункциональных молекул (Carter, 2001; Todorovska et al., 2001).
В 1983 Oi и сотрудниками было впервые показано, что лимфоидные клетки могут экспрессировать трансфицированные гены иммуноглобулинов, клонированные из других организмов (Oi et al., 1983). Это сделало возможным создание совершенно новых систем для экспрессии моноклональных антител различной специфичности (Pluckthun,1991; Manohar & Hoffman,1992; Skerra,1993). В настоящее время для получения антител, применямых для диагностики in vitro и в биотехнологии, используются быстрорастущие культуры бактериальных клеток (Skerra, 1993) и гибридомные клеточные культуры млекопитающих (Weidle et al., 1987; De Sutter et al., 1992), а также культуры дрожжевых клеток (Horwitz et al., 1988) и клеток насекомых (Hasemann & Capra, 1990).
В то же время одной из ключевых проблем в этой области остается поиск оптимальной продукционной системы для получения антител, использующихся для терапии и диагностики in situ. Производство рекомбинантного белка в бактериальных, дрожжевых и гибридомных культурах имеет в этом смысле определенные ограничения (табл.1).
Кроме того, при использовании нативных моноклональных антител мыши для диагностики и терапии возникает проблема нежелательного иммунного ответа пациента на введение этих реагентов. Применение же человеческих моноклональных антител ограничено из-за малой доступности, нестабильности гибридомных клеточных линий и низкого выхода (Деев, Поляновский, 1994).
Проблема иммуногенности мышинных моноклональных антител может быть решена путем создания "химерных" антител (у которых константная часть мышинных антител заменена константной областью иммуноглобулина человека) или "замещенных" вариантов. "Замещенные варианты" представляют собой конструкции, в которых лишь непосредственно контактирующие с антигеном участки вариабельных доменов взяты у мышиных антител, а остальные, включая каркасные участки V-доменов, человеческого происхождения. Они обладают еще более низкой, чем химерные антитела, иммуногенностью (Jones et al., 1986).
Другим перспективным подходом для решения проблем, обусловленных применением мышиных антител в организме человека, может стать использование не целой молекулы антитела, а лишь ее части, отвечающей за связывание чужеродного антигена. Такие «минимальные антитела», или Fv-фрагменты, из-за малого размера легче проникают в опухолевую ткань и также обладают пониженной иммуногенностью. Среди этой группы молекул выделяют:
Одноцепочечные антитела (single chain Ab, scFv-fragments), которые получают в результате экспрессии VH- и VL-ДОМЄНОВ, соединенных олигонуклеотидом, кодирующим гибкий гидрофильный пептид (наиболее часто (Gly4Ser)3.4) (Bird et al., 1988). Развитие технологии фаговых пептидных библиотек сделало возможным получение такого рода антител, в том числе и человеческих, практически к любому антигену (Winter et al., 1994; Vaughan et al., 1996); у-ф/?ягменты-нековалентно ассоциированные гетеродимеры VH - и VL - доменов. Они менее стабильны, чем scFv-фрагменты. Промежуточное положение между первыми и вторыми занимают конструкции, имеющие специально введенные в область контакта доменов дисульфидые связи (Glockshuber et al., 1991);
VH -домены (domain antibody, dAb) - вариабельные домены тяжелых цепей. Применение основано на часто встречающемся свойстве отдельного варибельного домена тяжелой цепи сохранять специфичность и высокое сродство (10% и выше от сродства исходного полноразмерного антитела) к антигену (Givol, 1991 ).
Стратегии обеспечения экспрессии и сборки молекул полноразмерных антител в клетках растений
Впервые принципиальная возможность продукции молекул иммуноглобулинов в растениях была показана в 1989 году коллективом американских ученых под руководством A. Hiatt. Путем агробактериальной трансформации были получены две группы растений, одна из которых экспрессировала у-, а другая - к-цепь каталитических антител 6D4 класса IgG, гены которых происходили из культуры клеток мышиной гибридомы. Путем скрещивания растений двух типов были получены растения, синтезирующие обе цепи одновременно (Hiatt et al., 1989).
В этой работе впервые было отмечено, что присутствие в составе генетической конструкции N-концевого лидерного пептида существенно влияет на содержание целевого белка в клетках растений. При использовании конструкций, содержащих нативную лидерную последовательность, уровень накопления функциональных антител составил 1,3% от общего растворимого белка (ОРБ) листьев, в то время как в растениях, трансформированных конструкциями без лидерного пептида, суммарный белковый продукт практически не обнаруживался. В то же время оказалось, что уровень специфических м-РНК в растениях обоих типов одинаков. На этом основании и был сделан вывод, что наличие лидерного пептида в генетических конструкциях подобного рода критично для осуществления правильной сборки молекул, поскольку в клетках млекопитающих полипептидные цепи молекул иммуноглобулинов синтезируются в виде предшественников и, направляемые N-концевой сигнальной последовательностью, котрансляционно переносятся в просвет ЭР, где затем осуществляется их укладка и посттрансляционная модификация (Wall et al., 1983).
Способность растительных клеток продуцировать полноразмерные антитела и осуществлять их правильную сборку была использована для экспрессии молекул антител с измененной константной частью. С-концевые домены антител класса IgG - Guy s 13, узнающих поверхностный клеточный антиген (SA I/II) Streptococcus mutans, были модифицированы путем замены Су2 и Су3 доменов на домены Са2 и Са3 молекул антител класса IgA (в комбинации Су1- Са2-Са3 или Су1-Су2-Са2-Са3). Такая замена не повлияла на специфичность или антигенсвязывающую способность химерных антител. Растения, экспрессирующие полноразмерные антитела, были получены путем перекрестного опыления линий содержащих ген легкой цепи антител, и линий содержащих различные варианты рекомбинантной тяжелой цепи. Уровень накопления антител в трансгенных растениях варьировал от 1 до 10 мг/мл растительного экстракта, направление белка в ЭР обеспечивалось наличием природных сигнальных последовательностей у каждой из белковых цепей (Ma et al., 1994).
Растения оказались способны к правильной сборке сложного секреторного комплекса антител, включающего несколько видов полипептидных цепей. J.Ma и сотрудниками (Ma et al.,1995) была достигнута одновременная экспрессия в одной растительной клетке четырех отдельных белковых цепей, формировавших функциональные димерные секреторные антитела. Для этого было получено четыре линии трансгенных растений табака, экспрессирующих к-цепь моноклонального антитела Guy s 13, гибридную тяжелую цепь, содержавшую домены иммуноглобулинов классов IgA и IgG, j-соединительную цепь секреторных мышиных антител и секреторный компонент (sc) кроличьих антител. Белковые цепи содержали природные сигнальные последовательности, обеспечивавшие их направление в просвет ЭР. Молекула рекомбинантного белка должна была представлять собой секреторную версию антитела Guy s 13 -SIgA-G. В результате серии перекрестных опылений были получены растения, в клетках листьев которых собирались функциональные димерно ассоциированные молекулы SIgA-G, синтез и сборка которых в организме млекопитающих происходит в клетках двух различных типов. Природа ассоциации j-цепи и секреторного компонента, а также антигенсвязывающая способность гибридных антител, экспрессировавшихся в растениях, были аналогичны таковым, присущим IgA млекопитающих (Ma et al.,1995).
Поскольку правильное гликозилирование полноразмерных антител является не только залогом их функциональной активности (Rademacher et al., 1986), но и основным критерием оценки возможности их применения для терапевтических целей, был проведен детальный анализ порядка гликозилирования полноразмерных антител в клетках трансгенных растений (Hein et al., 1991; Cabanes-Macheteau et al., 1999). Оба консервативных сайта, находящихся в Fab и Fc-регионах молекул антител Guy s 13 (Rademacher et al., 1986), синтезированных растениями, оказались гликозилированы, однако структура и уровень гетерогенности N-гликанов, присоединенных к тяжелым цепям молекул антител, отличались от таковых, свойственных мышиным антителам (Hein et al., 1991; Cabanes-Macheteau et al., 1999), что, правда, не явилось препятствием для применения антител этого класса для проведения пассивной иммунотерапии (Ma et al., 1998; Zeitlin et al., 1998). Однако даже минимальные различия в гликозилировании, могут являться серьезной помехой для их использования в системной иммунотерапии, так как дополнительный мотив, вносимый растительными ферментными системами в рисунок гликозилирования молекул антител и включающий а(1,3)-фукозу и 3(1,2)-ксилозу, является высокоиммуногенным для млекопитающих. Он имеет сходство с N-гликанами, присущими аллергенам, встречающимся в яде насекомых, а также в составе антигенных детерминант большого числа известных пищевых и пыльцевых аллергенов (Lerouge et al., 1998; Cabanes-Macheteau et al.,1999). Более поздние исследования, проведенные группой D.Chargelegue, которые продемонстрировали отсутствие иммунного ответа у мышей при многократной иммунизации полученными из растений IgGl (Guy s 13) с применением измененного адъюванта, открывают новые перспективы для использования этих антител в целях терапии in situ (Chargelegue et al, 2000).
Накопление полноразмерных антител в апопласте является предпочтительным, так как в водной среде межклеточного пространства протеазная активность минимальна. Дополнительным преимуществом внеклеточной локализации антител является также возможность осуществления более простой очистки рекомбинантного белка (Ма & Hein, 1996).
Как и клетки млекопитающих, клетки растений оказались способны к секреции собранных и процессированных молекул полноразмерных антител и Fab-фрагментов (Hein et al., 1991), что было показано при помощи анализа апопластных белков в целых растениях (Voss et al., 1995), иммунофлуоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии различных тканей растений (De Wilde et al., 1998; Peeters et al., 2001), а также процедуры импульсного мечения молекул антител на протопластах, изолированных из тканей трансгенных растений и трансгенных каллусных и суспензионных культурах (During et al., 1990; Hein et al.; 1991; Wahl et al., 1995; Magnuson et al.; 1996). Кроме того, была продемонстрирована возможность интеграции молекул антител в клеточную стенку (Fischer et al., 1999с).
Условия культивирования бактерий
Растения культивировали при 26C, 16-часовом фотопериоде, уровень освещения составлял 2 кЛюкс. Для регенерации побегов Nicotiana tabacum среда MS была дополнена регуляторами роста (MSD4x2): NAA - 0.1 мг/л (Serva, Germany); 6-ВАР - 1.0 мг/л (Serva) (Draper et al., 1988). Для укоренения регенерировавших побегов и для черенкования растений использовали среду MS с добавлением феруловой кислоты (Serva) до 0.1 мг/л. Для отбора трансформированных побегов использовали канамицин в концентрации 100 мг/л. Для устранения бактериальной контаминации использовали цефатоксим (клафоран) (Russel, France) в концентрации 250 мг/л.
Растворы регуляторов роста: ВАР растворяли в капле концентрированного NaOH, разводили водой и нейтрализовали соляной кислотой. 2,4 D и NAA растворяли в капле этанола и разводили водой. Стерилизовали фильтрованием через мембранные фильтры типа ВА83 или ВА85 (Schleicher&Shuell, Germany).
Для рестриктаз использовали соответствующие ферментам буферные растворы производства MBI Fermentas (Литва, Вильнюс).
Растворы антибиотиков: для селекции бактериальных штаммов и трансформированных растений использовали коммерческие препараты антибиотиков в концентрациях, указанных в табл. 4. Все водорастворимые антибитики стерилизовали фильтрованием и добавляли в среду перед употреблением. Тетрациклин растворяли в 50% этаноле, рифампицин - в метаноле. В настоящей работе использовались ферменты производства MBI Fermentas (Литва, Вильнюс): эндонуклеазы рестрикции ЕсоШ, Sail, Xba\, асП(Сгг421); Thermus aquaticus DNA Polymerase (Taq DNA полимераза); ДНК-лигаза фага T4; Также использовалась Pyrococcus woesei DNA Polymerase (Pwo DNA полимераза) (Boehringer Mannheim, Germany); РНК-аза (Calbiochem, USA). Трис-ацетатный (ТАЕ): 40 мМ Tris-ацетат, 2мМ EDTA, рН 8.0. Трис-боратный (ТВЕ): 89мМ Tris-борат, 89мМ борная кислота, рН 8.0. Буфер ТЕ: 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8.0. Буфер для нанесения ДНК на агарозный гель: 30% фикол, 0.25% бромфеноловый синий, 0.25% ксиленцианол, 30% глицерин. Раствор Денхардта (50х): 5г фикола, 5г BSA, 5г поливинилпирролидона, Н20 до 500 мл. 20х SSC: 3 М NaCl, 0.3 М цитрат натрия, рН 7.0. 20х SSPE: 3.6 М NaCl, 0.2 М Na2HP04, 0.02 М EDTA. Буфер TBS: ЮмМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.5. Буфер PBS: 20мМ NaH2P04/Na2HP04 и 150мМ NaCl, рН 8. Цитрат-фосфатный буфер: 0.5 М цитрат, 0.2М Na2HP04,pH 5. Натрий-боратный буфер: 50мМ Na2B407, 0.2М борная кислота, рН 8.5. Буфер для приготовления компетентных клеток: 50мМ СаС12, ЮмМ Tris-HCl, рН 8. Электродный буфер для SDS-PAAG электрофореза: 25мМ Tris, 250мМ глицин, 0.1% SDS, рН 8.3, dH20 до 1 л. Буфер для нанесения на SDS-PAAG электрофорез: 0.125М Tris-HCl, рН 6.8, 2% SDS, 20% глицерин, 0.02 бромфеноловый синий, 10% (3-меркаптоэтанол. Концентрирующий SDS-PAAG: 2.5 мл dH20, 500мкл 1М Tris-HCl (рН 6.8), бООмкл 30% PAAG, 40мкл 10% SDS, 40мкл 10% персульфата аммония, 4мкл TEMED. Разделяющий SDS-PAAG: 4.1 мл dH20, 7.5мл ЇМ Tris-HCl (pH 8.8), 8 мл 30% PAAG, 200мкл 10% SDS, 200мкл 10% персульфата аммония, 8мкл TEMED.
Буфер для электропереноса белков: 25мМ Tris, 250мМ глицин, 0.2% метанол. Раствор Ponceau S: 0.5% красителя,1% уксусная кислота. Все реактивы отечественного производства имели квалификацию не ниже «хч». В работе использовали также агарозу BioRad (USA); додецилсульфат натрия (SDS), акриламид, ІЧД -метиленбисакриламид Serva; Н,Ы,Ы М -тетраметилэтилендиамид (TEMED), (3-меркаптоэтанол, персульфат аммония, поливинилпирролидон, трис(гидроксиметил)аминометан (Tris) - Sigma; BSA, Fraction V - Pentax, 5 бромо-4хлоро-индолил(3-0-галактопиранозид (X-GAL) - BRL (Germany), изопропилтиогалактозид (IPTG) - Pharmacia (Sweden), цертилтриэтиламмонийбромид (СТАВ), этилендиаминтетраацетат (EDTA), бромистый этидий - Serva, Ni-NTA сефароза - Qiagene (USA); а также диэтилпирокарбонат, Tween, Triton X 100, ортофенилендиамин, имидазол, барназу (ИБХ РАН), антикроличьи иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена (ИМТЕК, Москва). Ферритин и антитела G10 к ферритину - ИОХ АН Белоруссии. Поликлональные антикроличьи антитела козы, коньюгированные с FITC (флуоресцеина изотиоцианат) (Abeam, England). Кроличьи поликлональные антитела к барстару были любезно предоставлены проф. Р. Хартли (Bethesda, USA).
Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена scFvFllbarstar под контролем двойного промотора 35SCaMV
На иммунологические плашки наносили антитела G10, специфичные к ферритину, в концентрации 0.02 мг/мл в 50 мМ Na-боратном (рН 8.5) буфере и инкубировали в течение ночи при 4С. После этого добавляли 1% BSA в аналогичном буфере и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Ферритин селезенки человека добавляли в концентрации 4 мкг/мл, инкубировали плашки в течение 1.5 часов. Плашки трижды промывали Na-боратным буфером, содержащим 0.1 % Tween. После этого добавляли ЮОмкл аффинно очищеного белка (или белкового экстракта из растений, полученного, как указано выше) в различных разведениях и инкубировали в течение 1.5 часов. Для обнаружения scFvFllbarstar использовали антитела к барстару и антикроличьи иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена. Инкубацию с каждыми антителами проводили в течение часа при комнатной температуре, после чего плашки промывали, как указано выше. Субстратная смесь для обнаружения пероксидазной активности на основе 0.02М фосфат-цитратного буфера (рН 5) содержала 0.04% ортофенилендиамина и 0.012% Н2О2. Учет результатов проводили на спектрофотометре при длине волны 492 нм.
Сегменты (5-6 мм ) листьев трансгенных и контрольных растений, культивировавшихся in vitro, фиксировали 4% раствором параформальдегида в TBS в течение 2 часов при комнатной температуре и далее при 4С.
Отмывку образцов от фиксатора проводили TBS в течение 1-2 часов при 4С. После этого образцы переносили в TBS, содержащем 0.4М сахарозы (Угрюмов, 1991). Насыщение тканей криопротектором проходило при 4С в течение 4 часов, после чего сегменты листьев замораживали при температуре -20 С. Поперечные срезы листовых пластинок (толщиной 15-20 мкм) были сделаны на криотоме (Криостат, Россия).
Готовые срезы промывали в буфере TBS и инкубировали в течение часа при комнатной температуре в буфере TBS, содержащем 2% BSA. Для иммуновизуализации срезы инкубировали в том же буфере с антителами к барстару (1:50) при 37С в течение полутора часов, после чего отмывали при комнатной температуре: TBS -5 мин. и TBS с 0.3% Tween и 0.2% BSA- трижды по 15 мин. После промывки препараты инкубировали с антикроличьими иммуноглобулинами, конъюгированными с флуоресцеином (1:100), после чего отмывали при комнатной температуре: TBS - 5 мин, TBS с 0.3% Tween и 0.2% BSA - трижды по 15 мин и TBS -15мин.
Препараты заключали в среду, содержащую 50% глицерина и 10% сахарозы в TBS, и закрывали покровными стеклами.
Подготовленные препараты исследовали на флуоресцентной микроскопической системе UnivaR (Austria) в диапазоне от 492 (поглощение) до 532 (эмиссия) нм. Фотографирование препаратов проводили фотопленки Fujgi Color Superia 200.
В качестве исходного материала для получения каллусных культур использовали трансгенные растения, экспрессирующие секреторный вариант генетической конструкции LPscFvFllbarstar. Для получения клеточных суспензий листья растений, культивировавшихся в условиях in vitro, переносили на чашки Петри со средой MS, содержащей 0.2 мг/л ВАР и 1.5 мг/л 2.4 D, 250 мг/л цефатоксима и 50мг/л канамицина. Полученные каллусы через 4-6 недель переносили в жидкую среду MS, того же гормонального состава. Для культивирования использовали колбы объемом 250 мл, объем питательной среды - 50 мл. В качестве инокулята брали суспензионные культуры в экспоненциальной фазе роста, что соответствовало 15-17 суткам. С помощью стерильной пипетки отбирали 5 мл инокулята (концентрация сухой биомассы инокулята составляла 15 г/л) и переносили в колбу с 50 мл среды. Клеточные культуры выращивали в темноте, на качалке (скорость вращения 98-100 об/мин, радиус вращения 18-20 минут) при 26С.
Для характеристики роста клеток использовали сухую и сырую массу клеток и жизнеспособность клеток.
Ростовые характеристики культуры определяли по изменению концентрации сухой биомассы, для чего клетки отделяли от жидкой среды на воронке Бюхнера под вакуумом, двухкратно промывали на фильтре дистиллированной водой и высушивали в бюксе до постоянного веса при 60С. Продуктивность оценивали как максимальную концентрацию сухой биомассы на литр культуры за период культивирования. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию клеток феносафранином (Widholm, 1972). По первичным данным рассчитывали удельную скорость роста в экспоненте и время удвоения биомассы.
Удельную скорость роста вычисляли по формуле i=ln(x0-x)/t0 (х -концентрация биомассы в момент времени t; х0 - начальная концентрация биомассы; t0 - начальный момент времени). Время удвоения биомассы рассчитывали по формуле: т=0.693/і.
