Иммунохимическое изучение бактериродопсина с помощью моноклональных антител Втюрина Ирина Юрьевна

Содержание к диссертации

стр,
ВВВДЕНИЕ 3

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5

1.1. Антигенная структура белков и способы

ее изучения 5

1.2. Моноклональные антитела как инструмент

для изучения антигенной структуры белков 19

1.3. Бактериородопсин - уникальная модель для
изучения антигенной структуры и топогра
фии мембранных белков 28

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 33

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50

3.1. Получение и характеристика моноклональ-

ных антител 51

1. Изучение антигенной структуры бактериородопсина с помощью моноклональных антител 66

2. Топография бактериородопсина в мембране, выявленная с помощью моноклональных антител 80

3.4. Заключительное обсуждение 88
ВЫВОДЫ 95
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 97

Введение к работе

Изучение антигенной структуры белков является одной из наиболее важных задач молекулярной иммунологии. Белки образуют основной класс антигенов, на которые отвечает иммунная система, поэтому знание структурной основы антигенности белков необходимо как для понимания защитных механизмов организма и способности различать свое-чужое, так и для создания искусственных иммунорегуляторов, моделирующих антигенную структуру полимеров, например синтетических вакцин. В последние годы, благодаря появлению техники гибридом, открылись новые возможности для структурного изучения антигенов. Это связано с тем, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, связываются со специфическим участком на поверхности белка (антигенной детершнантой) и могут быть использованы в качестве селективных зондов на определенные структурные участки. Тем не менее, круг белков, для которых проведено детальной изучение антигенной структуры, в настоящее время невелик. К числу наименее изученных в иммунохимическом плане объектов относятся мембранные белки.

Бактериородопсин - мембранный белок бактерии H.halobium - играет важную роль в энергетике этих организмов, являясь фотоиндуцируемым цротонным насосом. Благодаря установлению полной аминокислотной последовательности и принципов пространственной организации полипептидной цепи он является удобным объектом для изучения антигенной структуры мембранных белков. Установление топографии бактериородопсина в мембране является необходимым этапом на пути к выяснению механизма функционирования этого белка.

их антител. На рис. 4 представлен типичный профиль элвдии мо-ноклональных антител при аффинной хроматографии на белок А-сефарозе. Белок выходил с колонки одним пиком, и его выход составлял 65-75 мкг на I мл культуральной жидкости.

Гомогенность выделенных моноклональных антител проверялась с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. На рис. 5 представлены электро-»реграммы моноклональных антител ^ID2^GI» %%' ^А14-^Нз» h^Fj и IDgRj . Из рисунка видно, что антитела практически гомогенны и содержат лишь следовые количества примесных белков ( < 1%).

Для доказательства моноклональности антитела были подвергнуты анализу с помощью аналитического изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в тонком слое полиакриламидного геля. Известно [27], что молекулы антител обладают микрогетерогенностью вследствие посттрансляционных модификаций полипептидной цепи, главным образом благодаря присоединению нескольких (2-5) углеводных цепей с различным содержанием остатков N-анетилней-раминовой кислоты. В результате этого каждое антитело проявляется при ИЭФ в виде набора близко расположенных полос. В том случае, если препарат содержит несколько различных антител, на изоэлектрофореграмме будет присутствовать соответствующее количество наборов полос; поэтому о моноклональности антител можно судить по количеству наборов полос [7б].

На рис. 6 представлены результаты ИЭФ моноклональных антител. Каждое антитело имеет единственный набор полос, причем мажорные полосы в этих наборах уникальны для каждого антитела и равны 6,0; 5,8; 6,3; 4,85 и 5,3,для моноклональных антител ID₂G_It н₅Е₅, А₁₄н₃, н₅з?₅ и ю^ соответственно. Таким обра-

_ 4 -

Целью настоящей работы явилось получение моноклональных антител к бактериородопсину и изучение с их помощью антигенной структуры и топографии бактериородопсина в мембране.

В ходе работы были достигнуты следующие результаты: I. Получен набор гибридом, продуцирующих моноклональнне антитела к различным участкам полипептидной цепи бактериородопсина. 2. Обнаружено пять новых антигенных детерминант бактериородопсина и проведена их локализация. 3. Исследовано влияние модификаций ряда аминокислотных остатков на антигенные свойства молекулы бактериородопсина. 4. Выявлены существенные аминокислотные остатки, входящие в состав ряда антигенных детерминант. 5. Обнаружено, что участки полипептидной цепи 33-56, 156-163, 194-209, расположенные в местах сочленения 1и2, 5и6, 6и7 6-спиральных сегментов, экспонированы на поверхности мембраны. Эти данные уточняют картину пространственного расположения бактериородопсина в мембране, что необходимо для понимания механизма его функционирования.

Похожие диссертации на Иммунохимическое изучение бактериродопсина с помощью моноклональных антител

Изучение свойств и эпитопный анализ аутоантител с помощью синтетических и рекомбинантных фрагментов 1-адренорецепторов человекаРулева Наталья Юрьевна

Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек Туманова Ольга Юрьевна

Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислотПопова Анастасия Геннадьевна

Выявление противодифтерийных антибактериальных антител с помощью иммуноферментного анализа Макарова Светлана Игоревна

Изучение антигенных детерминант тиреоглобулина человека и животных с помощью моноклональных антителПиневич Агния Александровна

Изучение фолдинга и конформационных изменений продукта гена 9 бактериофага Т4 с помощью моноклональных антителЖемаева Любовь Вячеславовна

Выявление индивидуальных белков вируса гепатита С и определение частоты их встречаемости в клетках печени больных хроническим гепатитом С с помощью моноклональных антителАдбулмеджидова Анисат Газиевна

Исследование функций белков, ассоциированных с микротрубочками, с помощью специфических антителРодионов, Владимир Иванович

Изучение посттрансляционных модификаций и структурных доменов тубулина растений с помощью специфичных антителСмертенко, Андрей Петрович

Экспрессия маркерного антигена мелкоклеточного рака легких - ганглиозида FucGM1: иммуноморфологическое и иммунохимическое исследование с помощью моноклональных антител Зарайский Евгений Ильич