Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА І.Обзор литературы 10
1.1. Современные представления о патогенезе атеросклероза 10
1.2. Вирусная теория атеросклероза 14
1.3. Цитомегаловирус человека. 18
1.4. Особенности развития цитомегаловирусной инфекции в клеточных культурах 23
1.5. Латентная цитомегаловирусная инфекция 25
1.6. Особенности иммунного ответа на цитомегаловирусную инфекцию 27
ГЛАВА II. Материалы и методы 34
2.1. Расходные материалы и реактивы 34
2.2. Культура эндотелиальных клеток и фибробластов человека 34
2.3. Вирусологические исследования 37
2.4. Иммуноцитохимическое окрашивание 38
2.5. Стандартная трансмиссионная электронная микроскопия 39
2.6. ДНК гибридизация in situ 40
2.7. Совмещение гибридизации in situ с электронной микроскопией 41
2.8. Полимеразная цепная реакция и электрофорез ДНК 41
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 43
3.1. Идентификация инфицированных ЦМВ эндотелиальных клеток. Выбор источника ЭК человека 43
3.2. Цитопатологические изменения в эндотелиальных клетках при ЦМВ инфекции 44
3.3. Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в инфицированных эндотелиальных клетках 48
3.4. Закономерности экспрессии раннего антигена ЦМВ рр65 в инфицированных эндотелиальных клетках 52
3.5. Закономерности экспрессии позднего антигена ЦМВ gB в инфицированных эндотелиальных клетках 56
3.6. Особенности экспрессии вирусных антигенов в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом 56
3.7. Цитопатологические изменения в культуре фибробластов при ЦМВ инфекции 57
3.8. Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным штаммом 57
3.9. Закономерности экспрессии рр65 и gB в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным штаммом 59
3.10. Закономерности экспрессии вирусных антигенов в фибробластах, инфицированных фибробластотропным вирусным штаммом 60
3.11. Оценка уровня неспецифического связывания моноклональных антител 62
3.12. Особенности сборки вирусных частиц в клетках, инфицированных эндотелиотропным или фибробластотропным штаммами цитомегаловируса человека 62
Выводы 78
Список литературы 79
- Особенности развития цитомегаловирусной инфекции в клеточных культурах
- Культура эндотелиальных клеток и фибробластов человека
- Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в инфицированных эндотелиальных клетках
- Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным штаммом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитомегаловирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции, и лишь малой части людей удается избежать инфицирования. По данным эпидемиологических исследований подавляющее большинство взрослых людей инфицировано цитомегаловирусом (ЦМВ): до 80% в развитых и практически 100% в развивающихся странах [Griffiths, 1985]. В последнее время ЦМВ привлекает внимание исследователей не только как источник тяжелых осложнений у пациентов с ослабленным иммунитетом [De Bolle, 2005; Taylor, 2003; Badami, 2001]. Все больше данных свидетельствует о том, что цитомегаловирусная инфекция может являться наиболее вероятным участником патогенеза атеросклероза [Dockrell, 2003; Fong, 2002; Grahame-Clarke, 2005]. Имеются сведения, предполагающие взаимосвязь между ускоренным развитием атеросклероза при пересадке сердца и обострением цитомегаловирусной инфекции. Признаки обострения цитомегаловирусной инфекции были обнаружены у подавляющего большинства пациентов с вновь развившимся атеросклерозом коронарных артерий пересаженного сердца [Grattan, 1989, Loebe, 1990]. Кроме этого, повышение титра ЦМВ специфических антител, как правило, сопровождает развитие атеросклероза у человека: в эпидемиологических исследованиях была выявлена корреляция между степенью утолщения интимы, определенной с помощью ультразвукового исследования, и титром антител к ЦМВ у людей без клинических признаков атеросклероза [Sorlie, 1994]. Повторный стеноз коронарных артерий также чаще развивается у пациентов, имеющих в крови повышенный титр антител к ЦМВ [Blum, 1998]. Учитывая, что геном ЦМВ был найден в аорте, коронарных, бедренных и сонных артериях человека [Yamashiroya, 1988, Hendrix, 1989, Pampou, 2000], было предположено, что источник реактивации ЦМВ может находиться в стенке артерий [Grahame-Clarke, 2005; Speir, 1994].
Сосудистый эндотелий рассматривается как наиболее вероятный резервуар латентной цитомегаловирусной инфекции в организме человека [De Bolle, 2005; Pampou, 2000; Taylor, 2003]. Принято считать, что взаимодействие ЦМВ с эндотелиальными клетками (ЭК) играет важную роль в процессе генерализации инфекции, поскольку только для этого типа клеток твердо установлена способность, продуцировать вирус в организме [Percivalle, 1993].
Тем не менее, сведения о функционировании ЦМВ в ЭК ограничены. Сегодняшние представления о биологии ЦМВ базируются на исследованиях лабораторных штаммов, пассируемых на фибробластах. В то же время, известно, что пассирование вируса в фибробластах изменяет его свойства, в частности, такие штаммы теряют характерную для клинических изолятов способность инфицировать ЭК [Waldman, 1991]. Это может быть связано с изменениями в кодирующих областях генома ЦМВ [Sinzger, 1999] и в характере функционирования вирусных белков [Gerna, 2000, Revello, 2001]. Имеющиеся в литературе данные позволяют усомниться в том, что литический цикл ЦМВ регулируется совершенно одинаково в инфекционных системах, базирующихся на использовании различных клеточных типов.
Чтобы прояснить этот вопрос, было проведено сравнительное изучение закономерностей экспрессии вирусных антигенов в ЭК и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным (VHL/E) или фибробластотроптным (AD169) штаммами цитомегаловируса человека.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение процесса развития литической ЦМВ инфекции в эндотелиальных клетках и фибробластах человека с использованием эндотелиотропного штамма (VHL/E), сохраняющего клеточный тропизм клинического изолята.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Отработать методы оценки развития литической инфекции различных типов клеток человека, основанные на выявлении сверхранних, ранних и поздних антигенов ЦМВ.
-
Исследовать закономерности развертывания цитомегаловирусной инфекции в культуре эндотелия и фибробластов человека, инфицированных эндотелиотропным вирусом (штамм VHL/E) и выявить возможные отличия от фибробластотропных вариантов цитомегаловируса.
-
Провести сравнительное изучение закономерностей сборки вирусных частиц в эндотелиальных клетках и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным (VHL/E) или фибробластотропным (AD169) штаммами цитомегаловируса человека.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы были разработаны методические приемы, позволяющие охарактеризовать локализацию вирусной ДНК в инфицированных клетках, в частности, метод проведения ДНК гибридизации in situ на электронно-микроскопическом уровне. Предложенный методический прием позволил одновременно исследовать ультраструктуру клетки, оценивать стадии развития вирусной инфекции и процесс формирования и упаковки вирусных частиц. Впервые описан феномен нарушения созревания вирусных частиц эндотелиотропного варианта ЦМВ в цитоплазме инфицированных клеток. Впервые охарактеризованы особенности экспрессии сверхранних, ранних и поздних вирусных антигенов в ЭК и фибробластах, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом. Показано, что последовательность экспрессии сверхранних и ранних белков ЦМВ в ходе литической инфекции эндотелиальных клеток и фибробластов, инфицированных штаммом VHL/E, отличается от литической инфекции фибробластов, инфицированных штаммом AD169. Получены доказательства различий в молекулярных основах функционирования эндотелиотропного (VHL/E) и фибробластотропного (AD169) вариантов цитомегаловируса человека в различных типах клеток. Полученные данные впервые подтверждают изменение активности цитомегаловируса в результате длительного поддержания в лабораторных условиях на определенном типе клеток.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава (2006); 72-м конгрессе Европейской ассоциации по изучению атеросклероза (Глазго, май, 2001), 42-й ежегодной конференции Американского общества по клеточной биологии (Сан-Франциско, ноябрь, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 2 тезисных сообщения.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 109 страницах и включает 12 рисунков и список литературы, содержащий 165 ссылок.
Особенности развития цитомегаловирусной инфекции в клеточных культурах
Исследование закономерностей протекания цитомегаловируснои инфекции в клеточных культурах показало, что ЦМВ продуктивно инфицирует различные типы человеческих клеток, такие как фибробласты, гладкомышечные клетки, ЭК, клетки эпителия различных органов и клетки крови. Однако в клетках различных типов временные параметры инфекционного цикла существенно различаются. Наиболее хорошо изучены закономерности протекания цитомегаловируснои инфекции в фибробластах человека. В этих клетках синтез сверхранних белков начинается в течение 1 часа после инфицирования, синтез ранних белков - спустя 4-8 часов, а синтез поздних белков - через 24 ч [Albrecht et ah, 1980]. Репликация вирусной ДНК начинается с 12 часов после инфицирования. Продукция вирусного потомства достигает пикового значения к 72 - 96 ч после инфицирования [Albrecht et ah, 1980]. В этот период изменяется морфология инфицированной клетки, увеличиваются ее размеры («цитомегалия») и в ядрах появляются характерные включения в виде так называемых «совиных глаз», представляющих собой скопления вновь синтезированных вирусных частиц. Через 7-10 дней после инфицирования фибробласты погибают [Albrecht et ah, 1980].
Сегодня функционирование вирусного генома изучено во всех деталях на фибробластах, однако эти клетки инфицируются в организме человека только в случае развития острого процесса, например при подавлении иммунной системы, при трансплантациях. С другой стороны ЭК являются мишенью ЦМВ не только в ходе острого процесса, но и у бессимптомных носителей вируса [Pampou et al, 2000, Yamashiroya et al, 1988], что предполагает их важную роль в развитии ЦМВ инфекции. Однако, по сравнению с фибробластами, о закономерностях функционирования вирусного генома в этих клетках почти ничего не известно. Как уже отмечалось, клинические изоляты ЦМВ способны инфицировать клетки эндотелия, гладкомышечные клетки, клетки эпителия различных органов и клетіси крови. Во всех этих клетках синтез сверхранних белков и продукция вирусных частиц начинается значительно позже, чем в инфицированных фибробластах [Tumilowicz et al, 1985, Kapasi and Race, 1988, Soderberg et al, 1993., Fish et al, 1995]. Так, в инфицированных гладкомышечных клетках сверхранние белки появляются спустя 6 часов, а вирусные частицы - лишь через неделю после инфицирования. При этом на протяжении 3-4 месяцев после инфицирования в культуре сохраняются жизнеспособные клетки [Tumilowicz et al, 1985]. Эндотелиальные клетки экспрессируют сверхранние вирусные антигены только на следующий день после инфицирования при условии использования пассированного в культуре эндотелия штамма ЦМВ (VHL/E) [Waldman et al, 1989; 1991]. Но даже в этом случае продукция вируса в ЭК начинается лишь через неделю после инфицирования [Waldman et al, 1989; 1991]. В отличие от фибробластов, продуктивно инфицированные ЭК жизнеспособны в течение 1 месяца с момента инфицирования [Waldman et al, 1989; 1991]. Что касается клеток крови, то довольно долго считалось, что инфекционный процесс в этих клетках ограничивается экспрессией ранних вирусных генов [Einhorn and Ost, 1984; Rice et al, 1984; Kapasi and Rice, 1988]. Однако была описана продуктивная инфекция СШ4+ моноцитов человека [Soderberg et ah, 1993]. Установлено, что дифференцировка инфицированных in vitro моноцитов в макрофаги сопровождается активацией продукции вирусньк; частиц [Ibanez et al., 1991; Lathley and Spector, 1991]. В этой системе также наблюдается задержка экспрессии вирусных антигенов, и продукция вируса начинается лишь на 14 - 15 день после инфицирования [Fish et al., 1995]. Особенностью инфекционного процесса в макрофагах является то, что вновь синтезированные вирусные частицы в течение длительного времени остаются внутри клеточных вакуолей, в ассоциированном с клеткой состоянии [Ibanez et al., 1991; Fish et al., 1995]. Таким образом, исследование клеточных культур показало, что хотя клетки различной тканевой принадлежности являются пермиссивными для ЦМВ, существуют различия в механизме регуляции включения экспрессии сверхранних вирусных генов, а таюке в эффективности продукции вирусньк частиц. Факторы, обеспечивающие разнообразие временных параметров инфекционного цикла ЦМВ в человеческих клетках различных типов, остаются неизвестными.
Инфицирование человека ЦМВ происходит еще в детстве и сопровождается коротким периодом виремии, после чего вирусная инфекция переходит в латентное состояние. Принято считать, что в отсутствии симптомов ГДМВ инфекции у человека продукция вирусных частиц возможна только в клетках слюнных желез и в клетках эпителия почечных канальцев. Продукция вируса в этих клетках возобновляется периодически в течение жизни и обеспечивает непрерывный обмен вирусными штаммами между индивидуумами. Другие клетки в организме, инфицированном ЦМВ, как предполагается, хотя и содержат вирусный геном в своих хромосомах, но не продуцируют вирус. В настоящее время нет ясного представления о характере экспрессии вирусного генома в этих клетках, главным образом потому, что нет животных моделей для изучения ЦМВ человека. Сегодня отсутствует строгое определение латентного состояния ЦМВ инфекции. Часть исследователей придерживается мнения, что латентное состояние ЦМВ инфекции подразумевает возможность экспрессии, по крайней мере, сверхранних вирусных антигенов [Toorkey, Carrigan, 1989]. Другие считают, что латентное состояние ЦМВ инфекции подразумевает отсутствие экспрессии любых вирусных антигенов, в том числе и сверхранних [Mocarski, Stinski, 1979]. В настоящее время механизм поддержания латентного состояния цитомегаловирусной инфекции в организме совершенно неясен.
Характерной чертой ЦМВ является его способность к полной реактивации у больных с иммунодефицитными состояниями. В этих случаях происходит генерализация инфекции с поражением жизненно-важных органов, что часто приводит к летальному исходу. Клинические проявления острой генерализованной инфекции разнообразны: цитомегаловирусная пневмония [Beschorner et al, 1980], язвенные поражения желудочно-кишечного тракта [Foucar et al., 1981; Spencer et al., 1986], гепатит [Paya et al, 1989] и ретинит [Augsburger, Henry, 1978]. При гистологическом исследовании органов у таких больных обнаруживают многочисленные скопления инфицированных клеток, экспрессирующих весь спектр вирусных антигенов [Sinzger et al., 1995]. Среди инфицированных клеток находят гладкомышечные, эндотелиальные, эпителиальные клетки и фибробласты [Sinzger et al, 1993; 1995]. Такие клетки обнаруживают в большинстве внутренних органов [Sinzger et al, 1993; 1995]. Интересно, что подавляющее большинство инфицированных клеток сохраняет нормальную морфологию, цитомегалические клетки выявляются достаточно редко [Sinzger et al, 1995]. Тем не менее, при вирусологическом исследовании фрагментов ткани, как правило, обнаруживаются инфекционно-способные вирусные частицы [Swenson and Kaplan, 1987; Weber et al.t 1992].
Культура эндотелиальных клеток и фибробластов человека
Штамм AD169 (любезно предоставлен доктором E.S.Mocarski, США) пассировали и титровали на ФЛЭЧ, Инфекционный титр вируса определяли с помощью анализа бляшкообразования. Для этого, в 6-луночные планшеты засевали ФЛЭЧ и помещали в С02-инкубатор. По достижении конфлюэнтного монослоя, ростовую среду удаляли, клетки отмывали от сыворотки ФБД, после чего вносили по 1 мл среды без сыворотки, содержащей последовательные десятикратные разведения вируса в трех повторах. После инкубации в течение 1 часа при 37 С и 5% СОг из лунок удаляли инокулят, клетки дважды промывали ФБД и добавляли теплой пипеткой среду роста с агарозой (для этого смешивали двукратную среду роста с 1% раствором агарозы (Sea Кеш LE, FMC Corp) 1:1, предварительно нагретыми до 40-45 С). Затем, после образования геля, плашку помещали в СОг-инкубатор. Через 7 дней клетки фиксировали 10% нейтральным забуференным формалином в течение 1 часа и осторожно, не повреждая монослоя, удаляли агаровую пробку. Культуру высушивали на воздухе и окрашивали 0.1% водным раствором кристалл виолета в течение 30-60 секунд. После удаления красителя культуры отмывали водой и высушивали на воздухе. Далее производили подсчет бляшек в каждой лунке и рассчитывали титр вируса.
Эндотелиальные клетки и фибробласты инфицировали в суспензии. Клетки, растущие в конфлюэнтном монослое, снимали смесью трипсина-ЭДТА и отмывали от сыворотки ФБД. Вирус (штамм АД169 и VHL/E) добавляли к суспензии клеток и инкубировали в течение 1 часа при 37С на шейкере. Затем клетки высаживали на покрытые желатиной покровные стекла в 24 луночные культуральные планшеты. На следующий день производили замену культуральной среды и оставляли клетки в инкубаторе на 1-40 дней. Цитопатологические изменения оценивали в ходе прижизненного наблюдения и на препаратах, окрашенных карболовым фуксином. Неинфицированные ЭК и фибробласты были использованы в качестве контроля.
Для обнаружения вирусных антигенов в культивируемых клетках ЭК и ФЛЭЧ использовали иммуноцитохимическое окрашивание. Клетки, растущие на покровных стеклах, фиксировали 10 мин в холодном метаноле или в смеси 3.7% формальдегида и 1% Тритона X 100, приготовленной на стабилизирующем микротрубочки буфере (100 mM PIPES, 1 тМ MgCl2, 5 тМ ЭГТА, 33% глицерин, рН 6.8). Для снижения уровня неспецифического связывания антител препараты инкубировали в течение 30 мин в 0.4% растворе казеина на ФБД при 37С. Затем препараты инкубировали с одним из моноклональных антител против белков ЦМВ: антитела к главному сверхраннему белку р72 (разведение 1:100) , антитела к белку матрикса вирусных частиц рр65 (разведение 1:50), антитела к гликопротеину вирусной оболочки gB (разведение 1:50) в течение 30 мин при 37С. Моноклональные антитела визуализировали с помощью козьих антител к иммуноглобулинам мыши (разведение 1:400), конъюгированных с флуорохромом (ФИТЦ). Для визуализации клеточных ядер препараты докрашивали флуоресцентным красителем ДНК DAPI в концентрации 1 мг/мл на ФБД в течение 5 мин при комнатной температуре. Препараты заключали в мовиол, содержащий 0.1% феиилендиамин и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии (Оптон III). Для оценки уровня неспецифического связывания моноклональных антител, инфицированные клетки обрабатывали в качестве первых антител иммуноглобулинами мыши, полученными от неиммунизированиых животных. В качестве второго негативного контроля использовали неинфицированные клетки, обработанные моноклональными антителами к вирусным белкам. Клетки, растущие на покровных стеклах, фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом в 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2-7.4 в течение 40 минут при комнатной температуре, затем трижды отмывали ФБД (по 10 минут) при комнатной температуре. Культуры фиксировали 1% четырехокисью осмия в 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2-7.4 в течение 1 часа при 4С, после промывали фосфатным буфером. Затем препараты обезвоживали при проводке через этанол в возрастающей концентрации (50% этанол 5 минут при 4С, 70% этанол с 1% уранилацетатом ночь при 4С, 80% этанол 10 минут при 4С, 90 % этанол 10 минут при 4С, далее 100% этанол 3 смены по 20 минут при 4 С). Препараты помещали в абсолютный ацетон (3 смены по 20 минут), ацетон:эпон в соотношении 3:1 и 1:1 (по 30 минут при комнатной температуре) и 1:3 (ночь при комнатной температуре). На следующий день препараты помещали в чистый эпон на 1 час при комнатной температуре и затем лолимеризовали в свежей порции смолы по следующей схеме: 1 сутки при 37С, 2 суток при 60С. С помощью фазово-контрастного микроскопа выбирали клетки с внутриядерными включениями и готовили ультратонкие срезы. Все исследованные клетки были изучены на серийных ультратонких срезах, приготовленных на ультратоме LKB-5 с помощью алмазного ножа. После окрашивания уранилацетатом и цитратом свинца, срезы последовательно анализировали с помощью электронного микроскопа JEM-100CX.
Гибридизация in situ была проведена на культивируемых клетках с использованием коммерческого биотинилированного ДНК-зонда к последовательностям генома ЦМВ (Enzo Diagnostics). Клетки, растущие на покрытых полилизином покровных стеклах, фиксировали 0,25% глютаровым альдегидом, приготовленном на буфере PIPES (80 тМ PIPES-КОН, 1 mM MgCl2, 5 тМ EGTA, рН 6.8), в течение 10 мин при 37С, затем обрабатывали 10 мин при 37С 1% тритоном Х-100 в буфере PIPES, обезвоживали при проводке через этанол в возрастающей концентрации и высушивали на воздухе. После обработки РНК-азой А препараты вновь обезвоживали и высушивали на воздухе. Гибридизацию in situ проводили по методу, описанному Бригати и соавторами [Brigati et aL, 1983], с некоторыми модификациями. Гибридизационный раствор состоял из 50% деионизованного формамида, 10% декстран сульфата, 2xSSC (0.3 М NaCl, 0.03 М цитрат натрия, рН 7.0), 5-кратного раствора Денхардта (0.1% Фиколл 400, 0.1% поливинилпирролидон 40, 0.1% бычьего сывороточного альбумина V фракции), 400 мкг/мл ДНК спермы сельди и 1 мкг/мл зонда на ДНК ЦМВ. На каждый препарат наносили около 20 мкл гибридизационного раствора, затем нагревали до 95С в течение 10 минут в герметично закрытом контейнере для одновременной денатурации зонда и клеточной ДНК. По завершению ночной инкубации при 37С, образцы промывали дважды 50% формамидом в 2xSSC при 37С, по одному разу в lxSSC при 37С и при комнатной температуре.
Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в инфицированных эндотелиальных клетках
Характер окрашивания антителами к р72 клеток с внутриядерными включениями изменялся с течением времени после инфицирования (Рис 5, схема). В течение первой недели в этих клетках было окрашено только ядро; позднее появились клетки, в которых были окрашены цитоплазматические гранулы (Рис. 6Б и 6Б). Клетки с цитоплазматическим накоплением антигена и неокрашенными ядрами появлялись в популяции р72-позитивных клеток через 20 дней после инфицирования. Обычно, это были клетки с бобовидными ядрами с внутриядерными включениями (Рис 6В и 6В). Интересно, что многоядерные ЭК, все из которых содержали, по крайней мере, одно ядро с внутриядерными включениями, демонстрировали разный тип окрашивания в разные сроки после инфицирования. Через 15 дней после инфицирования антиген р72 выявлялся и в ядрах и в цитоплазме, а через 25 дней - только в цитоплазме (Рис. 6В и 6В). На ЗОдень после инфицирования такие ЭК составляли почти всю популяцию антиген-позитивных клеток.
Приведенные выше результаты были получены при формалиновой фиксации клеточных препаратов. Факт обнаружения клеток (одноядерных и многоядерных) поздних стадий с внутриядерными включениями, у которых была окрашена цитоплазма, но не ядро (Рис. 6В и 6В) показался интересным, поскольку не укладывался в существующую концепцию. Известно, что продукты гена ie l являются ДНК-связывающими белками и накапливаются в ядрах инфицированных клеток [Stenberg, 1996]. В отношении некоторых сверхранних белков, в том числе р72, известно, что они функционируют как факторы транскрипции, регулируя экспрессию более поздних вирусных генов [Stenberg, 1996], Продукты гена iel могут быть связаны с мембранными структурами в цитоплазме [Otto et al, 1988], однако на сегодняшний день отсутствуют сведения, подразумевающие возможность их отсутствия в клеточном ядре. В связи с этим, было решено повторить все эксперименты, используя альтернативный способ фиксации. Формалиновая фиксация была заменена на спиртовую (метанол).
В течение первых двух недель р72-позитиввые клетки с внутриядерными включениями или без них демонстрировали яркое окрашивание ядра, независимо от способа фиксации (формалин или метанол). Гомогенно окрашенные ядра были видны в клетках с мелкими округлыми ядрами без внутриядерных включений; в клетках поздних стадий (одноядерных и многоядерных, содержащих внутриядерные включения) антиген накапливался и в ядре и в цитоплазме. Цитоплазматическое окрашивание антителами к сверхраннему антигену ЦМВ р72 было и гранулярным и аморфным.
Следует особо отметить, что через 20 дней после инфицирования на препаратах, фиксированных метанолом, в большинстве клеток с внутриядерными включениями наблюдалось слабое окрашивание ядер антителами к р72 (Рис 6Г и 6 Г ). Митотические клетки, содержащие р72, выявлялись в инфицированных культурах ЭК крайне редко. Только в одном из экспериментов мы нашли одну антиген-позитивную прометафазную клетку, в которой р72 был ассоциирован с хромосомами.
Клетки, содержащие ранний вирусный антиген рр65, выявлялись в культурах ЭК только через 3 дня после инфицирования. Примечательно, что в течение первых 15 дней после инфицирования число рр65-позитивных клеток существенно превышало число р72-позитивных клеток (Рис. 5 и Рис. 7А, 7А ). В отличие от числа клеток, содержащих р72, которое непрерывно возрастало на протяжении всего периода наблюдения, число рр65-позитивных ЭК подвергалось подъемам и спадам (Рис 5). В серии повторяющихся экспериментов на протяжении 30-дневного наблюдения максимальное количество рр65-позитивных клеток обычно выявлялось между 4 и 15 днем после инфицирования. Число ррб5-позитивных клеток достигало как минимум 80% от общего числа клеток, по крайней мере, дважды на протяжении двухнедельного периода. В одном из экспериментов число рр65-позитивных клеток достигало почти 100% на 5 и 9 день после инфицирования (Рис 7 А, 7А ). В других экспериментах максимальное число антиген-позитивных клеток было найдено на 5 и 8 день, на 7 и 8 день или на 7 и 10 день после инфицирования. В эти дни рр65 накапливался в ядре клеток, лишенных внутриядерных включений (Рис 7, A,A ), а в клетках с внутриядерными включениями, как в ядре, так и в цитоплазме (Рис 7 ГХ )- Интересно, что в те дни, когда число иммунопозитивных для рр65 клеток достигало максимальных значений, не только интерфазные, но и митотические клетки оказывались положительно окрашенными на рр65. Были исследованы иммунопозитивные клетки всех четырех стадий митоза; во всех случаях вирусный антиген был ассоциирован с хромосомами (Рис 7, Б,Б ).
Следует отметить, что в те дни, когда число рр65-иммунопозитивных клеток достигало максимальных значений, даже при тщательном просмотре препаратов не было обнаружено ни одной негативной митотической клетки. Однако, ни одной ррб5-позитивной митотической клетки не было найдено в остальные дни на протяжении двухнедельного периода, когда число антиген-позитивных клеток варьировало в широких пределах. Рр65-позитивные клетки располагались обычно в виде скоплений, которые морфологически отличались от скоплений р72-позитивных клеток. Число клеток, составляющих рр65 -позитивный кластер, как и число таких кластеров, варьировало в очень широких пределах в процессе роста культур. Клетки, составляющие ррб 5-позитивный кластер, различались по интенсивности окрашивания: в каждом скоплении была видна ярко окрашенная центральная зона и слабо окрашенная периферическая зона (Рис. 7В, 7В и Рис. 6А, 6А ). В центре каждого ррб5-позитивного кластера располагались клетки с внутриядерными включениями (одноядерная или многоядерная), в которых кроме ядер были окрашены также цитоплазматические гранулы (Рис. 7В? 7В и 7Г, 7Г ). Вне фокусов ррб5-позитивных клеток изредка встречались одиночные позитивные клетки: это были клетки поздних стадий, в которых антиген присутствовал в цитоплазме, тогда как ядро было неокрашенным (Рис 7, Е,Е ).
Закономерности экспрессии сверхраннего антигена ЦМВ р72 в фибробластах, инфицированных эндотелиотропным штаммом
Как видно на рисунке 10, некоторое различие есть и в морфологии филаментов, ассоциированных с ядерными и цитоплазматическими капсидами: в отличие от филаментов в ядре, филаменты, контактирующие с капсидами в цитоплазме, имеют примерно одинаковую толщину по всей длине (сравните Рис. 10В-М и Рис. 10Н-Ц).
Интересно, что часть цитоплазматических капсид, контактирующих с филаментами, были окружены уплощенными мембранными везикулами (Рис. 10Т-10Ц). Относительное содержание капсид, окруженных мембранной везикулой, среди капсид, контактирующих с филаментами, варьировало в разных клетках в широких пределах. В некоторых клетках все контактирующие с филаментами капсиды располагались вплотную к аморфным скоплениям электронно-плотного материала (Рис. НА, 11Б). В этом случае лишь редкие капсиды контактировали с мембранной везикулой (Рис. ЮТ). В других клетках капсиды, контактирующие с филаментом, были многочисленны в перицентриолярном районе. Подавляющее большинство из них контактировало с мембранной везикулой (Рис. 10У -ЮЦ и 11В), при этом лишь единичные лишенные контакта с мембранами капсиды были найдены вокруг аморфных агрегатов электронно-плотного материала. Следует отметить, что как в ЭК, так и в фибробластах в цитоплазме также содержались стандартные зрелые покрытые мембраной инфекционные частицы (Рис. 10А).
Чтобы выяснить, формируются ли цитоплазм атические связанные с филаментами капсиды при низкой множественности инфицирования клеток фибробластотропным штаммом ЦМВ, была исследована ультраструктура 12 фибробластов с внутриядерными включениями через 20 дней после инфицирования штаммом AD169 (0.001 БОЕ/клетку). В отличие от VHL/E-инфицированных клеток, содержащих множество контактирующих с филаментами капсидов, в АБ169-инфицированных клетках мы нашли лишь единичные подобные образования (Рис. ИГ). В цитоплазме АШ69-инфицированных клеток зрелые покрытые оболочкой инфекционные частицы встречались очень часто, причем не только внутри клеток, но и во внеклеточном пространстве.
Чтобы выяснить, зависит ли образование капсидов, связанных с филаментом, от множественности инфицирования клеток, было проведено сравнение ультраструктуры фибробластов, инфицированных VHL/E или AD169 в концентрации 0,1 и 1 БОЕ/клетку, соответственно. Многочисленные капсиды, контактирующие с филаментом, были обнаружены в цитоплазме каждой клетки, исследованной в культуре фибробластов через 7 дней после инфицирования штаммом VHL/E (изучено 8 клеток). Однако контактирующие с филаментом капсиды не были найдены в цитоплазме фибробластов, продуцирующих вирус, через 7 дней после инфицирования штаммом AD169 (изучено 8 клеток).
Для ответа на вопрос, является ли филамент, с которым контактируют цитоплазматические капсиды, вирусной ДНК, было проведено дополнительное исследование: гибридизация in situ на электронно-микроскопическом уровне с использованием коммерческого ДНК-зонда к последовательностям генома ЦМВ. Работа была выполнена на ЭК через 25 дней после инфицирования штаммом VHL/E (0,01 БОЕ/клетку). Специфическое окрашивание было выявлено как в ядре, так и в цитоплазме клеток с внутриядерными включениями (Рис. 12А, 12Б, 12Д-12И). В ядре были окрашены вирусные капсиды и филаменты разнообразной конфигурации (Рис. 12А, 12Б). В большинстве инфекционных частиц, расположенных в цитоплазме, была окрашена сердцевина (Рис, 12Д, 12Е, 12И), причем окрашивались также филаменты, контактирующие с цитоплазматическими капсидами (Рис. 12Ж-12И). Только слабое фоновое контрастирование уранилацетатом было заметно в клетках, обработанных с исключением ДНК-зонда (Рис. 12В, 12Г). Таким образом, полученные результаты доказывают, что филаменты, с которыми контактируют капсиды, являются вирусной ДНК.
При анализе тех же серийных срезов, внимание было обращено на структуру центросом в разные сроки после инфицирования в клетках, инфицированных эндотелиотропным вирусным штаммом и продуцирующих вирус. Через 5 дней мы проследили организацию центросомы в двух клетках поздней стадии: одноядерной и многоядерной. В обеих были найдены центриоли в стандартной G1 конфигурации. В каждой из двух клеток, изученных через 25 дней после инфицирования, часть центриолей контактировала со структурами, напоминающими процентриоли, однако они располагались не на конце центриолярного цилиндра, а в его середине (Рис. 11 Д,Е). В одной из исследованных клеток фрагменты дублетов микротрубочек длиной не более 0.2 мкм были обнаружены вне связи с каким-то центриолярным цилиндром (Рис. 11, Ж).
