Введение к работе
Актуальность темы
Нейтрализующие антитела к поверхностным гликопротеинам gpl20 и gp41 являются основной частью защиты организма хозяина от ВИЧ-1, а их появление особенно важно для ограничения распространения внеклеточного вируса. В последние годы значительные успехи достигнуты в разработке вакцин, индуцирующих клеточный иммунный ответ, однако не получено вакцинных кандидатов, которые воспроизводимо стимулировали бы в организме образование антител, нейтрализующих первичные изоляты ВИЧ-1 различных субтипов (Amara et al, 2001; Monteflori and Evans, 1999; Parren et al, 1999). Моноклональные антитела 2F5 и 2G12 (Buchacher et al, 1994), нейтрализуют in vitro лабораторные штаммы и первичные изоляты ВИЧ-1, относящиеся к различным генетическим субтипам, и защищают макак от передачи SHTV (Parren et al., 2001). К настоящему времени пройдена первая стадия клинических испытаний терапевтической вакцины против ВИЧ-1, включающей эти МКА (Armbruster et al, 2002). Эпитопы, узнаваемые МКА 2F5 и 2G12, рассматриваются как важные компоненты разрабатываемых кандидатных полиэпитопных вакцин (Coeffier et al, 2001; Liao et al, 2000).
Эпитоп, узнаваемый МКА 2F5, впервые был определен методом картирования с использованием синтетических пептидов. Он включает в себя шесть а.о. (ELDKWA), расположенных недалеко от С-конца эктодомена белка gp41 (Muster et al, 1993a). Последовательность ELDKWA достаточно консервативна (хотя не абсолютно) среди ВИЧ-1 изолятов, относящихся к различным генетическим субтипам, что является важным аргументом при разработке вакцин (Muster et al, 1993а; Muster et al., 1994; Trkola et al, 1995). Моноклональное антитело 2G12 узнает уникальный эпитоп на поверхности гликопротеина gpl20, который непосредственно не относится к сайтам связывания рецепторов на этом белке (Moore and Но, 1993; Ugolini et al, 1997). Однако до настоящего времени эпитоп, узнаваемый МКА 2G12, не определен, показано только, что его структура зависит от конформации поверхностного гликопротеина gp 120 и от гликозилирования остатков аспарагина в С2-, СЗ-, С4-доменах и У4-петле.
Существует мнение, что иммуногены, экспонирующие эпитопы выше перечисленных МКА в виде имитаторов структуры нативных поверхностных гликопротеинов ВИЧ-1, вероятно будут индуцировать гуморальный иммунный ответ, мимикрирующий нейтрализующие свойства одного или нескольких моноклональных антител (Trkola et al, 1995; Coeffier et al, 2001). Поэтому изучение антигенной структуры
-имдтатррпп пгпгтппв», зтіпрпгшітт riff Л
белков gp41 и gpl20, а также получение ПЄПТИДОВ-
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ КИБЛИОТЕКА СП(
9» МвАЬет-
2F5 и 2G12, является важной фундаментальной задачей и имеет большое значение для разработки новых профилактических средств против ВИЧ-1.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было получение и исследование коллекции пептидов, специфично взаимодействующих с нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, узнающими эпитопы на поверхности гликопротеинов gp41 и gpl20. Для этого необходимо было решить следующие задачи:
- провести аффинную селекцию фаговой пептидной библиотеки с моноклональными антителами 2F5 и 2G12;
подтвердить специфичность взаимодействия пептидов, экспонируемых на поверхности отобранных в результате аффинной селекции бактериофагов, с изучаемыми МКА методом ИФА, и определить аминокислотные последовательности таких пептидов;
изучить иммуногенные свойства представленных в составе нитчатого бактериофага пептидов, взаимодействующих с МКА 2F5, и определить нейтрализующую активность антисывороток против пептидов-имитаторов эпитопа 2F5 in vitro; на основании состава отобранных по связыванию с МКА 2G12 пептидов, определить значимые для взаимодействия с МКА аминокислотные остатки, и предложить вариант локализации конформационного эпитопа, узнаваемого этим МКА, на поверхности гликопротеина gpl20 ВИЧ-1.
Научная новизна и практическая ценность работы
В данной работе проведено изучение эпитопов поверхностных гликопротеинов gpl20 и gp41 ВИЧ-1, узнаваемых МКА 2G12 и 2F5, с использованием комбинаторных фаговых библиотек. Применение метода аффинной селекции позволило отобрать из представительной пептидной фаговой библиотеки варианты пептидов, соответствующих антигенным детерминантам или имитирующих их по связыванию с изучаемыми антителами 2F5 и 2G12.
Получена коллекция пептидов, специфично взаимодействующих с МКА 2F5. Все отобранные пептиды отличаются в различной степени по аминокислотной последовательности от природного 2F5-3nHTona (A/ELDKWA/G/N), но сохраняют способность связываться с исследуемым антителом и являются имитаторами этого эпитопа. Впервые для иммунизации животных использовали нитчатые бактериофаги, в
составе минорного белка которых экспонированы пептиды-имитаторы 2F5-3nnrona
RDWSFDRWSLSEFWL, GRSFLDRWSKVPRDP, YFCYANCDKWVLKGD,
RNVPPIFNDVYWIAF. Показана вируснейтрализующая активность сывороток кроликов и мышей, иммунизированных вышеперечисленными бактериофагами, in vitro.
Рассмотрены возможные варианты состава эпитопа, узнаваемого МКА 2G12. На основании определенных аминокислотных последовательностей пептидов, взаимодействующих с МКА 2G12, впервые предсказаны а. о., являющиеся значимыми для распознавания МКА 2G12 эпитопа, расположенного на поверхности белка gpl20 ВИЧ-1 и, возможно, входящие в его состав. Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка gpl20 из изолятов и штаммов ВИЧ-1, чувствительных и устойчивых к нейтрализации МКА 2G12. Показано, что предсказанные нами а.о., являются достаточно консервативными у изолятов, нейтрализуемых этим антителом. Высказана гипотеза о том, что устойчивость к нейтрализации обусловлена конформационными изменениями в области эпитопа, связанными с вариабельностью а.о. Ser393, ТІІГ394, Тгрз95, ТЬг415 и Ргс>4>7 Отмечена значимость гликозилирования остатков аспарагина в положениях 295, 332 и 392 для формирования исследуемого эпитопа.
Полученные данные об иммуногенности пептидов-имитаторов 2Р5-эпитопа, экспонируемых на поверхности нитчатого бактериофага, и результаты локализации эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, в будущем могли бы быть полезны для создания вакцины против ВИЧ.
Апробация работы
Материалы исследований по теме диссертации представлены на следующих международных конференциях: X and XI Symposium on HIV Infection, 1999, 2001, Toulon, France; «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» 1999,2000, С.-Петербург, Россия; "Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics", dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine, September 25-27,2003, Kyiv, Ukraine.
Публикации
По материалам диссертации были опубликованы три печатные работы и оформлено два патента.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и
«Список литературы». Работа изложена на 148 станицах машинописного текста и включает 28 рисунков, 6 таблиц и список литературы, содержащий 219 ссылок.
